קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליישם מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית מתקדמת כדי לנטר דינמיקה מרחבית-זמנית של אירועי איתות במהלך חישה כימותרפית בתאי דיום דיסקואידים של דיקטיוסטליום מוכשרים לראשונה. לאחר מכן, מדמים שיפוע מושך כימותרפיה מבוקר כדי ליצור קשר ליניארי בין ריכוז המושך הכימותרפי לבין מושך הכימותרפיה בעוצמה פלואורסצנטית. השלב השלישי הוא השגת מערכת תאים נייחת להדמיית אירועי איתות המעורבים בחישת שיפוע מחזורית של A MP.

השלב האחרון הוא ניטור בו-זמנית של שני אירועי איתות מבוקרים G PCR R בתאים חיים, הפעלת חלבון G הטרוטרימרי וייצור PIP שלוש. בסופו של דבר שינויים מרחביים-זמניים בעוצמות הקרינה בתאים בודדים המדומים עם מושך כימותרפיה. ניתן לדמיין A MP מחזורי באמצעות הדמיית תאים חיים עם מיקרוסקופיה קונפוקלית מתקדמת.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לאפשר לנו לקבל מידע זמני מרחבי על אירועי איתות בתאי חיים. מדידות אורח חיים אלה מאפשרות הבנה טובה יותר כיצד רשת האיתות A-G-P-C-R מסוגלת לזהות מרכיב מושך כימותרפיה ולייצר תגובות נאותות. מדגים את ההליך יהיה ד"ר שו, שהוא מומחה בשיטות הדמיית אורח חיים ליצירת תאי dium dsco שהם כימוטקטיים למושך הכימותרפיה תאי קציר מחזוריים A MP הגדלים ב-D שלוש מדיה טריכית מתרבית רועדת ב-22 מעלות צלזיוס.

שטפו תאים פעמיים במאגר התפתחותי שאינו תזונתי על ידי צנטריפוגה ב-400 גרם למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, ה-resus משהה את התאים במאגר DB בצפיפות של פי שניים פי 10 מהתאים השביעיים למיליליטר. העבירו 20 מיליון תאים ב-10 מיליליטר של חיץ התפתחותי לבקבוק של 250 מיליליטר, ולאחר מכן נערו את התאים ב-100 סל"ד ב-22 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר מכן העבירו 100 מיקרוליטר של 7.5 מיקרו-מולרי מחזורי A MP ל-10 מיליליטר התאים כל שש דקות במהלך שש השעות הבאות כדי להשיג ריכוז סופי של 75 מחזורי מחזורי A MP. כעת אספו את התאים הכימותרפיים המחזוריים A MP על ידי צנטריפוגה הפעם ב-200 Gs, ולאחר מכן השעו מחדש את התאים עם מאגר DB המכיל 2.5 מילי-מולרי קפאין. מנערים שוב את התאים בחום של 22 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הפעם ב -200 סל"ד כדי להמליח את התאים לכימוטקסיס.

ראשית ממלאים מחדש מיקרו פיפטה בתמיסה טרייה של 30 מיליליטר של מיקרו-מולרית מחזורית אחת A MP ואלקסה 5 94 ב-0.1 מיקרוגרם למיקרוליטר במאגר DB. לאחר מכן חבר קצה Femto למחזיק מיקרופיפט וחבר את הצינור למנגנון אספקת לחץ. כדי ליצור שיפוע יציב, חבר את מכלול המיקרו פיפטה למניפולטור מיקרו ממונע.

מלאו תא טכני של מעבדה באר אחת בשישה מיליליטר של מאגר DB ולאחר מכן הרכיבו את החדר מעל עדשת שמן פי 40 על מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות מרכז האופטיקה של Brightfield, קצה הפמטו בשדה הראייה. לאחר מכן, הפעל את אספקת הלחץ והגדר את לחץ הפיצוי ל-70 הקטור פסקל כדי ליצור שיפוע של תערובת A MP Alexa 5 94 המחזורית. דמיין את שיפוע ה-A MP המחזורי על ידי ניטור התערובת של הריכוז הרצוי של פלואורסצנציה מחזורית A MP ו-Alexa 5 94 באמצעות עירור עם קו לייזר של 543 ננומטר.

לבסוף, השתמש בפונקציית המיקום האוטומטי של המיקרו מניפולטור כדי למקם את המיקרו פיפטה במיקומים הרצויים ולהגדיר את המיקום הראשון, השני והשלישי על מנת לתפעל את השיפוע שאליו נחשפים התאים. לאחר הטיפול בקפאין, הסר כמות גדולה של תאים וכדור את התאים ב-500 גרם למשך שלוש דקות. בטמפרטורת החדר, הסר את המאגר ודלל את התאים לחמש פעמים 10 מהתאים החמישיים למיליליטר.

