התכווצות העורקים mesenteric ללימודי הרפיה באמצעות Myography בנקאית אוטומטית
22 בספטמבר 2011
שיטה myography אוטומטית עבור מדידות כוח בעורקים mesenteric מבודד מתואר. היא מעסיקה Mulvany-Wire הלפרן כפול אוטומטי Myograph 510A לקבוע התגובות phenylephrine וסידן תאיים. השיטה מאפשרת קביעת עקבית של תגובות איזומטרי כדי אגוניסטים בכלי קטן של קטרים של 6-30 מיקרומטר, באופן עצמאי.
הליך זה משתמש בחולדות רגישות למלח בובות ועמידות למלח כדי להשוות את התגובתיות של עורקי עמידות מזנטרית במתח פנילפרין לסידן חוץ-תאי. זה מושג על ידי בידוד הארקייד המזנטרי מבעלי חיים וניתוח ענפי עורק ההתנגדות. הבא. הראשון מבין שני חוטי נירוסטה מושחל דרך קטע קצר של העורק המנותח והכלי מותקן בתא הגרף.
ואז חוט הנירוסטה השני מושחל דרך לומן הכלי במקביל לחוט הראשון. לאחר מכן, הכלי המותקן נמתח להיקף פנימי מנורמל. השלב האחרון של ההליך הוא הפעלה מחדש של כלי הדם על ידי אתגר אותו עם מריחות חוזרות ונשנות של פנילפרין והרפיה עם יישומים מצטברים של סידן.
בסופו של דבר, התוצאות מראות שינויים במתח בכלי, שניתן להמיר לעקומת תגובת סידן ולהשתמש בהם לקביעת ערכי EC 50. לשם השוואה. הרעיון לשימוש בשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר גילינו שרשת nev של סוללות בנייה של חולדות מבטאת קולטן חוש סידן נחושת gpro.
ניתן לחקור זאת באותו אופן כמו קולטני AIC מרים, המופעלים על ידי אגוניסטים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון ששכבות האנדותל והשרירים החלקים קטנים. כלי שיט ניזוקים בקלות.
אם זה קורה, התכונות המכניות של כלים אלה עלולות להיפגע. כדי להתחיל, הכינו את אזור העבודה ומכשירי הניתוח. הניחו חיה מורדמת על גבה ונגבו את הבטן באלכוהול.
לאחר ביצוע לפרוטומיה בקו האמצע, השתמש במספריים כדי להסיר כ- 85 סנטימטרים של המעי, כולל העורק המזנטרי העליון. חותכים את הקצה הפרוקסימלי קרוב לפילורי ואת הקצה הדיסטלי ליד הצומת האילאו-צקלי. מניחים את החלק הכרות בצלחת פטרי מצופה המכילה תמיסת מלח פיזיולוגית או PSS בטמפרטורת החדר.
הצמד את הקצה הפרוקסימלי של המעי ימינה ולאחר מכן הצמד את שארית המעי נגד כיוון השעון. לאחר מכן, נתחו קטע של העורק המזנטרי המכיל ענף שתיים ושלוש וחתיכה מהמעי מהקצה הפרוקסימלי. זהה את נקודת הענף בצורת V של העורק המזנטרי ונתח אותה הרחק מהווריד.
השתמש במלקחיים כדי למשוך בעדינות את רקמת השומן והחיבור כדי למנוע מגע ישיר עם העורק. כדי להתחיל בהרכבת הכלי, חתכו שני קטעי עורק באורך של כשני מילימטרים. ניתן להשתמש בקצה של חוט נירוסטה נטול טונגסטן של ארבעה סנטימטר 40 מיקרומטר לפתיחת לומן העורק.
לאחר מכן השתמש במלקחיים עדינים כדי להכניס את החוט ללומן של כל עורק. הקפד לא לפגוע באנדותל, מלא את תא השתל של מיו ב-PSS ב-37 מעלות צלזיוס. השתמש במלקחיים כדי להעביר את קטע כלי הברגה לתוך החדר.
לאחר מכן, העבירו את קטע הכלי הפרוקסימלי שנכרת לתא גרף ה-myo ומשכו את הקצה לאורך החוט כדי להזין אותו לתוך הכלי. הימנע ממתיחת הכלי. אבטח את הקצה הקרוב של החוט נגד כיוון השעון מתחת לבורג הקיבוע הקרוב בלסת הימנית המחוברת למיקרומטר.
