אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מדעי המוח
0 צפיות • 3:01 דק׳ • July 8th, 2025
קח תולעים טרנסגניות Caenorhabditis elegans הגדלות על גוש אגר.
תולעים אלה מבטאות אינדיקטור סידן, GCaMP5, וחלבון פלואורסצנטי שאינו רגיש לסידן, mCherry, בתאי עצב המווסתים את התנהגות הטלת הביצים.
הרכיבו את התולעים על במת מיקרוסקופ הפוכה.
דמיין את GCaMP5 ו-mCherry fluorescence.
לפני שחרור הביציות, הנוירונים מופעלים, ופותחים תעלות סידן מגודרות מתח, המאפשרות זרימת סידן.
סידן תוך-תאי נקשר ל-GCaMP5, משנה את הקונפורמציה שלו ומגביר את הקרינה.
בינתיים, הקרינה של mCherry נשארת ללא שינוי, ומאפשרת מעקב אחר הנוירון.
הנוירונים המופעלים משחררים נוירוטרנסמיטורים הנקשרים לקולטני שרירים ספציפיים, ומעוררים שחרור ביציות.
לאחר השחרור, תעלות הסידן נסגרות, ומפחיתות את זרם הסידן ואת הקרינה GCaMP5.
לאחר מכן, צלם תמונות שדה בהיר כדי לצפות בתנועת תולעת.
תנועה מופחתת מתרחשת עקב התכווצויות שרירים לפני שחרור הביצית.
לאחר שחרור הביציות, השרירים נרגעים, ומחזירים את התנועה התקינה.
מדוד את יחס הקרינה GCaMP5-mCherry ואת מהירות התולעת כדי לזהות אירועי שחרור ביציות.
להדמיית סידן רציומטרית, תחת הכרטיסיה רצף, לחץ על התחל כדי להתחיל בהקלטה, ועקוב אחר התולעת באמצעות הג'ויסטיק, תוך שמירה על התאים והסינפסות המעניינים במרכז שדה הראייה. ברגע שההקלטה הקרינה מתחילה, טריגרים נשלחים למצלמת השדה הבהיר הממתינה ולבקר הבמה, שמתחילים לאסוף תמונות מסונכרנות ומיקום הבמה.
לחצו על הלחצן 'סטטיסטיקה' בחלון ההיסטוגרמה, כדי להציג נתונים סטטיסטיים של פיקסלים לכל ערוץ. כוונן את עוצמת ה-LED כדי להבטיח פלואורסצנטיות mCherry מקסימלית של פיקסל יחיד בקצה הפרה-סינפטי של גדול או שווה ל-8,000 ספירות בערוץ האדום, מה שנותן טווח דינמי של כ-12 סיביות מעל הרקע. אותות דיווח הסידן בקצה הפרה-סינפטי במהלך מנוחה, או סידן נמוך, צריכים להיות בסביבות 2,500 ספירות בערוץ הירוק.
רשום את ההתנהגות עד שמגיעים למצב פעיל אחד של הטלת ביצים. לאחר מכן, שמור תת-קבוצה של 10 דקות המכילה 6,000 פריימים לפני ו-6,001 פריימים אחרי אירוע הטלת הביצה הראשון. הקפד לשמור על אותה תת-קבוצה של תמונות שדה בהיר של התנהגות תולעת ונקודות זמן של מיקום שלב x,y או שהסנכרון המדויק של זרמי הנתונים יאבד.