Name: תת עורי מינהל היריבים Muscarinic ו Triple-Immunostaining של השריר Levator Longus Auris של עכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: למדו כיצד לנהל אנטגוניסטים מוסקריניים תת-עוריים לשריר LAL בעכברים ולבצע צביעת immunostaining משולשת. שיטה זו מאפשרת לחקור שינויים מורפולוגיים בחיבורים נוירומוסקולריים ותפקיד הקולטנים במחלות נוירומוסקולריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי ניוון שרירים האגודה, NIH (NS062320).

1. תת עורי מתן muscarinic קולטן האצטילכולין (mAChR) היריבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בתנאים aseptic את המינון המתאים של אנטגוניסט mAChR, (ראה לוח) על ידי המסת התרופה מלח פיזיולוגית סטרילית בצינור התגובה 1.5mL. היריבים הבאים שימשו: אטרופין, Methoctramine, 4 לח, AFDX-116, AFDX-384, MT 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר 50μl של פתרון לתוך מזרק אינסולין a1cc ולהשתמש מזרק נפרד עבור כל עכבר. כמו כן להכין מזרקים המכילים מלח פיזיולוגיים רק עכבר אחד בקבוצת הביקורת. תחזיקי את המזרקים על הקרח עד מוכנים להזריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברים עם קוקטייל קטמין-xylazine (120 מ"ג / ק"ג קטמין, 8 מ"ג / ק"ג xylazine) בדיקת עומק ההרדמה המתאים ידי התבוננות חוסר התגובה הבוהן קמצוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סדציה נאותה, לגלח את השיער שכיסה את האזור מקורי של הראש לאזור הזנב של הצוואר, נגב שאר השיער משם עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום העכבר תחת stereomicroscope, והכנס במקביל מחט לשריר LAL תוך משיכת בקלילות על מחט של מזרק (איור 1 א ', ב). הדבר מבטיח כי המחט מוחדרת לתוך רקמת החיבור המכסה ואינו ישירות הנזק לשריר LAL עצמו. הכנס את המחט כך קצה מכסה את ההיבט הזנב של שריר LAL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט מתחילים להזריק פתרון מעל השריר LAL הנכון תוך הוצאת מזרק; הזמן הזרקה הכולל צריך להיות כ 1 דקה. אם מזריקים כראוי, הפתרון צריך להקים "כיפה", כלומר בערך 1 ס"מ קוטר, בעור שמעל שיישארו לפחות שעה אחת. פתרון מוזרק אחיד יכסה את האזורים מקורי ואת הזנב כולו של השריר LAL הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך כל 12 שעות 1 עד 7 ימים. עבור studies1 אחרים, השתמשנו באותו פרוטוקול להזריק גורמי גדילה כל 12 שעות למשך עד 21 ימים. התגובות לא נורמלי נצפו מעכברים מנוהל עם 2x הרדמה ביום למשך עד 21 ימים. </li></ol> 2. Dissection של השרירים LAL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים עם ממנת יתר של נתרן pentobarbital (390 מ"ג / ק"ג). המוות הוא מובטח על ידי הערכת חוסר דופק לאחר פתיחת בית החזה מתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להצמיד את העכבר בצלחת לנתיחה, צד הגב עם פין 1 בכף כל פין 1 דרך האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את החתך הראשון דרך העור בלבד, בעזרת מספריים קטנים באביב לחתוך לאורך LAL שמאל מאזור הפרוקסימלי רק לאוזן לאזור סביב השכמה השמאלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את העור באזור זה, אך להימנע חיתוך קרוב מדי לאוזן ימין כמו זו אחת הנקודות ההתקשרות עבור השריר LAL הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר רקמת השומן ממוקם במרכז רצועת השומנים לאורך קו האמצע, על פני השטח השטחיים של הראש, שם את השרירים LAL ימין ועל שמאל להיפגש. בעזרת מספריים באביב קטן, לחתוך 1cm בצד ימין של רקמת שומן (לכיוון האוזן השמאלית) מן הקצה הפרוקסימלי של שריר LAL שמאל והגיע עד הכתף (איור 