הדבקת נוירונים ראשוניים במוח התיכון של עכבר בנגיפים מהונדסים הקשורים לאדנו

התחל עם תרבית תאי מוח אמצעי של עכבר עוברי על כיסוי.

טפל בנגיפים מהונדסים הקשורים לאדנו, המקודדים קומפלקס אינדיקטור סידן פלואורסצנטי תחת מקדם ספציפי לנוירונים.

דגירה להתקשרות והפנמה ויראלית.

הסר את המדיום כדי לחסל נגיפים לא קשורים, ואז הוסף מדיום תרבית ודגירה.

נגיפים מופנמים משחררים את הגנום שלהם בגרעין, שם המקדם הספציפי לנוירונים מניע את הייצור של קומפלקסים של אינדיקטורים לסידן אך ורק בנוירונים ראשוניים.

קומפלקסים אלה כוללים חלבון פלואורסצנטי המתויג בחלבון קושר סידן ופפטיד M13.

העבר את הכיסוי לצלחת עם מאגר הקלטה עשיר ביוני סידן, ולאחר מכן הנח אותו בתא הקלטה להדמיה קונפוקלית חיה.

הכנס מאגר הקלטת גלוטמט, הגורם לגלוטמט להיקשר לתעלות יונים, מה שמוביל לכניסת יוני סידן.

יונים אלה נקשרים לקומפלקס, וגורמים לשינוי קונפורמציה ולפליטת פלואורסצנטיות.

בהדמיה חיה, הנוירונים הבהירים מצביעים על הזיהום הנגיפי.

התחל בהכנת 1 מיליליטר של מדיום DMEM ללא סרום עם 1 מיקרוליטר hSyn-GCaMP6f AAV למנה. שאפו את מדיום תרבית התאים מכל צלחת, והחליפו אותו במיליליטר אחד של ה-DMEM המוכן עם hSyn-GCaMP6f. מחזירים את הכלים לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר הדגירה, שאפו את המדיום עם AAVs, והחליפו אותו ב -3 מיליליטר של מדיום תרבית תאים. דגרו על הכלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמישה עד שבעה ימים, והחליפו את