מעקב אחר דפורמציות המוךפו"גנטי שהולך רקמות בעובר צ'יק מוקדם

המטרה הכוללת של הטכניקות המוצגות כאן היא לסמן ולגדל רקמות עובריות לצורך מדידת דפורמציה מורפוגנטית במהלך התפתחות מוקדמת. עבור גידול של עוברי אפרוח בשלב מוקדם, התחילו בהוצאת העובר מהביצה באמצעות שיטת נשא של נייר סינון. בהתאם ליישום הניסויי, סמנו את העובר שהוצא באמצעות צבעים ליפופיליים פלואורסצנטיים המועברים באמצעות חלקיקי ברזל מגנטיים או באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן. לאחר מכן, עקבו אחר הסימונים במהלך הגידול באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או הדמיית טומוגרפיה בקוהרנטיות אופטית (OCT).

מיפויים של מאמצים מורפוגנטיים המתקבלים מדימות מצביעים על אזורים של התארכות, התקצרות וגזירה של רקמה הן בשני ממדים והן בשלושה ממדים. שלום, שמי בן פיליס ואני סטודנט לתואר מתקדם במעבדה של ד"ר לרי טייבור במחלקה להנדסה ביו-במדית באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס. לפני תחילת ניסויים מסוג זה, חשוב לשקול את טכניקות תרביות הרקמה הרלוונטיות במערכת המודל שלכם, את שיטות הדימות שייתכן שיעמדו לרשותכם, וכן את סוג הנתונים שאתם שואפים להפיק מהניסויים שלכם.

לדוגמה, האם אתם מעוניינים בניתוח של עיוותי רקמה בשני או שלושה ממדים? אנו נתייחס לכמה מהשאלות הללו היום על ידי הצגת שתי טכניקות סימון משלימות בעובר אפרוח בשלבים מוקדמים. שלום, שמי ויקטור וורנר, ואני עובד במעבדה של ד"ר לרי טייבור באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס.

בשתי טכניקות אלו, אנו מסמנים במהירות ובמקביל מאות תאים בעובר אפרוח בשלבים מוקדמים. מעקב אחר תנועתם של סמנים אלו מאפשר לנו לא רק לקבוע באילו רקמות יתמקמו תאים אלו בסופו של דבר, אלא גם לכמת את העיוות ברמת הרקמה המעצב את העובר המוקדם. ראשית, דגרו את הביצים במנח ארוכי כדי להגיע לשלב הרצוי כפי שהוגדר על ידי hamburger ו-Hamilton.

שברו את תחתית הביצה על דופן של צלחת פטרי בנפח 150 מילימטר. הסירו את הקליפה מהתחתית, רוקנו את תוכן הביצה אל תוך הצלחת, ובעזרת פינצטה קהה, הסירו את האלבומין הצמיגי והסמיך מהחלמון. כעת, נקבו חורים במרכזה של נייר סינון עגול.

הניחו אחת מטבעות נייר הסינון על החלמון כך שהעובר יהיה גלוי דרך החור המרכזי של הטבעת. גזרו סביב ההיקף החיצוני של טבעת נייר הסינון באמצעות מיקרו-מספריים. לאחר מכן, הסירו את הנייר יחד עם העובר הצמוד אליו מהחלמון בעזרת פינצטה עדינה, והשרו בעדינות את העובר באמבט של PBS. כדי להסיר חלקיקי חלמון דבוקים, העבירו את תצורת נייר הסינון לצלחת תרבית של 35 מילימטר.

הנח את העובר כאשר הצד הבטני פונה כלפי מעלה, והעבר אותו באמצעות טבעת שנייה של נייר סינון. קבע אותו באמצעות טבעת מתכת ושקע את העובר בתווך תרבית. אם העובר אינו שקוע לחלוטין, גאומטריית הרקמה והמורפוגנזה העוקבת עלולות להשתנות משמעותית עקב עומסי מתח פנים גבוהים באופן חריג.

במהלך התרבית, השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield) כדי לוודא מורפולוגיה תקינה ושלב עוברי מתאים. ראשית, קח כמות קטנה של אבקת ברזל, הוסף מספר טיפות של צבע רווי ואלכוהול, וייבש באוויר באמצעות קצה של מיקרו-פיפט רחוב (pulled micro pipette). פצפץ את חלקיקי הברזל הגושים והעבר אותם למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה.

לאחר מספר שטיפות במים מיוננים, הנח את העובר שנאסף כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה בצלחת תרבית של 35 מילימטר המכוסה בשכבה נדיבה של תוצר תרבית. תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש במחט זכוכית כדי להסיר את קרומי ה-vilin ולחשוף את התאים האלקטרודרמליים. כעת, שאב עמודה של חלקיקי ברזל מסומנים לתוך פיפט פסטור.

בעזרת מיקרוסקופ דיסקציה, טבל את הפיפטה כך שתמוקם מעט מעל העובר. גלגל את הפיפטה באיטיות קדימה ואחורה בין קצות האצבעות כדי לפזר את החלקיקים על פני העובר. לאחר דגירה של 10 דקות ב-37 °C, הסר את החלקיקים באמצעות מגנט חזק.