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החתך הוא עשה, לקלף את השריר האחורי LAL ימין עם מלקחיים קטנות כדי לחשוף את הצד הגחוני של השריר. חתוך את רקמת החיבור fascia תוך הקפדה על משיכת שריר LAL ימין עם מלקחיים (איור 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים בסביבות סוף הזנב של LAL את הזכות בבסיס האוזן. המשך חיתוך, נע לקראת סוף מקורי של האוזן הימנית, תוך שמירה על LAL ימין והתהפך (איור 1C).. עדיף לכלול רקמה יותר בשלב זה מאשר הסיכון לפגיעה LAL עצמו. אם השריר מתחיל להתייבש, פיפטה 1X PBS מעל השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום גזור LAL זכות בצלחת 30mm תרבות Sylgard המכיל 1X PBS, בצד הגבי למעלה. הצמד מטה ארבע פינות של שריר עם סיכות חרקים קטנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים קטנים מספריים האביב, רקמת חיבור נקי ממשטחי הגבי ו הגחון של שריר LAL הנכון. הפעל מחדש את השריר פינים כדי לנקות את השטח הגחון. 2-3 השרירים יוטלו בצלחת 30mm אותו. </li></ol> 3. Immunostaining טריפל של NMJs LAL: יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת immunostaining, להכין את כל ריאגנטים הצורך. 1X PBS, 2% שור BSA אלבומין) / PBS, 0.1M גליצין ב 2% BSA / PBS, טריטון X100 0.2% ב 2% BSA / PBS, ו paraformaldehyde 4% (PFA) ב 1X PBS יהיה צורך. טרום מגניב מתנול במקפיא -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו השרירים LAL הצמיד בצד הגבי צלחת מעלה במהלך תהליך זה. בטל פתרון 1X PBS ולהוסיף מספיק 4% (PFA) כדי לכסות את השריר. מניחים על צלחת שייקר להגדיר במהירות 2 או 3 למשך 20 דקות. אלא אם נאמר אחרת, המנה צריך להיות ממוקם על שייקר את השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל PFA 4% ולשטוף את השריר עם 1X PBS 3 פעמים, 10 'כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק האחרון 1X PBS לשטוף ולהוסיף 0.1M גליצין ב 2% BSA / PBS פתרון 30 ". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל פתרון 0.1M גליציןד להוסיף 1X PBS המכיל מצומדות rhodamine α-bungarotoxin בריכוז של 1:200 עבור 15 ". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל α-bungarotoxin פתרון ולשטוף שריר 1X PBS, 3 פעמים 10 'כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize באמצעות הוספת רקמה טרום מקורר מתנול במקום צלחת במקפיא ° C ל -20 בדיוק 5 דקות, לא רועד הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מתנול לשטוף 3 פעמים 10 "כל אחד עם 1X PBS. בטל לשטוף האחרון רקמות לחסום עם 0.2% Triton X-100 ב 2% BSA / PBS שעה 1. הצעדים כביסה חסימת מבוצעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שרירי הלילה, טלטולים, ב 4 מעלות צלזיוס קוקטייל של נוגדנים העיקרי מדולל הפתרון חוסם (ראה לוח). </li></ol> 4. Immunostaining טריפל של NMJs LAL: יום 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף השרירים 1X PBS 3 פעמים, 10 "כל בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף קוקטייל של נוגדנים משני חסימת פתרון 1 שעה בטמפרטורת החדר (ראה לוח). השרירים חייבים להיות מוגנים מפני אור ואילך צעד זה כדי למנוע צילום של הלבנת פלואורסצנציה 647-Alexa פלואוריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף השרירים 1X PBS 3 פעמים, 10 'כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את כל רקמת החיבור שנותרו 1X PBS, לחתוך את הגבולות לרוחב של שרירי לאל הר בשקופיות בצד הגב למעלה, באמצעות זכוכית כיסוי מחליק התקשורת גובר. השתמש ברור לק כדי להבטיח כיסוי להחליק במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגן שקופיות אור ולאחסן ב -20 ° C עד מוכן לניתוח. </li></ol> 5. הדמיה של Confocal NMJs LAL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות ברזולוציה גבוהה confocal מתקבלים עם מטרה Apo לייקה תכנית שמן 63X (1.4NA) על מיקרוסקופ TCS 4D לייקה confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> והעמסת ו אלקסה 647 אותות נסרקו בו זמנית עם קווי לייזר 488 ננומטר (ארגון, 488 ננומטר, 20 mW) ו - 633 ננומטר (HeNe, 633 ננומטר, 10 mW), בהתאמה. ברצף, אות Rhodamine נסרק אז עם קו לייזר 561 ננומטר (DPSS, 561, 20 mW). סעיפים אופטי נאספו 0.3 מיקרומטר במרווחים, ומספר תמונות מטוס-z המגוון 60-80. חריר מותאם Airy 1 (107.97 אממ). פורמט תמונה 1024 x 1024 (X, Y), עם מקדם הגדלה של 1, על תוצאות מהירות 400Hz בגודל תמונה של 234.32 x 234.32 מיקרומטר מיקרומטר ו גודל פיקסל של 229.05 x 229.05 ננומטר ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייקה TCS-NT תוכנה רכישת מכן נעשה שימוש כדי לשחזר Z-סדרת תמונות לתוך תחזיות בעוצמה מקסימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות Multipanel מותאמים הבהירות והניגודיות באמצעות Adobe Photoshop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שריר LAL טיפוסי, אחד צריך להיות מסוגל לנתח כ 75-100 NMJs en פנים. יציבות Synaptic נקבעת על ידי תכונות כגון יישור המרחבי של טרום, פרי ו postsynaptic אלמנטים (כלומר, עצב, תאים שוואן שרירים), מדידות של שטח סינפטי (כלומר, גודל סינפסה). </li></ol> נציג התוצאות: בשלב NMJ של יונקים בוגרים, האקסון יחיד מנוע מרחיב סניפים בסדר כי טופס מאוד סוכות הבדיל מסוף העצב (איור 2; הירוק) על סיב שריר בודד, apposed בדיוק אשכולות postsynaptic של AChRs ניקוטינית (איור 2; האדום) . Perisynaptically, מסוף בתאי שוואן בחוזקה לכסות את כל הסניפים של מסופי העצב presynaptic (איור 2; כחול). שלמות מבניים ותפקודיים של הארגון הזה היא משולשת קשות מוטרד היישום היומיומי של תת סוג ספציפי מעכבי mAChR. בדוגמה המוצגת כאן (איור 3), 4 לח, אנטגוניסט mAChR בזיקה גבוהה עבור M1, M3, M4 ו M5 תת mAChR, מעורר חיסול סלקטיבי של מסופי עצב NMJs רבים ברחבי השטח שריר (איור 3B, ג). בנוסף, בתאי שוואן הם מסוף שקט באופן חריג 8 כפי שמעידים תיוג S100 בהיר ללא הארכת תהליך (איור 3B ", 3C"). Postsynaptically, סיבי שריר תקינים ואין אובדן nAChRs (איור 3 ב ', 3C'). <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. למיקום ארגון אנטומיים של שריר LAL. מיקום מקורי (rLAL), הזנב (כלל), ואת העצב LAL (LALn) להקות endplate המקביל מוצגות (A, הבלעה). המיקום והכיוון של המחט ביחס לשריר LAL מוצג עבור ההליך הזרקה (B). נקודות החתך מוצגים עבור ההליך דיסקציה (C). <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. ארגון המשולשת של NMJ. הגדלה גבוהה צפיות confocal של NMJ העכבר. האקסון יחיד מרחיב סניפים מסוף מצוין (A), מכוסה היטב על ידי תא שוואן הטרמינל התהליכים שלהם (א ', כוכביות הצבע גופים מסוף שוואן תאים). Postsynaptically סיב שריר, מקבץ של AChRs ניאציניות הוא apposed בדיוק ענפי עצב terminals מסוף בתאי שוואן. <img src="/files/ftp_upload/3124/3124fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. LAL השרירים שטופלו 4-ולח, אנטגוניסט mAChR. צפיות confocal נמוכה הגדלה גבוהה של השרירים LAL שטופלו רכב או 4-לחה. בניגוד שריר רכב שטופלו (A-NMJs'''), רבים 4-לחות שטופלו חוסר שריר מסופי העצב (B-B''', C-C'''). אזור התאגרף באיור 2B הוא zoomed באיור 2C.

