Name: קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: למד שיטות הדמיה בזמן אמת לחקירת כימוטקסיס בתאי Dictyostelium discoideum באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה מתקדמת. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקת אירועי איתות במרחב ובזמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי קרן עירונית מ NIAID, NIH.

1. הכנת התאים המוסמכת chemotactic של discoideum Dictyostelium <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר תאים ד discoideum כי הם chemotactic למחנה chemoattractant, תאים הקציר הגוברת D3-T מדיה עשירה מתרבות רועד ב 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים חיץ שאינו מזין התפתחותי (חיץ DB המכיל 5 mM Na 2 HPO 4, 5 מ"מ KH 2 PO 4, 2 מ"מ MgCl 2, 0.1 מ"מ CaCl 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות תאים חיץ DB בצפיפות של 2x10 7 תאים / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake 10 תאים מ"ל בבקבוק 250 מ"ל ב 100 סל"ד ב 22 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספק 100 μl של המניה 7.5 מיקרומטר cAMP ל 10 תאים מ"ל כל שש דקות מעל 6 שעות כדי להשיג הריכוז הסופי של מחנה 75 ננומטר, תהליך המיועד לטיפול cAMP פועם. לאחר 5-6 שעות של טיפול cAMP פועם, ד תאים discoideum להיות chemotactic המוסמכת שיפוע לכיוון המחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 200 גרם במשך 5 דקות ואז התאים resuspend עם חיץ DB המכיל קפאין 2.5 מ"מ, וללחוץ על 200 סל"ד ב 22 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי basolate התא למצב chemotactic. </li></ol> 2. הדמיה chemotaxing תאים צבע chemoattractant גלוי למניפולציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למילוי micropipette עם פתרון מוכן טרי 30 μl של מחנה 1 מיקרומטר ו אלקסה 594 ב 0.1μg/μl במאגר DB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את Femtotip לבעל micropipette ולחבר את צינורות אל מנגנון אספקת הלחץ, מערכת Eppendorf FemtoJet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את הרכבה micropipette כדי micromanipulator (Eppendorf TransferMan NK2) ממונע micromanipulator לתת לחץ קבוע על מנת ליצור שיפוע יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תא אחד טוב LabTek מלא 6 מ"ל של חיץ DB על העדשה שמן 40X על מיקרוסקופ confocal ולהשתמש בהיר בתחום האופטיקה, במרכז Femtotip לשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את אספקת הלחץ ולהגדיר את הלחץ פיצוי (PC) עבור 70 hPa להקים שיפוע של התערובת 594 cAMP / Alexa. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו מפל cAMP על ידי ניטור תערובת של הריכוז הרצוי של המחנה אלקסה 594 הקרינה באמצעות עירור עם קו 543 ננומטר לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש אוטומטי מיצוב תפקידו של micromanipulator לשים micropipette לעמדות הרצוי ולהגדיר אותם 1 מיקום, מיקום 2, ומיקום 3 לתפעל את שיפוע אשר תא חשופים. </li></ol> 3. תא נייח מערכת nonpolarized מקלה אירועים הדמיה איתות מעורבים במחנה שיפוע חישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הטיפול בקפאין, להסיר aliquot של תאים צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חוצץ ו לדלל התאים 5x10 5 תאים / מ"ל עם חיץ DB טרי המכיל קפאין 2.5 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 1 מ"ל של