רישומים אלקטרופיזיולוגיים להערכת התחדשות עצבית בפרוסות חוט שדרה בתרבית משותפת

קחו מערך מרובה אלקטרודות מצופה פולימר או MEA, עם פרוסות חוט שדרה עובריות בתרבית משותפת הממוקמות בשני אזורים נפרדים, מה שמאפשר הקלטה בו זמנית משתי הפרוסות.

הפרוסה מציגה קשרים עצביים מחודשים באזור הנגוע בעבר.

הנח את ה-MEA בתא הקלטה המכיל תמיסה חוץ-תאית עשירה ביונים וחומרים מזינים לשמירה על הישרדות עצבית.

אפשר למערכת להתייצב, מה שמקל על הסתגלות ותקשורת של נוירונים.

נוירונים מתקשרים באמצעות אותות חשמליים הנקראים פוטנציאל פעולה, אשר נרשמים על ידי האלקטרודות הסמוכות ב-MEA.

אותות בודדים מכל אלקטרודה משולבים, ומייצרים אות חשמלי מכל פרוסה.

החלף באופן קבוע את התמיסה החוץ-תאית כדי לשמור על יציבות הנוירונים.

הוסף תמיסה חוץ-תאית עם מעכבים החוסמים קולטני נוירוטרנסמיטורים מעכבים על ממברנות עצביות, ושומרים על נוירונים פעילים למשך זמן ארוך יותר.

השווה את הפעילות החשמלית משתי הפרוסות. אות חשמלי מסונכרן בין שתי הפרוסות מאשר את הקשרים הסינפטיים ואת ההתחדשות העצבית המוצלחת.

שים צלחת פטרי עם מערך מיקרואלקטרודות מצופה בפנים מתחת לסטריאומיקרוסקופ. הבא את המערך למיקוד, ומרכז טיפה של שישה מיקרוליטר של פלזמת עוף על מערך האלקטרודות. בעזרת מרית קטנה, החלק בזהירות שני קטעי חוט שדרה כשצידי הגחון שלהם פונים זה לזה לתוך טיפת הפלזמה.

לאחר מכן, הוסיפו שמונה מיקרוליטר תרומבין סביב טיפת הפלזמה של העוף. לאחר מכן, השתמש בקצה הפיפטה כדי לערבב בזהירות ולמרוח את תערובת פלזמת העוף והתרומבין. רגע לפני שתערובת פלזמת העוף והתרומבין הופכת לחוטית מדי ומתחילה להיקרש, שאפו את עודפי הנוזלים. לאחר מכן, מכסים את צלחת הפטרי ומניחים אותה בתא לח.

הנח את החדר בתוך חממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כשעה. לאחר הדגירה, הוסף בזהירות 10 מיקרוליטר של מדיום תזונתי לדגימה. מכסים את צלחת הפטרי ומכניסים אותה בחזרה לחממה למשך 45 דקות נוספות. לאחר מכן, הנח כל אחד ממכלולי תרבית מערך האלקטרודות מרובות האלקטרודות לתוך צינור רולר והוסף שלושה מיליליטר של מדיום תזונתי. סגור את המכסה בחוזקה והנח את צינור הגליל לתוך תוף הגליל. סובב את התוף ב -1 עד 2 סל"ד בחממה ב -37 מעלות צלזיוס.

בעזרת מלקחיים סטריליים עם קצה גומי, הסר את מכלולי תרבית מערך האלקטרודות מרובות מצינור הגליל והנח אותם בצלחת פטרי תחת סטריאומיקרוסקופ. הבא את הרקמה למיקוד וודא ששתי הפרוסות התמזגו. לאחר מכן, החזק את המכלול יציב והנח להב אזמל בחריץ של מערך האלקטרודות קרוב לפרוסות הרקמה. החזק את האזמל בצורה אופקית למדי ואז הרם את ידית האזמל כלפי מעלה, אך תן ללהב האזמל להישאר בחריץ המערך בצורה כזו שהלהב מתגלגל מבסיס לקצה, חותך את הרקמה ומכסה את החריץ.

נתק את כל חיבורי הרקמה הנותרים עם קצה מחט בגודל 25 במידת הצורך. עבדו רק באזור שבתוך החריץ, ואל תיגעו בקצוות הרכים. החזר את מכלולי תרבית מערך האלקטרודות בחזרה לצינור הגליל והוסף שלושה מיליליטר של מדיום תזונתי טרי לתרביות. לאחר מכן, הנח את צינור הגלילה בחזרה על תוף הגלילה בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

הרכיב מכלול תרבית מערך מרובה אלקטרודות לתוך תא הקלטה והחל כ-500 מיקרוליטר של תמיסה חוץ-תאית על המערך. לאחר מכן, הרכיב את המכלול על המיקרוסקופ. המתן 10 דקות עד שהמערכת תתייצב, ולאחר מכן, רשום פעילות ספונטנית בסיסית מכל אחת מהאלקטרודות המזהות פעילות למשך 10 דקות. חזור על ההקלטות בסך הכל פעמיים.

כדי להבטיח תנאים חוץ-תאיים יציבים, החלף את הפתרון החוץ-תאי לאחר כל סשן הקלטה. אם תרצה, נטרל את עיכוב הרשת על ידי מריחת תמיסה חוץ-תאית המכילה מיקרוטולר אחד של סטריכנין ו-10 מיקרומולר של גבזין והמתן לפחות שתי דקות לפני רישום הפעילות החשמלית.