JoVE Encyclopedia of Experiments
מדעי המוח
0 צפיות • 2:57 דק' • July 8th, 2025
קח תאי גנגליון רשתית של דג זברה שגודלו על כיסויים מצופים.
תאים אלה מבטאים חיישן ביולוגי מקודד גנטית המייצר את החלבון הפלואורסצנטי הירוק הרגיש לחמצון חיזור roGFP2 המותך לאנזים רגיש למי חמצן, Orp1.
העבירו את הכיסוי עם המדיה לתא הדמיה של תאים חיים והניחו את החדר על מיקרוסקופ הפוך.
החלף את המדיה במדיה נטולת סרום כדי להפחית את הקרינה ברקע.
בשל רמות מי חמצן נמוכות, roGFP2 נשאר בקונפורמציה המופחתת שלו.
עורר את החיישן הביולוגי ברצף באורכי גל של 405 ו-480 ננומטר.
roGFP2 מופחת מציג שיא עירור ב-480 ננומטר.
עבור למדיה המכילה מי חמצן.
מי חמצן נכנס לתאים ומגיב עם Orp1, ומחמצן את roGFP2.
עורר שוב את החיישן הביולוגי.
roGFP2 מחומצן מציג עלייה פלואורסצנטית ב-405 ננומטר וירידה ב-480 ננומטר.
חשב את יחס עוצמת הקרינה.
עלייה ביחס מעידה על עלייה ברמות מי החמצן בתאים.
ביום ההדמיה, בדוק תאים תחת המיקרוסקופ כדי לאמת את הצמיחה של אקסוני RGC. להדמיית תאים חיים, העבירו את הכיסויים מצלחת התרבית לתא הדמיה של תאים חיים. השתמש במיקרוסקופ הפוך המצויד במטרת DIC, מסנן אדום מעבר ארוך OG590 ומצלמת EM-CCD.
לפני ההדמיה, החלף את מדיום ZFCM+ ב-ZFCM-. לאחר מיקום התאים עם המטרה פי 10, רכוש תמונות בהגדלה של פי 60 באמצעות מטרת טבילה בשמן. השתמש בהגדלה נוספת של פי 1.5.
ראשית, רכוש תמונות DIC, ולאחר מכן דמיין roGFP2-Orp1 באמצעות ערכת מסננים מתאימה. לאחר צילום סט התמונות הראשון, החלף מדיה עם מדיה המכילה פתרונות טיפול שונים. יש להחליף את המדיה כל 30 דקות של הדמיה כדי למנוע שינויים ב-pH ובאוסמולריות.