השעיה תא לתא בודד טוב או 0.4 מ"ל היטב בכל תא ארבעה באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לדבוק תאים עבור 10 דקות, בזהירות פיפטה את החיץ להסיר תאים פנויים ולהחליף עם נפח זהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את התאים תחת מיקרוסקופ הרצוי ולהתחיל הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ניסוי שנועד לפקח על הדינמיקה של איתות רכיבים בתאים לחשוף את שיפוע יציב, לטיפול בתאים עם 5.0 מיקרומטר (הריכוז הסופי) Latrunculin ב 10 דקות לפני הניסויים. </li></ol> 4. ניטור סימולטני heterotrimeric חלבון G הפעלה PIP 3 הייצור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cAMP פועם לפתח תאים שיתוף להביע GαCFP ו YFPGβ (תאים G) ותאי להביע PIP 3 אינדיקטור PH-GFP (תאים PH) 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שני סוגי תאים עם יחס 1:1 ו צלחת אותם לתאי אחד טוב או 4-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור ושמור את טביעת האצבע פליטת התייחסות עקומת CFP, YFP ו-GFP באמצעות רכישת Lambda מצב סטאק בטווח הספקטרום מ 464 ל 624 ננומטר עם רוחב של 10 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל תמונה חלבון G הפעלה בתאים G ו-3-PIP ייצור תאים עם PH באמצעות רכישת אותו במצב Lambda סטאק בטווח הספקטרום 464-544 ננומטר עם 10 ננומטר במרווחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לתפקד unmixing שכבות של תוכנת 510META Zeiss באמצעות הציל CFPand YFP ואת טביעות אצבעות פליטת מתמטית כדי לחשב את התרומה של כל fluorophore בערימה Lambda להפריד את CFP ועוצמת YFP לאפיקים בודדים G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם אסטרטגיה דומה, להחיל unmixing פונקציה לינארית באמצעות GFP ניצלו פליטה טביעות אצבעות רקע מתמטי לחישוב עוצמת ה-GFP בתאים PH. </li></ol> 5. נציג התוצאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת מודל מצוינת של ד discoideum עבור chemotaxis GPCR בתיווך. אמבה חברתיים, ד discoideum תערוכות chemotaxis בולט במהלך מחזור החיים. בשל יתרונות גנטיים ביוכימיים שלה, ד ד מספק של עוצמהystem ללמוד chemotaxis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Chemotaxis של תאים תחת שדות chemoattract גלוי למניפולציה. הנה, אנחנו הראשונים להראות מתודולוגיה פשוטה כדי להשיג קשר לינארי בין מחנה הריכוז לבין עוצמת צבע פלואורסצנטי אלקסה 594 על ידי שורה דילול של מחנה 2 מיקרומטר מעורבב עם 10 מיקרוגרם / מ"ל Alexa 594 (איור 2 א). הבא, אנחנו מספקים דרך קלה כדי להמחיש את שיפוע יתר על כן, להקים מדידה כמותית למחנה הריכוז של צבע מעוצמת Alexa 594 (איור איור. 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנועתיות התא הוא זוגיים עם הקיטוב תא חישה כיוונית. מעכב פילמור אקטין מבטלת קיימים הקוטביות מורפולוגיים גם מונע תנועת התא תוך שמירה על יכולת של התאים של חישה כיוונית (איור 3A). התעסוקה של גירוי cAMP גלוי למניפולציה ערבויות קלט, למשל גירויים אחיד או שיפוע. