הערכה של סינפסות ברצועת הכלים באזורי תדר ספציפיים של שבלול העכבר

התחילו עם שפופרות המכילות סיבובי שבלול של עכברים שטופלו מראש עם חומר מחלחל וחומר חוסם המונעים אינטראקציות לא ספציפיות.

כל תור מזהה תדרי קול שונים ומכיל תאי שיער הממירים קול לאותות חשמליים. אותות אלה מועברים באמצעות נוירוטרנסמיטורים בסינפסות סרט לעצב השמיעה.

הסר את התמיסה והוסף נוגדנים ראשוניים המקיימים אינטראקציה עם חלבונים בשיער ובתאי עצב בסינפסות הסרט, ולאחר מכן שטוף.

דגירה עם נוגדנים משניים המתויגים בפלואורופורים אדומים וירוקים, הנקשרים לנוגדנים הראשוניים שלהם.

יש לשטוף כדי להסיר נוגדנים משניים לא קשורים.

הנח את הדגימה על שקופית זכוכית עם מדיום הרכבה המכיל צבע גרעיני כדי להכתים את הגרעינים בכחול.

הרכיב את הכיסוי. יבש אותו, ואז השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לצלם כל קטע בעומקים שונים.

סינפסות הסרט מופיעות כפונקטה במיקום קרוב באדום וירוק.

ספור את הפונקטה הפונקציונלית הללו בכל תור כדי לתאם את תגובתם לתדר הקול.

לאחר הדיסקציה, הנח כל סיבוב שבלול לצינורות צנטריפוגה בודדים של 2.5 מיליליטר. חסום כל קשירה לא ספציפית עם 10% סרום עיזים ב-PBS ב-0.1% Triton X-100 למשך שעה בטמפרטורת החדר על מסובב.

בתום הדגירה, השתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להסיר את התמיסה תחת מיקרוסקופ דיסקציה. דגרו את הדגימות עם הנוגדנים העיקריים המעניינים מדוללים ב-5% סרום עיזים ב-PBS ו-0.1% טריטון X-100 למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על מסובב.

למחרת בבוקר, שטפו את דגימות הרקמה שלוש פעמים למשך 5 דקות עם PBS קר של 0.1 מולארי לכל שטיפה כדי להסיר שאריות של נוגדנים ראשוניים. לאחר מכן, סמנו את הדגימות עם הנוגדנים המשניים המתאימים המדוללים ב-5% סרום עיזים ב-PBS ו-0.1% טריטון X-100 למשך שעתיים-שלוש בטמפרטורת החדר על המסובב, מוגנים מפני אור.

בתום הדגירה, שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם 0.1 PBS מולארי כפי שהודגם, והעבירו את הדגימות לצלחות בודדות של 35 מילימטר המכילות 0.1 PBS מולארי. הנח טיפה של אמצעי הרכבה בתוספת DAPI על המגלשה, והעביר את הדגימות מ-PBS למדיום ההרכבה. הנח קצה אחד של כיסוי על כל שקופית ושחרר כדי לתת לכיסויים ליפול בעדינות. לאחר מכן, יבש את השקופיות בקופסת שקופיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

כדי לצלם את הדגימות, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם הלייזרים המתאימים ועדשת טבילת שמן ברזולוציה גבוהה פי 63. כדי לרכוש ערימות z קונפוקליות של 8 מיקרומטר מכל סיבוב שבלול. עבור ספירת פונקטומים סינפטיים, הגדר את ערימות ה-z בגודל הצעד של 0.3 מיקרומטר כך שיתפרס על כל אורך תאי השיער הפנימיים, וודא שניתן יהיה לדמות את כל הפונקטה הסינפטית, ומזג את התמונות המכילות פונקטה בערימה כדי לקבל את הקרנת ציר ה-z.

ייבא את התמונות הממוזגות לתוכנה מתאימה לעיבוד תמונה. חלקו את ספירת הסך הסינפטי בכל מחסנית z באזורי תדר ספציפיים במספר תאי השיער הפנימיים החיוביים ל-DAPI כדי לחשב את מספר הפונקטה הסינפטית עבור כל תא. בכל אזור תדר ספציפי, ממוצע של כל הפונקטה הסינפטית ב-3 תמונות של שדות מיקרוסקופיים שונים המכילים 9 עד 11 תאי שיער פנימיים.

כדי לדמיין טוב יותר את ארכיטקטורת השלד הציטולוגי ואת הלוקליזציה הסינפטית, השתמש בכלי המברשת כדי להעריך חזותית את המבנה הסינפטי וההתפלגות של תאי השיער הפנימיים הבודדים. כדי לבדוק את הסמיכות של סרטים פרה-סינפטיים וכתמי קולטנים פוסט-סינפטיים, השתמש בכלי סימון הסימון המלבני כדי לחלץ את רווח הווקסל סביב הסרטים, והשתמש בחיתוך תמונה כדי לבודד את הסרטים הבודדים. לאחר מכן, לחץ על תמונה וגודל תמונה כדי לרכוש מערך תמונות ממוזערות של הקרנות מיניאטוריות אלה שניתן להשתמש בהן כדי לזהות סינפסות זוגיות לעומת סרטים יתומים.