במידת הצורך, הצמידו את המגנט לצבת עדינה מגנטית והשתמשו בצבת הממגנטת כדי להסיר בזהירות שאריות של חלקיקי ברזל. המשיכו לרכישת תמונות בשדה בהיר (brightfield) ובתסמימה (fluorescence) של העובר. באמצעות מחט בכילייב 22.

שאבו תמיסה של מיקרוספירות שחורות בקוטר 10 µm ב-PBS לתוך מזרק של 10 cc. לאחר מכן, צרו שיפוע בקצותיהן של מחטי זכוכית שנמשכו בעזרת כונן קשיח של מחשב ומלאו אותן בתמיסת החרוצים. נקשו קלות על המיקרו-פיפט בעזרת מיקרו-מניפולטור כדי שהתמיסה תגיע לקצה.

הניחו את מחט הזכוכית באותו שדה ראייה שבו נמצא העובר. ודאו כי חרוזי הנילוני זורמים החוצה מקצה הפיפטה. כעת, הכניסו את קצה הפיפטה לתוך הלומן של צינור המוח.

יש להיזהר לא לנקב את הרצפה הוונטרלית של הרקמה. יש לעקוב אחר הנפיחות החולפת של הרקמה בעת כניסת החרוזיים והנוזל ללומן. לאחר מכן, יש להוציא במהירות את מחט הזכוכית.

לבסוף, ודאו כי צפיפות החרוצים בלומן הפנימי של צינור המוח מספקת. באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (bright field), המתינו 20 עד 30 דקות לשקיעת החרוצים לפני רכישת תמונות בשדה בהיר או סט נתונים של טומוגרפיה קואורנטיבית אופטית (OCT). לאחר רכישת התמונות הראשונות, הניחו עד 7 צלחות תרבית של 35 מילימטר עם דגימות בתוך צלחת פטרי של 150 מילימטר, והכניסו את המכלול כולו לשקית פלסטיק קטנה.

הוסיפו טיפות של מים דה-יוניים לשקית לצורך לחלוח, ולאחר מכן מלאו את השקית בתערובת של 95% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני. הניחו את העוברים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עד לנקודת הזמן הבאה של הדמיון; העבירו את העוברים המסומנים לכלי delta T המכיל 1.2 milliliters של מצע גידול וכסו את הכלי במכסה זכוכית השומר על טמפרטורה של 37 °C. בצעו סופוזיה לעובר באמצעות תערובת גזים של 95% O2 ו-5% CO2 המסופקת ממכשיר זרימה משתנה של מיני-משאבה. כעת הגדירו בתוכנה רכישה אוטומטית של תמונות במרווחי הזמן הרצויים.

במהלך הניסוי, ניתן לעקוב אחר סמנים באופן אוטומטי או ידני, וניתן לחשב מפות מאמץ מורפוגנטיות עבור קואורדינטות של סמנים. כאן, נעשה שימוש בטכניקת חלקיקי הברזל כדי לסמן ולעקוב אחר תנועתם של תאי העור החשמליים במהלך היווצרות קיפול הראש. בעובר אפרואי בשלב מוקדם, תאים המסומנים פלואורסצנטית הופצו על פני העובר כולו.

תמונות בשדה בהיר ובפלואורסנציה של העובר צולמו במרווחי זמן שונים במהלך תרבית ex ovo. זאת כדי לנטר את תנועות סימוני המסלול. נתונים מצטברים מאפשרים חישוב של התפלגויות מאמץ מורפוגנטי מתפתחות במהלך היווצרות קיפול הראש.

באופן דומה, טכניקת המיקרוספירות מפוליסטירן שימשה למעקב אחר תנועות רקמה בגבול המוח האחורי האמצעי במוחו של עובר אפרוח בשלב מוקדם. יש לציין כי שיטה זו מסוגלת להתמודד עם דפורמציה תלת-ממדית מובהקת, מכיוון שהחרו지를 נוטים להיצמד לכל דפנות הלומן הפנימי של המוח. לאחר מעקב אחר תנועות החרו지를 במשך שש שעות, קואורדינטות הסמנים מאפשרות חישוב של מאמצים (strains), המאפיינים את דפורמציית הרקמה בכיוונים האורכי וההיקפי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של חלק מהשלבים הניסיוניים הנדרשים לביצוע תרבית רקמות וסימון באופן עצמאי. טכניקות הפרוטוקול המוצגות כאן יתרונויות במיוחד בכך שהן פולשניות במינימום לרקמות המקור, וכן כיוון שהן כוללות חומרים זולים וזמינים. ניסויים אלה שימושיים במיוחד למחקרים על המכניקה של ההתפתחות העוברית.

מכיוון שניתן להשתמש בשדות העיוות שחושבו באמצעות מעקב אחר תנועתם של תאים מסומנים הן לבחיקה והן לבנייה של מודלים פיזיקליים של מורפוגנזה.