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של חלוקה מחדש cAMP-Induced של רכיבים איתות מפתח במנגנון שיפוע חישה. הדינמיקה spatiotemporal מדודים של רכיבים אלה איתות מאפשרים לנו להבין כיצד רשת איתות משיגה הסתגלות גירויים אחיד תוך יצירת תגובות ביוכימיות מקוטב אל הדרגתיים (איור 3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידות מערכתית של קינטיקה של chemosensing רשת איתות בחשיפה שיפוע קבוע. זה קריטי על מנת למדוד את הדינמיקה / קינטיקה של כיוונית חישה איתות רכיבים להבין איך כל מרכיב תורם להקמת קיטוב תאיים, כאשר התאים חווים שיפוע הראשון. יישום של הדמיה תא חי עם החלטה הקצב מרחבית גבוהה, אנחנו הראשונים מראים ייצור biphasic PIP3 של התא שבו הוא נחשף מפל cAMP יציב (איור 4A-C). יישום הדמיה תא חי, יש לנו למדוד באופן שיטתי את הדינמיקה של כיוונית חישה רשת איתות ספציפיים גירוי cAMP לייצור PIP3 (איור 4D, E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניטור סימולטני heterotrimeric חלבון G הפעלה PIP 3 הייצור על גירוי cAMP אחיד. פורסטר תהודה העברת אנרגיה (מקוצר סריג) מספק גישה יעילה לעקוב heterotrimeric הפעלת חלבון G (דיסוציאציה) על גירוי המחנה. כאן, אנו תיאר מערכת נוח וקל לאמץ מדידה בו זמנית של הפעלת חלבון G heterotrimeric 3 הייצור PIP על ידי ניטור סריג שינוי טרנסלוקציה בממברנה של PIP 3 בדיקה, PH-GFP בסול ותאי PH, בהתאמה (איור 5 ). גירוי cAMP אחיד מעורר הפעלת חלבון G בעוד מתמשך אשר מעורר ייצור חולף 3 PIP. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1: מערכת מודל מצוינת של ד discoideum עבור chemotaxis GPCR בתיווך. א Scheme מציגה מסלול איתות קצר של חישה כיוונית. שיפוע ב cAMP גורם chemotaxis המהירה של ד discoideum תאים. תאים להביע 3 PIP בדיקה, PH-GFP (ירוק). צבע (אדום) הוא מדמיין על ידי אלכסה 594. בר סולם = 50μm. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2: Chemotaxis של תאים תחת שדות chemoattract גלוי למניפולציה. גרף א 'מציג מערכת יחסים בין ליניארי למחנה הריכוז והעוצמה של פלורסנט לצבוע אלקסה 594 על ידי שורה דילול של מחנה 2 מיקרומטר מעורבב עם 10 מיקרוגרם / מ"ל אלקסה 594. מדידה כמותית ב למחנה הריכוז של צבע על ידי הקשר הליניארי למחנה הריכוז והעוצמה של פלורסנט לצבוע אלקסה 594 א ' <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3: תנועתיות התא הוא זוגיים עם הקיטוב תא חישה כיוונית. תמונה א 'מראה כי התאים ללא תנועה על ידי טיפול של פילמור אקטין מעכב Latrunculin B לשמור על יכולת חישה של כיווניות. תאים להביע 3 PIP בדיקה, PH-GFP (ירוק). צבע (אדום) הוא מדמיין על ידי אלכסה 594. B. למניפולציה גירויים תנועה cAMP מערכת התא מאפשר לענות על שאלות המפתח של חישה כיוונית. בר סולם = 10μm. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4: מדידות מערכתית של קינטיקה של chemosensing רשת איתות בחשיפה שיפוע קבוע. א מונטאז' מראה PIP biphasic 3 הייצור (ירוק) של התא, אשר נחשף מפל cAMP יציב (אדום). B. תמונה המציגה את האזורים של אינטרסים (ROIs) למדידת קינטיקה של ייצור PIP 3 הציג ב C. C . קינטיקס oו 3 ​​PIP ייצור התאים נחשפים שיפוע קבוע. ד Scheme מראה את רשת איתות של חישה כיוונית מן גירוי cAMP לייצור PIP 3. קינטיקה שלהם בחשיפה שיפוע קבוע מוצג הקווים באותו צבע מוצק E. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5: ניטור סימולטני רב אירועים של רשתות איתות GPCR. תוכנית א 'מראה מדידה בו זמנית של הפעלת חלבון G heterotrimeric 3 הייצור PIP על ידי ניטור סריג שינוי טרנסלוקציה בממברנה של PIP3 בדיקה, PH-GFP בסול ותאי PH, בהתאמה. מונטאז' של תמונות ב קשת של G ו-PH מראה תאים כי גירוי cAMP אחיד מעורר הפעלת חלבון G מתמשך על התא הפריפריה, בעוד אשר מעורר ייצור חולף PIP3. נקודות הזמן הן לפני (0s) ואחרי גירוי עבור 4.9s, 10.2s ו 20.4s. ג קינטיקה של הפעלת חלבון G ו PIP3 הייצור על גירוי מחנה אחיד.