<ol><li>Wright, M. C., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+is+not+required+for+terminal+sprouting+and+compensatory+reinnervation+of+neuromuscular+synapses%3A+re-evaluation+of+CNTF+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice.</a> Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).</li>
<li>Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+motor+neuron+sprouting+in+vivo+by+ciliary+neurotrophic+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).</li>
<li>Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+neuronal+determinants+locally+regulate+extrasynaptic+and+synaptic+growth+at+the+adult+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).</li>
<li>Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+factors+regulate+AChR+subunit+mRNAs+at+rat+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses.</a> J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).</li>
<li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse%3A+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).</li>
<li>Lanuza, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-+and+postsynaptic+maturation+of+the+neuromuscular+junction+during+neonatal+synapse+elimination+depends+on+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase.</a> C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).</li>
<li>Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+effects+of+beta-amyloid25-35+peptide+aggregates+on+transmitter+release+in+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).</li>
<li>Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+patterns+of+motor+nerve+terminal+sprouting+induced+by+ciliary+neurotrophic+factor+vs.+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin.</a> J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).</li>
<li>Wright, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth%2C+but+not+compensatory+plasticity%2C+of+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li>
<li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y1+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors.</a> J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).</li>
<li>Dorje, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonist+binding+profiles+of+five+cloned+human+muscarinic+receptor+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).</li>
<li>Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Union+of+Pharmacology.+XVII.+Classification+of+muscarinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המוצגת כאן היתרי חקירה של תפקידים מוכרים בעבר של mAChR-תת ספציפיים איתות ביציבות ותחזוקה של NMJs יונקים. שיטה זו תהיה גם שימושית כדי לבדוק את ההשפעות של גורמים neurotrophic וסוכני תרופתי. לדוגמה, המעבדה שלנו מצאו כי פקטור neurotrophic ריסי (CNTF) שהושרו מבצבצות כמעט כל מסופי LAL העצב בעכברים בוגרים <a>1</a> . תוצאה זו בניגוד מחקרים קודמים של CNTF שטופלו שרירי הגפיים האחוריות, אשר דיווחו מתונה הנבטה ב CA. 13-33% של הישבן ועל 9% לרוחב הגסטרוקנמיוס junctions 3. אנו מ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> קטמין </td><td> Hospira </td><td> NDC0409-2051-05 </td><td> מנה: 120mg/kg </td></tr><tr><td> xylazine </td><td> לויד מעבדות </td><td> LA33806 </td><td> מנה: 8mg/kg </td></tr><tr><td> אטרופין </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A0132 </td><td> (&gt; טוהר 98%); מנה: 0.2mg/kg - 20mg/kg </td></tr><tr><td> אטרופין </td><td> וויגט גלובל הפצה </td><td> AT105 </td><td> התרופות כיתה </td></tr><tr><td> Methoctramine </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M105 </td><td> מנה: 100 - 400M </td></tr><tr><td> 4 לח </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D142 </td><td> מנה: 2.5mg/kg </td></tr><tr><td> AFDX-116 </td><td> Bioscience Tocris </td><td> 1105 </td><td> 250 </td></tr><tr><td> AFDX-384 </td><td> Bioscience Tocris </td><td> 1345 </td><td> 50 - -500 </td></tr><tr><td> MT 7 </td><td> פפטידים הבינלאומי </td><td> PMT-4340-s </td><td> 0.1M - 1M </td></tr><tr><td> פוספט 1X שנאגרו pH מלוחים, 7.4 </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> דיג </td><td> T353-500 </td><td> הפוך את הפתרון של 10% לראשונה על ידי המסת מים 10g/100mL דה מיונן מזוקקים; לעשות 4% עם 1X PBS, כדי להתאים את ה-pH 7.4 </td></tr><tr><td> Pentobarbitol נתרן </td><td> Virbac לבריאות בעלי חיים </td><td> NDC-051311-050-01 </td><td> מנה: 390mg/kg </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> חלק # 184 </td><td> עקוב אחר ההוראות המצורפות בערכה, ניתן להשתמש תרבות מרובים צלחת בגודל (30 מ&quot;מ, 60 מ&quot;מ, 100 מ&quot;מ), בהתאם לצרכים </td></tr><tr><td> 0.1M גליצין </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> G-7126 </td><td> הוסף 0.185g כדי 25mL של 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> 2% שור בסרום אלבומין (BSA 2%) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A3059-100 </td><td> ממיסים 2g BSA לתוך 100 מ&quot;ל של 1X PBS </td></tr><tr><td> טריטון X100 0.2% ב 2% BSA / PBS (Buffer חסימה) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T9284-100 מ&quot;ל </td><td> ממיסים 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> α-bungarotoxin </td><td> Invitrogen </td><td> T1175 </td><td> שימוש בריכוז של 1:200 </td></tr><tr><td> SMI-312 </td><td> Sternberger Monoclonals </td><td> SMI312 </td><td> שימוש בריכוז של 1:1000 </td></tr><tr><td> SV2 </td><td> התפתחותית מחקרים Hybridoma בנק </td><td> SV2-Supernatant </td><td> שימוש בריכוז של 1:10 </td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td> שימוש בריכוז של 1:400 </td></tr><tr><td> FITC-עיזים אנטי עכבר IgG1 </td><td> רוש </td><td> 03117731001 </td><td> שימוש בריכוז של 1:200, אבל אם הרקע הוא גבוה, לנסות 1:400 </td></tr><tr><td> אלקסה, פלואוריד 647 עיזים מצומדות נגד ארנב </td><td> Invitrogen </td><td> A21244 </td><td> שימוש בריכוז של 1:200 </td></tr><tr><td> Vectashield פלורסנט הרכבה התקשורת </td><td> וקטור מעבדות </td><td> H-1000 </td><td> זה לא קשה להגדיר התקשורת, תצטרך להבטיח את פליטת לכסות עם לק ברור. </td></tr><tr><td> האביב מספריים קטנים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 15002-08 </td><td></td></tr><tr><td> Dissection מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr></tbody></table>

