ניטור אופטי ואלקטרופיזיולוגי סימולטני של תאי עצב בפרוסות מוח

התחל בהחדרת נוזל מוחי מלאכותי מאוורר או aCSF על רשת רשת בתא זלוף.

העבירו פרוסת מוח המכילה נוירונים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ועגנו אותה במכשיר חוטי פלטינה.

סובבו את רשת השינוי ליישור.

הורד את הגשושית הרב-ערוצית לכיוון הפרוסה.

התאם את קוביית המסנן להדמיית חלבון פלואורסצנטי.

סובב את הפרוסה כדי ליישר את הבדיקה.

התאם את גובה הגשושית מתחת לפני הרקמה.

כעת, השתמשו ב-aCSF והתמקדו בתאי העצב המסומנים בפלואורסצנט.

באמצעות מטרה בעלת עוצמה גבוהה, התמקד ברקמה והתאם את אור העירור.

השתמש במסנן אור מתאים כדי לצפות בפלואורסצנטיות בנוירונים.

כוונן את עדשת המטרה כדי ליצור מקום לפיפטת התיקון ולהפעיל לחץ חיובי.

לאחר מכן, מקם את הפיפטה ליד תא העצב כדי ליצור גומת ממברנה.

לבסוף, הפעל יניקה חלשה כדי ליצור אטימת ממברנה, ואחריה יניקה חזקה כדי לשבור את הממברנה ולקבל הקלטות חשמליות מהנוירון הממוקד.

כדי למקם את הגשושית הרב-ערוצית בשקופית רקמת המוח ex vivo, החדרת ACSF ניסיוני מבעבע במהירות של שלושה עד שישה מיליליטר לדקה, והעבירו את פרוסת המוח המכילה את אזור העניין לרשת הרשת בתא הזלוף של המיקרוסקופ. עוגן את פרוסת המוח עם נבל פלטינה. סובב את רשת הרשת כך שקו מגעי האלקטרודה בקצה הדיסטלי של הגשושית הרב-ערוצית יהיה בערך בניצב למשטח ה-PL.

תחת תאורת שדה רחב ובקרה עדינה של המיקרומניפולטור, הורד את הגשושית הרב-ערוצית לכיוון פני השטח של הפרוסה. הפעל את קוביית המסנן המתאימה להדמיה של חלבון המדווח הפלואורסצנטי המתבטא במסופי אקסון של מוליכים בקליפת המוח.

במידת הצורך, סובב את הפרוסה כדי ליישר בצורה מדויקת יותר את הגשושית עם משטח ה-PL. מקם את הגשושית ממש מעל מישור הפרוסה, 200 מיקרומטר פחות ממיקום המטרה הסופי לאורך ציר ה-x, והשאיר לפחות תעלה אחת מחוץ לאזור הרקמה המוקלטת. לאט, הכנס את הגשושית לפרוסה לאורך ציר האורך שלה.

כדי למזער את הנזק לרקמה, קדם את הגשושית רק במידה שהקצוות החדים נראים רק מתחת לפני השטח של הרקמה. החלף את מקור ה-ACSF הניסיוני לתמיסת בקרה בשקית, וזהה את התא המסומן בפלורסנט להקלטה ממוקדת של מהדק טלאי. הגבל את הצמצם לקוטר הקטן ביותר, והפעל את מטרת הטבילה במים בעוצמה גבוהה, תוך הקפדה על הימנעות ממגע בין הגשושית הרב-ערוצית לעדשת האובייקטיב. הביאו את הרקמה למיקוד.

מרכז את האור על אזור רקמה הסמוך לבדיקה הרב-ערוצית, אך לא חופף אותה. הפעל את ערכת המסננים המתאימה כדי לאפשר הדמיה של תאים המבטאים את הסמן הפלואורסצנטי התלוי ב-Cre. הרם את עדשת האובייקט כדי ליצור מקום מספיק להורדת פיפטת תיקון.

טען פיפטת תיקון עם תמיסה פנימית ומותקן על מחזיק האלקטרודה. השתמש במזרק של מיליליטר כדי להפעיל לחץ חיובי המתאים לכ-0.1 מיליליטר אוויר. הורד את פיפטת המדבקה לתוך התמיסה, הבא את הקצה למיקוד בהנחיה חזותית, וקבל הקלטה של תא שלם מהתא הממוקד.