חקר ההתרגשות של תאי עצב פלואורסצנטיים באמצעות מהדק טלאי של תא שלם

קח פרוסת עטרה של עכבר משותק בתא הקלטה עם aCSF.

הפרוסה מכילה אוכלוסיית נוירונים פירמידלית דלילה המבטאת אנזים מטרה וחלבון פלואורסצנטי.

הרכיבו פיפטת הקלטה הכוללת תמיסה תוך-תאית ואלקטרודה המחוברת למגבר למדידת אותות עצביים.

לזהות מיקרוסקופית את אזור רקמת המטרה ולאתר נוירון פלואורסצנטי.

הפעל לחץ חיובי על הפיפטה כדי למנוע סתימה ולקדם אותה לנוירון המטרה.

הלחץ החיובי גורם לשקע קל על הממברנה העצבית במגע.

שחרר את הלחץ ויוצר אטימה הדוקה בין הממברנה לקצה.

הגדר את פוטנציאל ההחזקה בערך שלילי קבוע כדי לייצב את הנוירון.

הפעל לחץ שלילי קצר כדי לקרוע את הממברנה, לחבר את הציטופלזמה לפנים הפיפטה וליצור תצורת תא שלם.

עבור למצב מהדק זרם והפעל פולסים חיוביים של זרם, ויוצר פוטנציאל פעולה המעיד על ריגוש עצבי.

העבירו פרוסה לתא ההקלטה בעזרת פיפטה של פסטר או מברשת קטנה. החזק את הפרוסה עם נבל, והחדיר אותה עם ACSF בקצב של 2 מיליליטר לדקה. כדי לתקן נוירון חיובי ל-GFP, אתר את אזור העניין דרך המיקרוסקופ ב-10x. לאחר מכן, מצא תא חיובי ל-GFP באמצעות המטרה 60x.

לאחר מכן, מלאו את אלקטרודת ההקלטה בתמיסה תוך תאית. לאחר מכן, הניחו פיפטה מזכוכית במחזיק הפיפטה. לאחר מכן, הניחו את קצה הפיפטה באמבטיה והתמקדו בקצה. לאחר שהפיפטה נמצאת באמבטיה, הפעל לחץ חיובי דרך מערכת בקרת הלחץ האחורי.

התקרב לתא המעניין תחת הנחיה חזותית תוך שמירה על לחץ אחורי בפיפטה. עם הופעת גומה קטנה על פני התא, שחרר את הלחץ. בשלב זה עלול להיווצר איטום הדוק עם התנגדות גדולה מ-1 ג'יגה-אוהם. אחרת, הפעל לחץ שלילי קל כדי להקל עליו.

בזמן יצירת החותם, הביאו את מהדק מתח האחיזה ל-60 מילי-וולט שלילי. לאחר שנוצר אטם הג'יגה-אום, הפעל דופק יניקה כדי לקרוע את קרום התא ולפרוץ למצב התא כולו. ברגע שהוא נמצא במצב תא שלם, עבור ממצב מהדק מתח למצב מהדק זרם והתחל להקליט.