תת עורי מינהל היריבים muscarinic ו triple-immunostaining של השריר levator longus auris של עכברים

Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

שרירי הגפיים האחוריות של מכרסמים, כגון הגסטרוקנמיוס ו tibialis הקדמי, משמשים לעתים קרובות במחקרים פרמקולוגיים vivo של אותות חיוני ליצירת ותחזוקה של NMJs יונקים. עם זאת, חדירת התרופה לתוך השרירים הללו לאחר תת עורית או תוך שרירית הממשל היא לעתים קרובות לא שלם או אחיד NMJs רבים יכולים נותרות בעינן. אמנם הממשל מערכתית עם מכשירים כגון מיני משאבות יכולים לשפר את ההשפעות spatiotemporal, אופי פולשני של גישה זו עלולה לגרום תגובות דלקתיות בלבול ו / או נזק לשרירים ישיר. יתר על כן, ניתוח מלא של NMJs בשריר הגפיים האחוריות הוא מאתגר, מכיוון שהיא דורשת זמן רב חתך סדרתי immunostaining נרחב. LAL העכבר הוא סדין דק, שטוח של שריר הממוקם על שטחי dorsum של הצוואר. הוא עווית שריר מהיר שמתפקד להעביר את פינה. הוא מכיל חלקים מקורי ואת הזנב שמקורם קו האמצע של הגולגולת ולהרחיב רוחבית לחלק סחוסי של כל פינה. השריר מסופק על ידי ענף של עצב הפנים כי פרויקטים caudally מיד עם יציאתו foramen stylomastoid. אנו ואחרים מצאו LAL להיות הכנה נוח כי יתרונות לחקירת הן קצרות וארוכות טווח vivo השפעות של תרופות על NMJs והשרירים. ראשית, המיקום שלה שטחית מקלה יישומים מקומיים רבים של תרופות תחת הרדמה קלה. שנית, הרזון שלה (2-3 שכבות של סיבי שריר) היתרי להדמיה וניתוח של כמעט כל NMJs בתוך השריר. שלישית, את קלות לנתח את זה עם שלם העצב שלה יחד עם דפוס של העצבוב שלו מאפשר ניתוח משלים אלקטרו במבחנה 9,5. לאחרונה, ואולי הכי חשוב, נפח להחיל קטן (~ 50μl) בקלות מכסה את פני השטח כולו שרירים, ומספק חשיפה אחידה וממושכת של כל NMJs שלה לתרופה מבטלת את הצורך בגישה מערכתית 1,8.

אנו מתארים נהלים לניהול חוזרות ונשנות של מעכבי איתות muscarinic כדי longus levator auris (LAL) השרירים של עכברים בוגרים צעירים עבור immunostaining הבאות של צמתים neuromuscular שלה (NMJs) ב wholemounts. השריר LAL יש יתרונות ייחודיים עבור חושף<em&gt; In vivo</em&gt; השפעות פרמקולוגיות על NMJs.

תת עורי מינהל היריבים Muscarinic ו Triple-Immunostaining של השריר Levator Longus Auris של עכברים

