קביעת השפעת הורמון גדילה לבדיקה על נוירונים של קיספפטין באמצעות מהדק תיקון של תא שלם

אבטח פרוסת היפותלמוס של עכבר טרנסגני בתא הקלטה עם aCSF.

הפרוסה מכילה נוירונים פלואורסצנטיים המבטאים חלבון קיספפטין, החיוניים לוויסות מערכת הרבייה.

הרכיבו מיקרופיפטה הכוללת אלקטרודת הקלטה בתמיסה פנימית.

אתר מיקרוסקופית נוירון קיספפטין פלואורסצנטי.

הפעל לחץ חיובי על הפיפטה וקדם אותה לעבר נוירון המטרה. במגע, הלחץ יוצר כניסה על הממברנה העצבית.

הפעל לחץ שלילי קצר ויוצר איטום בעל עמידות גבוהה בין המיקרופיפטה לקרום.

הגדר את מתח ההחזקה בפוטנציאל המנוחה הפיזיולוגי של הנוירון למדידות מדויקות.

החל פעימות לחץ שליליות קצרות כדי לשבור את הממברנה, וליצור תצורת תא שלם.

אשר את כדאיות הנוירון על ידי ניטור הפרמטרים.

הכנס הורמון גדילה לבדיקה, המפעיל מסלולי איתות וגורם לשינויים בפוטנציאל הממברנה של הנוירון.

מדוד את השינויים בפוטנציאל הממברנה כדי לקבוע את ההשפעה המעכבת של הורמון הגדילה על הפעילות העצבית.

העבירו פיסת מוח מעניינת, אחת בכל פעם, לתא ההקלטה באמצעות פיפטת העברה אקרילית. החזק את הפרוסה עם עוגן פרוסה כך שהיא לא תזוז במהלך הזלוף של aCSF. מקם את הפרוסה למרכז תא ההקלטה באמצעות עדשת האובייקט בעלת ההספק הנמוך של מיקרוסקופ הטבילה פי 10 או 20x.

מיקום הפרוסה הוא קריטי כדי לאפשר תצוגה טובה של האזור הרצוי מתחת למיקרוסקופ ולהגעה מושלמת למיקרופיפטה ההקלטה. לאחר איתור אזור העניין, העבר את עדשת האובייקט לעדשת ההספק הגבוה, 63x, והתמקד ברמת הרקמה, תוך התבוננות בחלבון הפלואורסצנטי האנדוגני ובצורות התאים באזור המטרה כדי לאתר את תאי הקיספפטין על פני פרוסת המוח.

כאשר נמצא תא יעד אפשרי, סמנו אותו על מסך המחשב באמצעות סמן העכבר או על ידי ציור פורמט כמו ריבוע מעל אזור העניין. מסך המחשב המסומן עוזר לכוון את מיקום המיקרו-פיפטה המקליטה לתא. לאחר קביעת המיקום המדויק של תא המטרה, הרם את המטרה והכנס את המיקרו-פיפטה המקליטה המלאה בתמיסה הפנימית במחזיק האלקטרודה, וודא שהתמיסה הפנימית נמצאת במגע עם אלקטרודת הכסף.

הפעל לחץ חיובי לפני טבילת המיקרופיפטה בתמיסת ה-aCSF באמצעות מזרק מלא אוויר של 1 עד 3 מיליליטר המחובר למחזיק המיקרופיפטה דרך צינור פוליאתילן כדי למנוע כניסת פסולת למיקרופיפטה. בעזרת המיקרו-מניפולטור, הנח את המיקרו-פיפטה מתחת למרכז המטרה. הזז את כפתורי המיקרו-מניפולטור כדי להנחות את ציר ה-x, y, z של המיקרו-פיפטה לעבר התא המבוקש.

כוונן את המיקוד כדי לראות את קצה המיקרופיפטה ולקרב את המיקוד, אך לא קרוב מדי לפרוסה. הפחיתו את מהירות המיקרו-מניפולטור, והורידו לאט את המיקרו-פיפטה למישור המיקוד, וודאו שקצה המיקרופיפטה לא יחדור בפתאומיות לפרוסה, אלא יורד לאט עד שהוא נוגע במשטח התא או באזור המטרה.

הפעלת לחץ חיובי קל עם המזרק המלא באוויר של 1 עד 3 מיליליטר כדי לפנות כל פסולת מנתיב הגישה, הזז לאט את המיקרו-מניפולטור על ציר x, y, z כדי לקרב את קצה המיקרופיפטה ולגעת בתא המטרה, מה שגורם לגומה על ידי הלחץ המופעל. לאחר הקמת הגומה, בעזרת מצב מהדק מתח בתוכנה, הפעל יניקה קצרה חלשה דרך הפה למשך 1 עד 2 שניות דרך הצינור המחובר למחזיק המיקרופיפטה כדי ליצור את האיטום בין המיקרופיפטה לתא.

אם האיטום נשאר יציב מכנית ללא הפרעות רעש למשך כדקה, הגדר את מתח ההחזקה בפוטנציאל המנוחה הפיזיולוגי הקרוב ביותר של התא המעניין. עבור נוירונים היפותלמוסיים של קיספפטין, מומלץ מינוס 50 מילי-וולט. לאחר מכן, הפעל יניקה קצרה דרך הפה כדי לשבור את קרום הפלזמה בקצה המיקרופיפטה האטום המונח על התא כך שהממברנה הקרועה לא תסתום את המיקרופיפטה, או תמשוך חלק גדול מהממברנה, או את התא.

ניתן להשיג תצורה נאותה של תא שלם על ידי ביצוע יניקה בכוח מספיק. בדוק את מדריך הגדרות המערכת שבו נעשה שימוש. לאחר שבירת קרום התא, הפעל את תא שלם אפשרות במתח clamp מצב, ולחץ על הפקודה האוטומטית המתייחסת לכרטיסייה תא שלם.

לאחר מכן, בדוק את פרמטרי כדאיות התא בתוכנה כמתואר בכתב היד הטקסט. עקוב אחר עמידות הסדרה וקיבול המצב היציב של התאים במהלך הניסויים. לאחר שתצורת התא כולו מושגת כראוי, מדוד זרמים סינפטיים במצב מהדק מתח. רשום את השינויים בפוטנציאל הממברנה במנוחה ואת השינויים בפוטנציאל הממברנה במנוחה במצב המהדק הנוכחי.