יצירת תצורה של תאים שלמים להדמיית סידן דו-פוטון של פרוסות מוח

קח פיפטה לגירוי המכילה פלואורופורים אדומים שאינם רגישים לסידן בנוזל מוחי מלאכותי, או ACSF.

מקם את הפיפטה ליד נוירון המטרה בפרוסת היפוקמפוס.

הנח פיפטת תיקון עם אלקטרודת הקלטה שטופה באלקטרוליט המכיל פלואורופורים אדומים שאינם רגישים לסידן ומחוון סידן ירוק ליד המטרה.

הפעל לחץ חיובי קבוע כדי להפריע לזמן קצר למשטח הרקמה, מה שמעיד על קרבה למטרה.

כאשר הגומה נוצרת על הממברנה העצבית, שחרר את הלחץ ליצירת חותם.

הפעל לחץ שלילי כדי להדק את האיטום.

ייצב את פוטנציאל הממברנה במתח שלילי קבוע.

המשיכו בלחץ שלילי כדי לשבור את הממברנה, מה שמאפשר לאלקטרוליטים המכילים פלואורופור להתפשט בתוך הנוירון.

דמיין את הקרינה האדומה של עמוד השדרה הדנדריטי המטרה ויישר את פיפטת הגירוי בקרבתו.

הפעל פולסים חשמליים כדי לפתוח את תעלות הסידן.

השתמש במיקרוסקופ דו-פוטוני כדי לדמיין שינויים חולפים ברמות הסידן כפי שמצוין על ידי פלואורסצנציה ירוקה.

בשלב זה, העבירו פרוסת היפוקמפוס לאמבטיה תחת המטרה של מיקרוסקופ דו-פוטוני הסורק בלייזר. יש להחדיר את האמבטיה ברציפות עם ACSF מחומצן רגיל. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות אינפרא אדום כדי לאתר תא מעניין באמצעות גודלו, צורתו ומיקומו.

לאחר מכן, מלאו פיפטה מגרה בתמיסה רגילה ACSF המכילה את הפלואורופור האדום. הורד אותו על גבי הפרוסה כך שהקצה יהיה באותו אזור כמו התא המבוקש. לאחר מכן, מלאו את פיפטת התיקון בתמיסת תיקון, והצמידו אותה לשלב הראש. הנח אותו מעל הפרוסה כך שהקצה שלו יהיה ישירות מעל התא המבוקש.

לאחר מכן, הכנס מזרק לתא העצירה התלת-כיווני וחבר אותו לפיפטה התיקון דרך צינור פלסטיק. הזרקו לחץ חיובי קבוע לתוך פיפטת התיקון ושמרו על תא העצירה במצב סגור. הורד את פיפטת התיקון עד שהיא נמצאת ממש על גבי התא הממוקד. עם יצירת מגע עם קרום התא, הסר את הלחץ על ידי סיבוב תא העצירה למצב פתוח.

לאחר מכן, הפעל לחץ שלילי קל על פיפטת התיקון באמצעות מזרק ריק המותקן בתא העצירה עד שהתנגדות הפיפטה מגיעה ל-1 ג'יגה אוהם. בחלון בדיקת הממברנה של תוכנת רכישת הנתונים, מהדק את התא ב-60 מילי-וולט שלילי. המשך להפעיל לחץ שלילי עד שהתנגדות הפיפטה יורדת וכל תצורת התא מושגת.

כדי לתעד מעברי סידן דנדריטיים המושרים על ידי גירוי חשמלי, אתר דנדריט מעניין באמצעות האות הפלואורסצנטי האדום. הניחו את הפיפטה המגרה על פני הפרוסה מעל הדנדריט המעניין. הורד לאט את פיפטת הגירוי 10 עד 15 מיקרומטר מהדנדריט ומזער את התנועה כדי למנוע הפרעה לתצורת התא השלם.