<ol><li>Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+regulation+of+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial regulation of chemotaxis.</a> Dev Cell. 3, 469-469 (2002).</li>
<li>Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+leukocyte+chemoattractant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors.</a> Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).</li>
<li>Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-linked+signaling+pathways+control+the+developmental+program+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium.</a> Neuron. 12, 235-235 (1994).</li>
<li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%2C+chemokine+receptors+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-1 (2008).</li>
<li>Meier-Schellersheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+local+regulation+in+chemosensing+revealed+by+a+new+molecular+interaction-based+modeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method.</a> PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).</li>
<li>Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+mechanism+of+a+GPCR+and+a+heterotrimeric+G+protein+during+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Sci Signal. 3, 71-71 (2010).</li>
<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+single+live+cells+reveals+spatiotemporal+dynamics+of+multistep+signaling+events+of+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).</li>
<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+controlled+inhibitory+mechanisms+are+involved+in+eukaryotic+GPCR-mediated+chemosensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing.</a> J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).</li>
<li>Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+G+protein+betagamma+complex+in+living+cells+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis.</a> Science. 287, 1034-1034 (2000).</li>
<li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2408 (2001).</li>
<li>Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phosphatidylinositol+3%27+kinase+and+a+downstream+pleckstrin+homology+domain-containing+protein+in+controlling+chemotaxis+in+dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium.</a> J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).</li>
<li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+PLC-beta2+and+-beta3+and+PI3Kgamma+in+chemoattractant-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction.</a> Science. 287, 1046-1046 (2000).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).</li>
<li>Meili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattractant-mediated+transient+activation+and+membrane+localization+of+Akt%2FPKB+is+required+for+efficient+chemotaxis+to+cAMP+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium.</a> EMBO J. 18, 2092-2092 Forthcoming.</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein+signaling+events+are+activated+at+the+leading+edge+of+chemotactic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells.</a> Cell. 95, 81-81 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+regulation+of+3-phosphoinositides+by+PI+3-kinase+and+PTEN+mediates+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis.</a> Cell. 109, 611-611 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PTEN+mediates+sensing+of+chemoattractant+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients.</a> Cell. 109, 599-599 (2002).</li>
<li>Haastert, P. J. V. an, Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%3A+signalling+the+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תהליכי להגיע לשלב המוסמכת chemotactic של תאים עבור סוג ד בר תאים discoideum, זה לוקח בערך 5 ~ 6 שעות פועם פיתוח בטמפרטורת החדר כדי לגרום להם לשלב היטב chemotactic מוסמך שבמהלכו התאים להציג מורפולוגיה הסלולר מקוטב היטב נדידת תאים מהיר (איור 1). מספר גורמים, כמו מחנה ריכוז פועם, טמפרטורה, רקע גנטי שונה, עשוי להשפיע על תהליך ההגעה לשלב המוסמכת chemotactic. שיפוע מדריכים cAMP התאים לנוע לעבר מקור של המ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> D3-T צמיחה מדיה </td><td> KD רפואי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> קפאין </td><td> סיגמא </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Latrunculin B </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> אלכסה 594 </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> cAMP </td><td> סיגמא </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ChronTrol XT לתכנות טיימר </td><td> ChronTrol קורפ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miniplus 3 peristaltic משאבה </td><td> Gilbson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פלטפורמה רוטרי שייקר </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet אספקת הלחץ microcapillary </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> סינגל וארבע היטב Lab-Tek II coverglass לתאי </td><td> Nalge Nunc הבינלאומי </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 META או מיקרוסקופ פלואורסצנטי המקבילה </td><td> Zeiss </td><td></td><td> 40X 1.3 NA או 60x 1.4 NA-DIC שמן תוכנית Neofluar אובייקטיבי עדשה </td></tr><tr><td> אולימפוס X81 או שווה ערך </td><td> אולימפוס </td><td></td><td> דרוש 100x 1.47 NA העדשה TIRF אובייקטיבי </td></tr></tbody></table>

