יצירת מודל תלת-ממדי של תרבית משותפת של פיברובלסטים ונוירונים בקרנית האדם

קח פיברובלסטים של הקרנית האנושית.

העבירו אותם לתוספת קרום בתוך צלחת מרובת בארות המכילה מדיה.

הוסף מדיה לתוספת הממברנה. דגירה להיצמדות פיברובלסטים לתוספת.

לאחר מכן, החלף את המדיה במדיה המכילה ויטמין C בתוספת הממברנה ובמאגר.

דגירה. ויטמין C ממריץ את הפיברובלסטים להפריש ולהרכיב מטריצה חוץ-תאית תלת מימדית.

הוסף תרחיף תאי נוירובלסטומה אנושיים מעל הפיברובלסטים.

דגירה, המאפשרת הידבקות של תאי נוירובלסטומה.

כעת, הוסף מדיה המכילה חומצה רטינואית מעל התאים והשלם את המאגר במדיה טרייה.

דגירה. חומצה רטינואית מעוררת התמיינות של תאי נוירובלסטומה לתאי אב עצביים.

לאחר מכן, הסר את המדיה. הכניסו מדיה טרייה למאגר. הוסף מדיה המכילה גורם נוירוטרופי להכנסת הממברנה ודגירה.

גורמים נוירוטרופיים מעוררים התמיינות של תאי אב לנוירונים, ויוצרים מודל תלת-ממדי של תרבית משותפת של פיברובלסטים ונוירונים בקרנית האנושית.

כדי להרכיב מבנים תלת מימדיים, ראשית, יש לעבור ולספור פיברובלסטים אנושיים בקרנית. לאחר מכן, זרעו בערך 1 פעמים 10 עד 6 HCFs על קרום פוליקרבונט עם נקבוביות של 0.4 מיקרון. הוסף 1.5 מיליליטר מדיום טרי לחלק העליון של המבנה. לאחר מכן, פיפטה עוד 1.5 מיליליטר מאותה מדיה לתחתית כל מבנה.

לאחר 24 שעות, הוסיפו 1.5 מיליליטר של מדיום בתוספת 0.5 מילי-מולרי ויטמין C לחלק העליון והתחתון של כל מבנה. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך שלושה שבועות, והוספת חומר טרי המכיל ויטמין C כל יומיים. זה ימריץ את התאים להפריש ולהרכיב מטריצה חוץ-תאית משלהם. לאחר שלושה שבועות, הוסף 8 כפול 10 ל-3 תאי נוירובלסטומה אנושיים SH-SY5Y על גבי המבנים התלת-ממדיים שהורכבו קודם לכן.

זה קריטי לחשב את מספר התא המדויק בשלב זה ולאפשר 24 שעות לפני תחילת התמיינות התאים.

לאחר 24 שעות של דגירה, התחל התמיינות תאי SH-SY5Y על ידי גירוי התאים עם 1.5 מיליליטר EMEM עם 10% FBS ו-10 חומצה רטינואית מיקרו-מולרית לאחר מכן, הוסף 1.5 מיליליטר מהמדיום המכיל ויטמין C לתחתית המבנה. חומצה רטינואית רגישה לאור ולכן יש לבצע שלב זה בחושך.

לאחר חמישה ימים, כאשר התאים הגיעו לשלב ההתמיינות, הוסיפו 1.5 מיליליטר של מדיום נטול סרום המכיל 2 BDNF ננו-מולרי ו-1% אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית לחלק העליון של המבנה. הוסף מדיום טרי בתוספת ויטמין C לתחתית המבנה. תרבית התאים במשך יומיים נוספים לפני העיבוד להמשך ניתוח.