תפוס את הקצה החופשי של החוט בעזרת מלקחיים ואבטח אותו בכיוון השעון מתחת לבורג הקיבוע הרחוק בלסת יד ימין, וודא שקטע הכלי לאורך החוט ממוקם ברווח בין הלסתות מבלי ליצור כל מגע עם הלסת עצמה. הברג את הלסתות. יישר את החוט השני במקביל לכלי והכנס אותו לקצה הרחוק של הלומן.
הזינו בעדינות את החוט דרך לומן קטע הכלי בתנועה אחת באמצעות החוט שכבר הותקן כמדריך. החזק את החוט כסנטימטר אחד מהכלי כדי להימנע ממתיחתו במהלך התמרון והימנע מלגעת באנדותל. הברג את הלסתות יחד וודא שחוט ההרכבה השני נע מתחת לראשון המאובטח ביד ימין.
הלסת אבטח את הקצה הקרוב של החוט השני בכיוון השעון מתחת לבורג הקיבוע הקרוב של לסת יד שמאל המחוברת למתמר. אבטח את הקצה הרחוק של החוט מתחת לבורג הקיבוע בלסת יד שמאל והדק כדי למתוח את החוט. לאחר השלמת ההרכבה, אפשר 30 דקות לשיווי משקל ב-37 מעלות צלזיוס.
לאחר שיווי המשקל, המנוע מאופס מתפריט ההרכבה ומתחיל הליך הנורמליזציה, המותח את הכלי להיקף פנימי מנורמל. כדי להתחיל, פתח את תפריט הנורמליזציה והגדר את לחץ היעד הטרנסמורלי ל-13.3 קילופסקל. לאחר מכן, הגדר את משך הזמן של כל אחד משלבי הנורמליזציה ל-60 שניות.
יחס ה-IC אחד ל-IC 100 צריך להיות שווה ל-0.9 וכיול ה-IP צריך להיות מוגדר לדלתא של שני כוכבים. מדוד את אורך העורק המזנטרי המותקן באמצעות קריאות עינית המיקרוסקופ כאשר קווי השיער נמצאים מעל הרחוק והנוירונים של מקטע כלי הדם. לאחר הנורמליזציה, הכלים מופעלים מחדש על ידי ביצוע התחלה סטנדרטית המורכבת מסדרה של גירויים ותקופות שטיפה.
ראשית, החלף את מכסה תא ה-myo והתחל אוורור ב-95% אוויר ו-5% פחמן דו חמצני. מלאו את החדר ב-PSS טרי המכיל 100 חומצה אסקורבית מיקרו-מולרית כווץ את הכלי עם חמישה שומר מיקרו-מולרי, רין או PE למשך חמש דקות ושטוף ארבע פעמים עם מאגר PSS לאחר הכביסה האחרונה, מלא מחדש את החדר ב-PSS והמתן שלוש דקות לפני מילוי החדר ב-PSS והתכווצות עם PE.As שהוצג קודם לכן, העורק מוכן כעת לניסוי.
למדוד את ההרפיה של כלי דם מכווצים על ידי הוספה מצטברת של ריכוזים הולכים וגדלים של סידן כלורי. טבלה זו מראה כי המתחים הבסיסיים לאחר מריחת פנילפרין השתנו בין חולדות רגישות למלח בובות או בובות לבין חולדות עמידות למלח DR או בובות. עקבות אלה מחולדת וויסטאר מראים הרפיה של עורקים מכווצים PE על ידי תוספות מצטברות של הרפיית סידן עם פגיעה חמורה ברקמות מחולדות DS בהשוואה לחולדות Wistar ובהשוואה ל-Dr.Rats כפי שניתן לראות כאן, ניתן לראות את ההבדלים ברגישות לסידן בעקומות תגובת הסידן ושוב בעת חישוב ערכי EC 50.
לבסוף, חולדות DS מראות ירידה בביטוי של קולטן חישת הסידן בעורקים בהשוואה ל-Dr.Rats לאחר ששולטו בו. ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשוות תגובתיות כלי דם של אטרי אנטרי קטן לתרכובת אקסוגנית בתנאים איזומטריים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה אוטומטית למיוגרפיה למדידת כוח בעורקים מזנטריים מבודדים. הטכניקה משתמשת ב-Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A להערכת תגובות לפנילפרין וסידן חוץ-תאי, מה שמאפשר מדידות עקביות של תגובה איזומטרית בכלי דם קטנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של כלי דם
- טכניקות של מיוגרפיה
רקע
- לעורקים המזנטריים תפקיד מכריע בוויסות זרימת הדם.
- הבנת התגובתיות שלהם חשובה למחקר קרדיווסקולרי.
- פנילפרין (Phenylephrine) הוא אגוניסט נפוץ המשמש לחקר תגובות כלי דם.