קולטן הדמיה g-חלבון יחד (gpcr) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של chemotaxis discoideum dictyostelium</em

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

התאים האיקריוטים רבים ניתן לזהות הדרגתיים של אותות כימיים בסביבה שלהם ולהעביר בהתאם 1. הגירה זו תא מודרך הוא כאמור chemotaxis, שהוא חיוני עבור תאים שונים כדי לבצע את תפקידם כגון סחר של תאים חיסוניים דפוסים של תאים עצביים 2, 3. משפחה גדולה של חלבון ה-G-מצמידים קולטנים (GPCRs) מזהה פפטידים קטנים משתנה, המכונה chemokines, לכוון את נדידת תאים in vivo 4. המטרה הסופית של chemotaxis המחקר היא להבין כיצד החושים מכונות GPCR chemokine הדרגתיים בקרות אירועים איתות המובילים chemotaxis. לשם כך אנו משתמשים בטכניקות הדמיה לפקח, בזמן אמת, ריכוזי spatiotemporal התנועה, chemoattractants תא שיפוע של chemoattractant, בתיווך GPCR הפעלה של חלבון ה-G-heterotrimeric, ואירועים איתות תאיים המעורבים chemotaxis של התאים האיקריוטים 5-8 . האורגניזם אוקריוטים פשוטה, discoideum Dictyostelium, מציג התנהגויות chemotaxic הדומים לאלה של לויקוציטים, וד &#39; discoideum היא מערכת מודל מפתח לחקר chemotaxis האיקריוטים. כפי חופשית חיים אמבות, ד תאים discoideum לחלק במדיום עשיר. עם רעב, תאים להזין תוכנית התפתחותית שבה הם מצטברים דרך המחנה בתיווך chemotaxis כדי ליצור מבנים multicullular. רכיבים רבים מעורבים chemotaxis למחנה זוהו ד discoideum. הכריכה של המחנה GPCR (cAR1) גורמת ניתוק של heterotrimeric G-חלבונים לתוך Gγ ואת יחידות משנה Gβγ 7, 9, 10. יחידות משנה Gβγ להפעיל ראס, אשר בתורו מפעיל PI3K, המרת PIP 2 לתוך PIP 3 על קרום התא 11-13. PIP 3 לשמש אתרי קישור החלבונים עם הומולוגיה pleckstrin (PH) תחומים, ובכך לגייס אלו חלבונים בקרום 14, 15. ההפעלה של רצפטורים cAR1 שולט גם עמותות הממברנה של PTEN, אשר dephosphorylates PIP PIP 2 ל 3 16, 17. מנגנונים מולקולריים הם באבולוציה ב chemotaxis chemokine GPCR בתיווך של תאים אנושיים כגון נויטרופילים 18. אנו מציגים מהשיטות הבאות לחקר chemotaxis ד discoideum תאים. 1. הכנת התאים המרכיבים chemotactic. 2. Chemotaxis הדמיה של תאים מפל cAMP. 3. ניטור הפעלת GPCR המושרה של heterotrimeric G-חלבון בתאים חיים אחת. 4. הדמיה chemoattractant-PIP מופעלות דינמי 3 תגובות בתאים חיים יחיד בזמן אמת. שיטות שפותחו שלנו הדמיה ניתן ליישם מחקר chemotaxis של לויקוציטים אנושיים.

כאן אנו מתארים מפורט לחיות הדמיה תא שיטות החקירה chemotaxis. אנו מציגים שיטות מיקרוסקופיות הקרינה לפקח על הדינמיקה של spatiotemporal איתות אירועים בתאים נודדות. מדידה של אירועים איתות מאפשר לנו עוד להבין כיצד רשת GPCR-איתות משיגה שיפוע חישה של chemoattractants בקרות כיווני ההגירה של התאים האיקריוטים.

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em

תאים איקריוטיים רבים יכולים לזהות מדרגי ריכוז (גרדיאנטים) של אותות כימיים בסביבתם ולהתרחב בהתאם 1. נדידה מודרכת זו של תאים מכונה...