שרירי הגפיים האחוריות של מכרסמים, כגון השריר התוממי השוק (gastrocnemius) והשריר התאמי הקדמי (tibialis anterior), משמשים לעיתים קרובות למחקרים פרמקולוגיים in vivo של אותות...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למתן אנטגוניסטים מוסקריניים לשרירי ה-LAL של עכברים בוגרים ולבחון שינויים מורפולוגיים ב-njs בתגובה לעיכוב של קולטני אצטילכולין מוסקריניים. ראשית, אנטגוניסטים מוסקריניים מוזרקים תת-עורית בתדירות ובמשך הזמן הרצויים. לאחר ההמתה, שרירי ה-LAL המטופלים מוצאים בזהירות באמצעות דיסקציה וכל רקמה חיבורית מנוקה מהם.לאחר מכן, רקמת השריר עוברת סימון אימונו-כימי משולש כדי להמחיש את תאי השוואן של העצב המוטורי ואת קולטני האצטילכולין ניקוטיניים, תוך שימוש בשיטות אימונוהיסטוכימיות סטנדרטיות. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לבחון שינויים מורפולוגיים של njs בשרירים שטופלו באנטגוניסטים מוסקריניים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כי הארגון המורפולוגי של ה-NMJ התלת-רכיבי מופר באופן משמעותי כתוצאה מעיכוב של קולטני אצטילכולין מוסקריניים.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מתן תרכובות תרופתיות לשרירים השלדיים של גפה אחורית של מכרסם, כגון ה-gastric anemia וה-tib anterior, הוא ששריר ה-LAL נגיש יותר ודק יחסית. דבר זה מאפשר יישום מקומי חוזר של תרופות וויזואליזציה של כמעט כל ה-njs בתוך השריר. על משטח עבודה שנוקה באתנול, המיסו את המנה המתאימה של מעכב קולנרג'י למסבים מוסקריניים בסליין פיזיולוגי סטרילי בתוך מבחנה לתגובה בנפח 1.5 milliliter. שאבו 50 µL מהתמיסה למזרק אינסולין בנפח one cc, תוך שימוש במזרק נפרד עבור כל עכבר.הכינו גם מזרקים המכילים תמיסת סליין פיזיולוגית בלבד עבור כל עכבר בקבוצת הביקורת, ושמרו את כל המזרקים על קרח עד למועד ההזרקה. לאחר מכן, הרדימו את העכברים באמצעות תערובת של קטמין וקסילזין. ודאו את ההרדמה באמצעות טכניקת צביטה של בהונות לאחר סדציה נאותה, גלחו את הפרווה המכסה את האזור הרוסטרלי של הראש ועד לאזור הצוואר, ונגבו את השיער שנותר באמצעות 70% ethanol. מקמו את העכבר תחת מיקרוסקופ סטריאו והחדירו את מחט המזרק במקביל לשריר ה-LAL כך שהקצה יכסה את ההיבט הקודאלי.משכו קלות את מחט המזרק כדי לוודא שהמחט מוחדרת לרקמה החיברית שמעל ואינה פוגעת ישירות בשריר ה-LAL עצמו. התחילו להזריק את התמיסה באיטיות רבה מעל שריר ה-LAL הימני, תוך נסיגה הדרגתית של המזרק במשך כדקה אחת. אם ההזרקה בוצעה כראוי, התמיסה צריכה ליצור בליטה (dome) בעור שמעל, שתישאר למשך שעה אחת לפחות.חזור על הפרוצדורה בכל 12 שעות למשך יום אחד עד שבעה ימים לפני נתיצת השריר. לאחר ההמתה, קבע את העכבר בתוך צלחת נתיצה כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. בצע את החתך הראשון דרך העור בלבד באמצעות מספרי קפיץ קטנים, תוך גזירה לאורך ה-LAL השמאלי מהאזור הסמוך לאוזן ועד לאזור שפחית הכתף השמאלית. הסר בזהירות את העור באזור זה, אך הימנע מחיתוך קרוב מדי לאוזן הימנית, שכן זוהי אחת מנקודות החיבור של שריר ה-LAL הימני.