גירוי אופטוגנטי ורישום אלקטרופיזיולוגי של אירועים סינפטיים בפרוסות מוח של חולדות

התחילו עם פרוסת מוח של חולדה שמכילה את אזור נוירוני המטרה שמחובר לאקסון רגיש לאור מאזור אחר במוח.

הנח את הפרוסה בתא ההקלטה השקוע ואבטח אותה עם עוגן פרוסה.

תחת מיקרוסקופ, אתר את השכבה הרצויה וזהה את נוירון הפירמידה המטרה.

הרם את מטרת המיקרוסקופ כדי ליצור מניסקוס עם משטח הפרוסה.

הורד מיקרופיפטה מזכוכית מלאה בתמיסת הקלטה תוך-תאית לתוך המניסקוס הזה.

גע בתא הפירמידלי המזוהה עם קצה הפיפטה כדי ליצור שקע בקרום.

מרחו יניקה ליצירת חותם.

הגדל את היניקה עד שהקרום נקרע, ויוצר תצורת תא שלם.

בעזרת מקור אור רכוב, החל פולסי אור על הפרוסה.

פולסי אור אלה מפעילים פוטנציאל פעולה באקסון הרגיש לאור, ומשחררים נוירוטרנסמיטורים בסדק הסינפטי.

רשום את תגובות הנוירונים הפירמידליים לשחרורים אלה כדי לנתח את היעילות הסינפטית.

לזיהוי תא יעד, מקמו את הפרוסה בתא ההקלטה ושיתקו אותה באמצעות עוגן פרוסה. בהגדלה נמוכה, באמצעות תאורת אינפרא אדום, נווט לשכבת LEC 5. לאחר מכן, שנה למטרת טבילה במים בהגדלה גבוהה, וזהה את הנוירונים הפירמידליים.

סמן את מיקום התא על הצג בעזרת סרט. לאחר מכן, כדי ליצור מהדק תיקון של תא שלם, לייצר מיקרו-פיפטה מזכוכית בורוסיליקט ולמלא אותו בתמיסת הקלטה תוך-תאית. הנח את המיקרופיפטה המלאה במחזיק האלקטרודה, והפעל לחץ חיובי על ידי נשיפה חזקה לתוך פיה המחוברת ליציאת הצד של מחזיק האלקטרודה.

הרם את מטרת המיקרוסקופ כך שייווצר מניסקוס, והכנס את האלקטרודה למניסקוס עד שניתן יהיה לראות אותה במיקרוסקופ. פתח את חלון בדיקת האיטום וקבע אם התנגדות הפיפטה היא שלושה עד חמישה מגה-אוהם. לאחר מכן, גע בתא המזוהה עם קצה פיפטה וכתוצאה מכך נוצר שקע בקרום התא.

לאחר מכן, הפעל לחץ שלילי על ידי יניקה בפיה, והגביר את התנגדות הפיפטה. המשך להפעיל לחץ שלילי בהדרגה עד שקרום התא נקרע, וכתוצאה מכך מעברי קיבול של תא שלם. כדי להיכנס לתצורת מהדק זרם, השתמש בנורת LED מותקנת המכוונת לנתיב האור של המיקרוסקופ עם קוביות פילטר ואופטיקה מתאימה, והפעל פולסי אור על הפרוסה באמצעות המטרה פי 40. ספק רכבות של פולסי אור מרובים ב-5 הרץ, 10 הרץ ו-20 הרץ כדי לחקור את תכונות השחרור הפרה-סינפטי.