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית מתקדמת כדי לנטר דינמיקה מרחבית-זמנית של אירועי איתות במהלך חישוש כימי בתאי dictyostelium discoideum. ראשית, מכינים תאי dictyostelium discoideum בעלי יכולת כימותקסית. לאחר מכן, מדמיינים גרדיאנט מבוקר של חומר מושך כימי כדי לבסס קשר ליניארי בין ריכוז החומר המושך הכימי לבין עוצמת הפלואורסצנציה של החומר המושך הכימי. השלב השלישי הוא השגת מערכת תאים שאינם ניידים לצורך דימוי של אירועי איתות המעורבים בחישוש של גרדיאנט cyclic AMP.השלב הסופי הוא ניטור סימולטני של שני אירועי איתות מבוקרי G PCR R בתאים חיים: הפעלת G-protein הטרוטרימרי וייצור של PIP three. לבסוף, ניתן לבחון שינויים מרחביים-זמניים בעוצמות הפלואורסצנציה בתאים בודדים שעוברו בסימולציה עם chemo attractant. ניתן להדמיות של Cyclic A MP באמצעות דימוי תאים חיים במיקרוסקופיה קונפוקלית מתקדמת.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו להשיג מידע מרחבי-זמני על אירועי איתות בתאים חיים. מדידות בזמן אמת אלו מאפשרות הבנה טובה יותר של האופן שבו רשת האיתות של A-G-P-C-R מסוגלת לזהות רכיב מושך כימית ולייצר תגובות מתאימות. את הפרוצדורה תדגים ד"ר Shu, מומחית בשיטות דימות בזמן אמת. כדי להפיק תאי dsco dium בעלי כיमोटקסיס לרכיב המושך כימית cyclic A MP, אספו תאים הגדלים במצע D three trich מתרבית ניעורה בטמפרטורה של 22 °C.שטפו את התאים פעמיים בבופר פיתוח ללא רכיבי תזונה (non nutrient developmental buffer) באמצעות סנטריפוגציה ב-400 Gs למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, השהו מחדש את התאים בבופר DB בריכוז של 2×10⁷ תאים למיליליטר. העבירו 20 מיליון תאים ב-10 מיליליטר של בופר פיתוח לבקבוק של 250 מיליליטר, ולאחר מכן נערערו את התאים ב-100 RPM ב-22 °C למשך שעה אחת.לאחר מכן, הוסף 100 µL של תמיסת מקור cyclic AMP בריכוז 7.5 µM ל-10 mL של תאים בכל שש דקות במהלך שש השעות הבאות, כדי להגיע לריכוז סופי של 75 nM של cyclic AMP. כעת אסוף את התאים שהפכו למסוגלים לתגובת מושכיות כימית (chemoattractant competent cells) באמצעות סרכזגציה, הפעם ב-200 ×g, ולאחר מכן השהה את התאים שוב בבופר DB המכיל 2.5 mM קפאין. נער את התאים שוב בטמפרטורה של 22 °C למשך 20 דקות, הפעם ב-200 RPM, כדי להכין את התאים לתהליך הכימותקסיס (chemotaxis).ראשית, מלאו מחדש מיקרופיפט בתמיסה שהוכנה טרייה בנפח 30 milliliter של cyclic A MP בריכוז one micromolar ו-Alexa 5 94 בריכוז 0.1 micrograms per microliter בבופר DB. לאחר מכן, חברו Femto tip למחזיק מיקרופיפט וחברו את הצינורית למערכת אספקת לחץ. כדי ליצור מדרג ריכוזים יציב, חברו את מכלול המיקרופיפט למיקרו-מניפולטור ממונע.מלאו תא מעבדה בעל באער אחת ב-6 milliliters של DB buffer, ולאחר מכן התקינו את התא מעל עדשה שמןית 40x במיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות אופטיקת Brightfield, כאשר ה-Femto tip נמצא במרכז שדה הראייה. לאחר מכן, הפעילו את אספקת הלחץ והגדירו את לחץ הפיצוי ל-70 Hector Pascals כדי ליצור גרדיאנט של תערובת cyclic A MP ו-Alexa 5 94. הדמינו את הגרדיאנט של ה-cyclic A MP על ידי ניטור התערובת בריכוז הרצוי של cyclic A MP ופלואורסצנציית Alexa 5 94 באמצעות עירור עם קו לייזר של 543 nanometer.לבסוף, השתמש בפונקציית המיקום האוטומטית של המיקרו-מניפולטור כדי להביא את המיקרו-פיפט למיקומים הרצויים, והגדר את מיקום אחת, מיקום שתיים ומיקום שלוש כדי לשלוט במדרג הריכוזים (gradient) אליו נחשפים התאים. לאחר הטיפול בקפאין, הוצא מנה (aliquot) של תאים ומרכז אותם בצנטריפוגה ב-500 Gs למשך שלוש דקות. בטמפרטורת החדר, הסר את הבאפר ודלל את התאים לריכוז של 5 × 10⁵ תאים למילליליטר.