אתרו את רצועת הרקמה השומנית הממוקמת במרכז, על פני השטח העליונים של הראש, בנקודת המפגש של שרירי ה-LAL הימני והשמאלי, באמצעות מספרי קפיץ קטנים. גזרו סנטימטר אחד מימין לרקמה השומנית ובכיוון האוזן השמאלית, מהקצה הפרוקסימלי של שריר ה-LAL השמאלי ועד להגעה לכתף. לאחר ביצוע החתך, קלפו לאחור את שריר ה-LAL הימני בעזרת פינצטה קטנה כדי לחשוף את הצד הוונטרלי של השריר.גזמו את הרקמה המחברת ואת הפסציה תוך כדי משיכה זהירה כלפי מעלה של שריר ה-LAL הימני באמצעות פינצטה. גזרו מסביב לקצה הקודל (coddle end) של ה-LAL הימני בבסיס האוזן והמשיכו לכיוון הקצה הרוסטרלי של האוזן הימנית. השאירו את ה-LAL הימני במצב הפוך.עדיף לכלול יותר רקמה בשלב זה מאשר להסתכן בפגיעה ב-LAL עצמו. אם השריר מתחיל להתייבש, טפטפו 1 XPBS על השריר.הנח את ה-LAL ימני המפוצע בתוך כלי תרבית בצורת סיגר בנפח 30 מילימטר המכיל את XPBS אחד, כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. קבע את ארבעת פינות השריר באמצעות סיכות חרקים קטנות, בעזרת פינצטה קטנה ומספרי קפיץ. נקה רקמה מחברת מהמשטח הגבי של שריר ה-LAL הימני.הפכו את השריר והנעיצו אותו מחדש כדי לנקות את הפני השטח של הצד הבטנלי. ניתן להניח שניים עד שלושה שרירים באותה צלחית של 30 מילימטר לצורך צביעה אימונולוגית משולשת לאחר דגירה של נוגדן ראשוני למשך לילה.שטפו את השרירים ב-one XPB S3 שלוש פעמים למשך 10 דקות, ולאחר מכן הוסיפו את תערובת הנוגדנים המשניים בתמיסת חסימה למשך שעה אחת. בטמפרטורת החדר, שמרו את השרירים בדגירה תחת הגנה מאור כדי למנוע פוטובליצ'ינג; לאחר שעת דגירה, שטפו את השרירים ב-one XPB S3 שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. השאירו את השרירים מכוסים ב-one XPBS טרי לאחר השטיפה האחרונה, ונקו תחת מיקרוסקופ סטריאו את שאריות הרקמה החיברית, ולאחר מכן גזרו את הגבולות הצדדיים של ה-LAL.הניחו את רקמת השריר על הזריקה כאשר הצד הגבי פונה למעלה. לאחר מכן, הוסיפו שתי או שלוש טיפות של חומר קיבוע. הניחו כיסויי זכוכית והשתמשו בלק שקוף כדי לקבע אותם במקומם.הגנו את השקופיות מאור ואחסנו אותן בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד למועד האנליזה. תצפיות במיגדילה גבוהה במיקרוסקופ קונפוקאלי של צביעה אימונוהיסטוכימית משולשת של NMJ בעכבר מראות את הארגון התלת-חלקי שלו. הענפים התרמינליים העדינים המתפצלים מאקסון בודד שנצבע ב-NFS V two מכוסים באופן הדוק על ידי גופי תאי שוואן תרמינליים ובלבטיהם, כפי שניתן לראות בצביעת S 100 הפוסט-סינפטית.בסיב שריר, צביר של קולטני ניקוטין לאצטילכולין ממוקם בדיוק מול הענפים של הסיומות העצביות ותאי שוואן טרמינליים. שריר ה-LAL של עכבר שטופל ברכב (vehicle) מראה njs, שהארגון השלוש-חלקיו אינו מופר ובעל הענפים המובחנים מאוד האופייניים לסיומת העצבית, כפי שמוצג על ידי צביעה אימונו-משולשת. לעומת זאת, השלמות המבנית והתפקודית של ארגון זה, בעל השלושה חלקים, מופרת קשות על ידי יישום יומי של ארבעה damp.מעכב קולנרגוני מוסקריני הסגולי לסוג-משנה. כאן, ארבעה גירויים גורמים לסילוק סלקטיבי של סופי עצבים ממספר רב של NJS ברחבי שטח השריר. בנוסף, תאי שוואן טרמינליים נמצאים במצב של שקיעה חריגה, כפי שמעיד סימון S 100 בהיר ללא התארכות של זרועות.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יש למתן מעכבים מוסקריניים לשרירי LAL ולבצע צביעה אימונוהיסטוכימית משולשת לשרירים, כדי לבחון שינויים מורפולוגיים ב-njs בתגובה לעיכוב של רצפטורים אלו.