עם בופר DB טרי המכיל 2.5 מילי-מולרי קפאין. לאחר מכן יש למרוח מיליליטר אחד של מתלה התא על תא באר יחיד. לאחר שאפשרתם לתאים להיצמד למשך 10 דקות, הסירו בזהירות את המאגר כדי להסיר תאים לא מחוברים ולאחר מכן החליפו באותו נפח של מאגר DB טרי בקפאין כדי להתחיל בהדמיה, אתרו את התאים הרצויים מתחת למיקרוסקופ.

לאחר מכן לעקוב אחר הדינמיקה של רכיבי האיתות בתאים שנחשפו לשיפוע קבוע. טפל בתאים עם חמישה מיקרו-מולרים LA truculent B במשך 10 דקות לפני כל ניסוי. סכימה זו מציגה מסלול איתות קצר של חישה כיוונית בסרט זה.

ניתן לראות כיצד שיפוע A MP מחזורי גורם לכימוטקסיס מהיר של תאי D, תאים המבטאים את בדיקת PIP שלוש. P-H-G-F-P מופיעים בירוק. השיפוע כפי שמוצג על ידי Alexa 5 94 מופיע באדום. הנה.

שיטה פשוטה להשגת קשר ליניארי בין ריכוז A MP מחזורי לעוצמת צבע פלואורסצנטי. Alexa 5 94 על ידי סדרת דילול של שני מיקרו-מולרי מחזורי A MP מעורבב עם 10 מיקרוגרם למיליליטר של Alexa. 5 94 מוצג.

לאחר מכן, מודגמת באופן גרפי דרך קלה לקבוע מדידה כמותית של ריכוז A MP המחזורי של שיפוע בעוצמת Alexa 5 94. איור זה מראה כיצד תאים שהתנועתיות שלהם דוכאה על ידי מעכב פילמור אקטון עדיין שומרים על יכולת החישה הכיוונית שלהם. התאים מבטאים את בדיקת ה-PIP שלוש, P-H-G-F-P ונראים ירוקים בעוד שהשיפוע באדום מוצג על ידי Lexi 5 94.

בסרט זה, ניתן לראות כיצד השימוש במערכת תאים פשוטה לא מקוטבת וגירוי מחזורי A MP הניתן למניפולציה יכול לענות על שאלות בסיסיות של חישה כיוונית. כדי להדגים את היישום של הדמיית תאים חיים ברזולוציה מרחבית בקצב גבוה, כאן, תא בירוק המציג ביטוי דו-פאזי של PIP 3. בתגובה לחשיפה לשיפוע מחזורי קבוע A MP באדום מוצג.

תמונה זו מציגה את אזורי העניין למדידת הקינטיקה של ייצור PIP 3. הקינטיקה של ייצור PIP 3 בחלק הקדמי והאחורי של התאים בעת חשיפה לשיפוע קבוע מוצגת כאן עם ייצור PIP 3 מלפנים ומאחור, המיוצגים בשחור ואפור בהתאמה. באמצעות הדמיית תאים חיים, מדדנו באופן שיטתי את הדינמיקה של רשת איתות ספציפית לחישה כיוונית מגירוי מחזורי A MP ועד לייצור PIP 3.

סכימה זו מציגה את רשת האיתות של חישה כיוונית מגירוי מחזורי A MP לייצור PIP 3. הקינטיקה של כל רכיב מוצגת בקו באותו צבע. באיור ראשון זה, כיצד גירוי מחזורי A MP המופעל באופן אחיד מפעיל הפעלה מתמשכת של חלבון G, המפעיל ייצור PIP 3 חולף מיוצג בסרט זה.

קשת של תמונות של תאי G ו-pH מראה שגירוי מחזורי A MP המופעל באופן אחיד מפעיל הפעלה מתמשכת של חלבון G בפריפריה של התא, מה שמפעיל בו זמנית ייצור PIP 3 חולף. כאן, מוצגת הקינטיקה של הפעלת חלבון G וייצור PIP 3 על גירוי A MP מחזורי המופעל באופן אחיד. בזמן שמנסים ניסויים אלה, חשוב לזכור שהמפתח הוא להשיג תאים תגובתיים, רקע גנטי שונה של התאים ותנאים סביבתיים.

תנאי רכישת הדמיה משנים את הפיזיולוגיה של התא ועלולים לגרום לתא להגיב פחות. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם מודלים חישוביים כדי לענות על שאלות נוספות כגון כיצד אינטראקציות דינמיות בתוך רשת איתות גורמות להתנהגות תא. שיטות אלה סוללות את הדרך לחוקרים בתחום מיסי כימותרפיה אוקריוטיים.

אנו יכולים לפתח מודל חישובי של חישה כימואטרקנטית. ניתן להשתמש במודל זה כדי לדמות את הדינמיקה של אירוע איתות. יחסי הגומלין בין חידוד המודל למדידת אורח החיים יכולים להוביל להבנה מעמיקה יותר של מיסי כימותרפיה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אנו מקווים שיש לכם הבנה טובה יותר כיצד ליישם מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית מתקדמת כדי לנטר אירועי איתות בתאי חיים. אני מקווה שתוכל ליישם את השיטה הזו במחקר שלך.