עם באפר DB טרי המכיל 2.5 millimolar caffeine. לאחר מכן, העבר מיליליטר אחד של תרחיף התאים לתא בודד. לאחר המתנה של 10 דקות להיצמדות התאים, שאב בזהירות את הבאפר כדי להסיר תאים שלא נצמדו, והחלף אותו בנפח זהה של באפר DB טרי עם caffeine כדי להתחיל בדימוי; אתר את התאים הרצויים תחת המיקרוסקופ.לאחר מכן, כדי לנטר את הדינמיקה של רכיבי השילוח בתאים שנחשפו למדרג ריכוזים קבוע. יש לטפל בתאים ב-5 µM LA truculent B למשך 10 דקות לפני תחילת הניסויים. סכימה זו מציגה מסלול שילוח קצר של חיש את הכיוון בסרטון זה.ניתן לראות כיצד מדרג ריכוזים של cyclic AMP מעורר כימותקסיס מהיר של תאי D discost, תאים המבטאים את הגשוש PIP three. P-H-G-F-P מופיע בירוק. המדרג, כפי שמוצג באמצעות Alexa 5 94, מופיע באדום.שיטה פשוטה להשגת קשר ליניארי בין ריכוז cyclic AMP לבין עוצמת צבע פלואורסצנטי. מוצגת סדרת מיהולים של 2 µM cyclic AMP המעורבבים עם 10 µg/mL של Alexa 594.בשלב הבא, מוצגת באופן גרפי דרך פשוטה לקביעת מדידה כמותית של ריכוז cyclic AMP במפלס ריכוזים (gradient) באמצעות עוצמת Alexa 594. דמות זו מראה כי תאים שמוטילויותם דוכאה על ידי latrunculin B, מעכב פולימריזציה של actin, עדיין שומרים על יכולת החשת הכיוון שלהם. התאים מביעים את גשש PIP3, P-H-GFP, ומופיעים בירוק, בעוד שהמפלס בריכוזים באדום מוצג באמצעות Alexa 594.בסרטון זה ניתן לראות כיצד שימוש במערכת תאים פשוטה שאינה מקוטבת ובגירוי מבוקר של cyclic AMP יכולים לתת מענה לשאלות יסודיות בנוגע לתחושה כיוונית. כדי להדגים את היישום של דימוי תאים חיים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה, מוצג כאן תא בירוק המפגין ביטוי דו-פאזי של PIP3 בתגובה לחשיפה למדרג רציף של cyclic AMP באדום.תמונה זו מציגה את אזורי העניין למדידת קינטיקת הייצור של PIP3. קינטיקת הייצור של PIP3 בחלק הקדמי והאחורי של התאים בעת חשיפה למעבר ריכוזים (gradient) קבוע מוצגת כאן, כאשר ייצור PIP3 בחלק הקדמי ובחלק האחורי מיוצג בצבע שחור ואפור, בהתאמה. באמצעות דימוי תאים חיים, מדדנו באופן שיטתי את הדינמיקה של רשת סיגנלינג ספציפית לחישה כיוונית, החל מגירוי של cyclic AMP ועד לייצור PIP3.סכימה זו מציגה את רשת השילוח של חישה כיוונית, החל מגירוי של cyclic AMP ועד לייצור של PIP three. הקינטיקה של כל רכיב מוצגת באמצעות קו בצבע התואם. בסרטון זה, בדמות האיור הראשון, מוצג כיצד גירוי אחיד של cyclic AMP מעורר הפעלה מתמשכת של G protein, אשר בתורה מעוררת ייצור חולף של PIP three.סדרה של תמויות של תאי G ו-pH מראה שגירוי אחיד של cyclic AMP מעורר הפעלה מתמשכת של G-protein בהיקף התא, אשר מעוררת בו-זמנית ייצור חולף של PIP3. כאן מוצגת הקינטיקה של הפעלת G protein וייצור PIP3 בעקבות גירוי אחיד של cyclic AMP. בעת ביצוע ניסויים אלו, חשוב לזכור שהמפתח הוא השגת תאים תגובתיים, רקע גנטי שונה של התאים ותנאים סביבתיים.תנאי רכישת הדימות משנים את פיזיולוגיית התא ועשויים להפוך את התא לפחות תגובתי. בעקבות הליך זה, ניתן להחיל מידול חישובי כדי לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד אינטראקציות דינמיות בתוך רשת איתות מובילות להתנהגות תאית. שיטות אלו סוללות את הדרך עבור חוקרים בתחום ה-chemo taxes של איקריוטים.ניתן לפתח מודל חישובי של חישה למשיכי כימיים (chemoattractants). ניתן להשתמש במודל זה כדי לסמלץ את הדינמיקה של אירוע איתות. השילוב בין עידון המודל למדידות בתנאי חיים יכול להוביל להבנה מעמיקה יותר של כימותקסס (chemotaxis).לאחר צפייה בסרטון זה, אנו מקווים כי קיבלתם הבנה טובה יותר לגבי האופן שבו ניתן ליישם מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית מתקדמת כדי לנטר אירועי איתות בתאים חיים. אנו מקווים שתוכלו ליישם שיטה זו במחקריכם.