subcutaneous-administration-muscarinic-antagonists-triple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מדידות חוזרות של הפיזיולוגיה מכרסם הנשימה דגימה של תאים דלקתיים בדרכי האוויר רצויות, אבל בדרך כלל לא ריאלי. כאן אנו מתארים את שיטת הדיר עבור בעל פה intubating עכברים המאפשר מדידות חוזרות של דרכי הנשימה ואת hyperreactivity דגימה של תאים דלקתיים בדרכי האוויר.

הפיך, לא פולשני שיטת ההתנגדות מדידות דרכי הנשימה ואת נוזל שטיפה ברונכואלוואולרית דגימה של עכברים

אנחנו פיתחנו שיטה פשוטה, אמינה, וזולה יחסית לאינטובציה endotracheal בעכברים באמצעות laryngoscopy הישיר באמצעות אוטוסקופ עם ספקולום 2.0 מ"מ. טכניקה זו היא atraumatic ויכולה לשמש למדידות חוזרות בניסויים כרוניים. אנחנו מוצאים את זה מעולה להנשמה או בעבר דיווח טכניקות נזקקה לניתוח.

Endotracheal אינטובציה בעכברים<em&gt; דרך</em&gt; ישיר laryngoscopy באמצעות אוטוסקופ

פרוטוקול נוכחי זה משתמש במדווחים פלואורסצנטיים, תיוג in vivo וטכניקות הדמיה תוך-חיוניות כדי לאפשר ניטור של התהליך הדינמי של תחול נויטרופילים בבעלי חיים חיים.

הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed

שתי גישות מיקרו-כירורגיות להעברת תרופות מקומיות לאוזן הפנימית מתוארות כאן ומושוות במונחים של השפעה על פרמטרי שמיעה, ציטוארכיטקטורה של השבלול וביטוי סמנים דלקתיים.

מחקר השוואתי של שיטות שיגור תרופות אל האוזן הפנימית עכבר: Bullostomy Versus הזרקת Transtympanic

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לגרום לדלקת שיתוק ובעיות opticospinal על ידי העברה של aquaporin-4 (AQP4)-תאי T ספציפי של עכברים- / - AQP4 לתוך WT עכברים. בנוסף, נדגים כיצד להשתמש טומוגרפיה אופטית קוהרנטית טורי כדי לפקח על תפקוד מערכת הראייה.

אינדוקציה של שיתוק ופציעה מערכת הראייה אצל עכברים מאת T תאים ספציפיים עבור אופטיקה Neuromyelitis Autoantigen Aquaporin-4

הפרוטוקול המתואר במאמר זה משתמש בעכבר השריר מרים auris הארוך (LAL) כדי להקליט ספונטנית, עורר עצב postsynaptic פוטנציאל (זרם-קלאמפ) וזרמים (מתח-קלאמפ) באזור צומת עצב-שריר. שיטה זו יכולה לספק תובנות מפתח במנגנונים של ההעברה הסינאפסית בתנאים רגיל ומחלות.

מרים Auris הארוך הכנה לקראת בחינת בתרבית של התמסורת Neuromuscular בתנאים קלאמפ מתח

אנו מציגים גישה מפורטת לביצוע אוסף רוק, כולל מיכשור וציוד מאתר את ניתוקה של שלושה בלוטות הרוק הגדולות.

מאתר הערכה תפקודית הרוק באמצעות בעקבות גירוי פילוקרפין Fractionated קרינה

כאן, אנו מראים כיצד לבצע מיקרוסקופ לאחר הנימי של השריר הראשי של העכבר. בדרך כלל מיושם מודלים שונים של דלקת אלח דם, במיוחד אלה המושרה על ידי נוגדנים ו ציטוקינים, אנו להדגיש את הרלוונטיות שלה במחקר של מוסקולופאאס מעורבים חדירה מוגזמת שרירי לוקיציט.

הסתננות לאוציט של שריר Cremaster בעכברים המוערך על ידי מיקרוסקופ אינטרטל

דלקת במשטח העין פוגעת ברקמות פני השטח של העין ופוגעת בתפקודים חיוניים של העין. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה להשראת דלקת עיניים ולאיסוף רקמות פגועות במודל עכברי של תפקוד לקוי של בלוטת Meibomian (MGD).

אינדוקציה של דלקת פני השטח של העין ואיסוף של רקמות מעורבות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב אלקטרופורציה in vivo וניתוק עצבים של שריר levator auris longus (LAL). הליך זה מאפשר לחקור את התפקיד הפוטנציאלי של חלבונים שמקורם בשריר בהתחדשות הסינפסה העצבית-שרירית.

משולב באלקטרופורציה של Vivo ועצבוב מחדש לטווח קצר של שריר השלד של שריר השלד Auris longus

למדו כיצד לנהל אנטגוניסטים מוסקריניים תת-עוריים לשריר LAL בעכברים ולבצע צביעת immunostaining משולשת. שיטה זו מאפשרת לחקור שינויים מורפולוגיים בחיבורים נוירומוסקולריים ותפקיד הקולטנים במחלות נוירומוסקולריות.

תת עורי מינהל היריבים Muscarinic ו Triple-Immunostaining של השריר Levator Longus Auris של עכברים

גלה סרטונים נוספים