- רמות הסידן הן קריטיות להתכווצות השריר החלק בכלי הדם.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה למדידת כוח בעורקים מזנטריים קטנים.
- השוואת התגובתיות של חולדות רגישות למלח וחולדות עמידות למלח.
- הערכת ההשפעות של פנילפרין וסידן על תגובות כלי דם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד של קשת מזנטרית (mesenteric arcade) מחולדות.
- דיסקציה של ענפי עורקי התנגדות.
- קיבוע עורקים בתא מיוגרף באמצעות חוטי פלדת אל-חלד.
- החלת פנילפרין וסידן להערכת תגובתיות כלי דם.
תוצאות עיקריות
- הושגו מדידות כוח עקביות בעורקים מבודדים.
- נצפו הבדלים בתגובתיות בין חולדות רגישות למלח לחולדות עמידות למלח.
- פנילפרין השרה ביעילות מתח בעורקים.
- הוספת סידן הובילה להרפיה של כלי הדם.
מסקנות
- שיטת המיוגרפיה האוטומטית מספקת גישה מהימנה לחקר תגובות כלי דם.
- טכניקה זו יכולה לשפר את ההבנה של תפקוד העורקים המזנטריים.
- לממצאים עשויות להיות השלכות על מחקר של מחלות קרדיו-וסקולריות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיוגרפיה אוטומטית של חוטים בעורקים מזנטריים מאפשרת הערכה כמותית ומדויקת של תגובתיות כלי דם בתנאים איזומטריים, ובכך תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים של מחקר קרדיו-וסקולרי. גישה זו מספקת ביטחון חיזוי להפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות כלי דם ומסייעת בקבלת החלטות לגבי פורטפוליו של תוכניות למלחמה ביתר לחץ דם ובתפקוד לקוי של כלי דם. השחזוריות של השיטה והתוצרים הכמותיים שלה מקלים על השוואה הדדית איתנה של השפעות תרכובות ומודלים גנטיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תפקוד קולטני שריר חלק כלי דם ומסלולי אותת.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי כימות תגובות התכווצות והרפיה לאגוניסטים ולאנטגוניסטים.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירת מטרה עבור אינדיקציות כלי דם ומחלות לב וכלי דם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות כלי דם ex vivo מתוקפות לסריקת תרכובות ומחקרי מנגנון.
- מספק מדידות מתח סטנדרטיות, הניתנות לשחזור וכמותיות לצורך פיתוח בדיקות (assays).
- מאפשר השוואה מקבילה של חומרים פרמקולוגיים ומודלים גנטיים בפורמט הניתן להרחבה (scalable).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתוני תגובתיות כלי דם ex vivo למודלים רלוונטיים למחלה של יתר לחץ דם ודיספונקציה וסקולרית.
- תומך בזיהוי ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור ביטוי רצפטורים לתוצאות תפקודיות.
- מספק רצף מהשלבים המוקדמים של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות כלי דם.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה אוטומטית זו למיוגרפיה משתלבת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשרת בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים למחקר תרגומי בביולוגיה של כלי הדם.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמתה את יכולת הכיווץ וההרפיה של כלי דם כדי לבחון היפותזות לגבי תפקוד וסיגנלינג של רספטורים.
- סריקה (Screening): מספקת תכשירי כלי דם הניתנים לבדיקה וניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות ודירוג עוצמתן.
- אנליטיקה: מייצרת ערכי EC50 ועקומות תגובה להשוואה סטטיסטית חסונה בין תנאים ומודלים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין נתונים פונקציונליים ex vivo למודלים של מחלות in vivo ולאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה סטנדרטית לחקירה מתמשכת של מטרות ומסלולים וסקולריים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות כלי דם.
- ערך תפעולי: מספק בדיקות תגובתיות של כלי דם סטנדרטיות, הניתנות לשחזור וניתנות להרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בפורטפוליו של מחלות לב וכלי דם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות כלי דם ותרכובות בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה של כלי דם וטיפול ברקמות ex vivo.
- נדרשת גישה למכשור מיוגרפיה של תלי כבלים (wire myography) אוטומטי ולתוכנה אנליטית.
- נדרש סטנדרזציה קפדנית בין צוותי העבודה בנוגע לנהלי קיבוע כלי הדם והנורמליזציה.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור סוגי כלי דם שונים או מודלים של מחלות.
- גודלם הקטן של כלי הדם מגביר את הסיכון לנזק מכני, דבר המשפיע על מהימנות הבדיקה.
