גישה לא פולשנית לחקר האלקטרופיזיולוגיה של נוירונים מוטוריים בעוברים של דגי זברה

הניחו עוברי דג זברה מהונדסים גנטית תחת סטריאומיקרוסקופ והתבוננו בפיתול הזנב הספונטני המופעל על ידי נוירונים מוטוריים של חוט השדרה.

התכונות המהותיות של נוירונים אלה גורמות לזרם יונים דרך תעלות נתרן, מה שמוביל לדפולריזציה ספונטנית של הממברנה וליצירת פוטנציאל פעולה המתפשט לשרירים, ומפעיל את סלילת הזנב. מדוד את תדירות הסליל.

העבירו כמה עוברים לחוסם תעלות נתרן כדי לעכב את שטף הנתרן ולהעריך את תדירות הפיתול המופחתת.

הרכיבו עוברים לא מטופלים באגרוז מותך; הניחו לאגרוז להתמצק כדי להגביל את התנועה, והתבוננו במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הנוירונים המוטוריים מבטאים חיישן ביולוגי עם תחום חישת מתח הקשור לממברנה, או VSD, המאוחה לפלואורופורים תורמים ומקבלים.

דה-פולריזציה משנה את קונפורמציית ה-VSD, ומקרבת את הפלואורופורים.

עם העירור, התורם מעביר אנרגיה למקבל, וגורם לפליטת פלואורסצנטיות של המקבל.

הוסף את החוסם כדי לעכב דפולריזציה, מה שמפחית את פליטת המקבל, ומאשר עיכוב בתיווך חוסם של דה-פולריזציה ספונטנית בנוירונים.

לניתוח ספונטני של פיתול הזנב, העבירו את העוברים לצלחת פטרי עגולה בגודל 90 מילימטר מלאה במי דגים המכילים 0.2% DMSO, וביצעו אותם ידנית באמצעות שני מלקחיים של תכשיטן עם קצות או מחטים חדים. לאחר מכן, דגרו על העוברים למשך 5 דקות בחום של 28 מעלות צלזיוס. באמצעות מצלמה דיגיטלית המותקנת על סטריאומיקרוסקופ, זהה את הזנב מתפתל בטמפרטורת החדר במהלך הקלטת וידאו של דקה.

לאחר מכן, רכשו את סדרת הזמן ברזולוציית זמן של 30 פריימים לשנייה. לאחר מכן, חשב את תדירות פיתול הזנב הספונטני על ידי ספירת מספר הכיפופים ליחידת זמן. כדי להעריך את השפעת התרופה רילוזול, העבירו את העוברים לצלחת פטרי חדשה בגודל 90 מילימטר מלאה במי דגים המכילה 5 רילוזול מיקרומולרי. לאחר מכן, דגרו על העוברים למשך 5 דקות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס לפני הקלטת סרטון בן דקה וביצוע ניתוח התנהגותי.

כעת, הרכיבו את העוברים של 20 עד 24 hpf בנקודת התכה נמוכה של 1% במי דגים בתוך צלחת הדמיה עם תחתית זכוכית של 35 מילימטר ב-37 מעלות צלזיוס. כוונו את העוברים על צידיהם והמתינו עד שהאגרוז יתמצק בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, העבירו את צלחת ההדמיה לשלב של מיקרוסקופ קונפוקלי. זהה את הנוירונים המוטוריים המבטאים את החיישן הביולוגי על ידי Umikinoko-Green מונומרי מרגש עם לייזר ארגון 488 ננומטר. לאחר מכן, הגדר את הפליטה שלו בין 495 ל-525 ננומטר ולחץ על Record.

למדידת FRET, עורר את mUKG, התורם של זוג ה-FRET עם לייזר של 488 ננומטר. בו זמנית, באמצעות שני מכפילי פוטו, לזהות את הקרינה הנפלטת על ידי התורם ואת הקרינה הנפלטת על ידי מקבל Kusabira-Orange המונומרי. בתחילת הניסוי, מטב את הרווח וההיסט של מכפיל הפוטו 1, שבו נרשמת הקרינה mUKG, ושמור אותם קבועים לאורך כל הפגישה.

כדי להגדיר את ההיסט, שנה את צבע התמונה לערכי העוצמה באמצעות טבלת Q-lookup. בשעת סריקה כשלייזר כבוי, השתמש במחוון ההסטה כך שעוצמת הפיקסלים ברקע תהיה מעט גבוהה מאפס. באמצעות אותה טבלת חיפוש, הפעל את הלייזר. בזמן הסריקה, השתמש במחוון ההגבר כדי למקסם את יחס האות לרעש, והקפד להימנע מפיקסלים רוויים.

בחלון רכישת התוכנה, בחר את מצב רכישת xyt וגודל שדה תמונה של 512 על 64 פיקסלים מהתפריט הנפתח. לאחר מכן, הגדר את ההקלטה של השינויים במתח הנוירון בעמוד השדרה של העובר כדי לרכוש מישור xy יחיד כל 30 אלפיות השנייה למשך דקה אחת. העריכו את ההשפעה של מתן רילוזול על דה-פולריזציה של הממברנה באותו נוירון, רכשו מערך נתונים חדש חמש דקות לאחר הוספת מי דגים המכילים 5 רילוזול מיקרו-מולרי.