imaging-g-protein-coupled-receptor-gpcr-mediated-signaling-events

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מערכת ECIS / מוניות היא אוטומטית, בזמן אמת assay המודד chemotaxis סלולריים. ב assay זה, התאים לעבור מתחת לשכבה של agarose להגיע האלקטרודה היעד. התנועה נייד נמדדת הופעת עמידות 0 AC הנוכחי.

מדידת Chemotaxis סלולרי עם ECIS / מוניות

שיטת הערכת כמותית תגובת chemotactic...

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Assay הגיוס שתואר כאן הקרינה מבוססת סידן הוא מערכת הקרנת פרמקולוגיה ההפוכה בינוני תפוקה לזיהוי ליגנד תפקודי הפעלה (ים) של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

מבחני chemotaxis חזותיים חיוניים להבנה טובה יותר של איך איקריוטיים תאים לשלוט נדידת תאים כיוונית בתיווך chemoattractant. כאן אנו מתארים שיטות מפורטות: 1) בזמן אמת, ניטור ברזולוציה גבוהה של מבחני chemotaxis מרובים, ו -2) בו זמנית לדמיין את שיפוע chemoattractant ואת דינמיקת spatiotemporal של איתות אירועים בתאי HL60 דמוי נויטרופילים.

G הדמית חלבון בשילוב קולטן בתיווך Chemotaxis ואירועי האיתות שלה בתאי HL60 נויטרופילים דמויים

השימוש מותאם "צ'יפ חוש הריח" עבור ההדמיה סידן יעיל של C. elegans זכרים מתואר כאן. מחקרים של חשיפה זכר גליצרול פרומון מוצגים גם.

באמצעות שבב חוש הריח של Microfluidic מותאם עבור ההדמיה של פעילות. עצבית בתגובה פרומונים בנוירונים הראש הגברי C. Elegans

כאן נתאר שיטות להערכת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני. ב וזמינותו מבוסס מיקרוסקופיה, אנו בוחנים לוקליזציה של ביולוגיים שכותרתו fluorescently בעקבות גירוי קצרה עם הטיה זרימה. אנחנו גם בדיקת ההפעלה של חלבונים שונים עניין בתגובה חריפה גירוי מכני מבחינה ביוכימית.

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

וזמינותו הסלולר המתוארת נועד לצורך זיהוי הקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4)-סוכנים שמעצבת לעכב או לגרות, תחרותי או allosterically, תאיים Ca2 + שחרור שיזם CXCR4 הפעלה.

קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + גיוס Assay לזהות את G-חלבון בשילוב קולטן אגוניסטים היריבים, מאפננים Allosteric

S1P מפעיל את ההשפעות הפיזיולוגיות המגוונות שלו באמצעות תת-משפחת קולטני S1P (S1PRs). כאן, צינור מתואר כדי להרחיב על המבנים והתפקוד של S1PRs.

צינור לחקר המבנים ומסלולי האיתות של קולטני ספינגוזין 1-פוספט

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

על ידי שימוש לפתור spectrally שני הפוטונים מערכת הדמיה מיקרוסקופית, פיקסל ברמה מפות של העברת אנרגיה תהודה פורסטר (סריג) יעילות מתקבלים עבור תאים להביע את קולטני קרום השערה כדי ליצור הומו-oligomeric קומפלקסים. מן סריג מפות יעילות, אנו מסוגלים להעריך מידע stoichiometric על המתחם oligomer תחת מחקר.

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

למד שיטות הדמיה בזמן אמת לחקירת כימוטקסיס בתאי Dictyostelium discoideum באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה מתקדמת. טכניקה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקת אירועי איתות במרחב ובזמן.

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium

גלה סרטונים נוספים