Name: Tube סגירת עצבית בתרבות העובר שלם עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: למדו שיטה לתפעול פרמקולוגי ישיר בעוברי עכברים בתקופת סגירת הצינור העצבי, תוך עקיפת מטבוליזם אימהי. הטכניקה מאפשרת מחקר מדויק של מסלולים מולקולריים בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות מעבדה של א Hadjantonakis (סלואן קטרינג המכון) ואת המעבדה של ל Niswander (U קולורדו, דנבר) עבור עצות מועילות עם טכניקות לנתיחה ותרבות. עבודה זו נתמכה על ידי NRSA NS059562 כדי JDG ו RO1NS05897 כדי MER בשיתוף עם L. Niswander וג&#39; Nadeau (המכון Systems Biology).

1. הכנה של התקשורת בתרבות - כל ריאגנטים מפורטים בטבלה 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חולדה זכר הפשירי בסרום על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום להשבית בסרום חולדה במשך 30 דקות ב 55 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברוש צנטריפוגה בסרום ב 10K במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 50:50 supernatant ומערבבים עם פנול אדום חופשי DMEM w / גלוקוז גבוהות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את התקשורת באמצעות מסנן 0.45 מזרק אממ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות 1ml של התקשורת / העובר צריכים להיות מוכנים </li></ol> 2. בידוד של הרחם מן הסכר בהריון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות נהלים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC), הסכר בהריון הוא הרדים הראשון הקריב מכן על ידי נקע בצוואר הרחם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הבטן עם EtOH 70% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורט נתיב קטן של העור לאורך קו האמצע, בדיוק מעל קו הפטמה, עם מלקחיים גדולים לפתוח את הבטן מתחת מלקחיים שלך עם מספריים גדולות. היזהר שלא כל נזק למבנה הפנימיs </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים שלך לחתוך רוחבית מפתיחת הראשונית כלפי צד של העכבר כך את הבטן כולה פתוחה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיים רפידות שומן עודף יכול לעתים לטשטש את הרחם ואת אלה צריך להיות כך זז הצידה את החלק העליון של הרחם והשחלות ניתן לצפות בכל צד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צבוט את החלק העליון של הרחם מתחת השחלות ולהשתמש מספריים שלך להפריד את הרחם מן השומן, חיתוך מקצה אחד של הרחם אל השחלה אחרים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את הרחם עם מלקחיים שלך במקום בצלחת פטרי עם תמיסת מלח </li></ol> 3. הסרת עוברים מן הרחם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הרחם עם מלח כדי להסיר כל דם עודף לקצץ כל עודפי השומן מבחוץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה צלחת נקייה עם טמפ 'החדר. תמיסת מלח כדי לשפר להדמיה Tyrodes </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש stereomicroscope נפרד כל העובר או באמצעות מספריים קטנים, או אם יש צורך בסדר (# 5) מלקחיים בזהירות את קליפת הרחם מזה. </li> &lt;li&gt; הכנס מלקחיים עדין אל תוך החלל שבין קיר הרחם ואת decidua וקליפת בחזרה דופן הרחם, נזהרים שלא לנקב את העובר </ol> 4. הסרת decidua מעוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט decidua כך את החלק כהה (השליה) פונה ממך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חתך עם מלקחיים שלך לאורך הקו המפריד בין החלק הכהה של decidua מחלק את המצית, נזהרים שלא לחתוך עמוק מדי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם את הפרדת השליה מהחלק העליון של שק החלמון, נזהרת שלא לקרוע את חרוט ectoplacental (EPC). בשלב זה אתה אמור להיות מסוגל לדמיין את קרום Reicherts על שק החלמון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להסיר את decidua כולה (חלק בהיר) נזהרים שלא לנקב את שק החלמון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות קמצוץ ולהסיר את Reicherts ידי לקלף אותה הרחק EPC. אם EPC פגום או להפריד את שק החלמון, עוברים ייכשל לפנות בדרך כלל מ-E8.5 E9.5 </li><li reicherts somities></ol> 5. הגדרת מערכת התרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הקצה של טפטפת העברת פלסטיק במספריים כדי להגדיל את הקוטר של הפתח, כך העובר יכול להיות pipetted מבלי לפגוע שק החלמון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי בקבוקי רולר נקי עם 1 מ"ל של התקשורת לכל העובר. בהתאם לסוג בקבוקי רולר בשימוש מרבי של 3-6 עוברים יכול להיות טעון בבקבוק אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העוברים באמצעות פיפטה לחתוך שלך בקבוק התקשורת מילאה את מכבש, נושאת על כמו Tyrodes שפחות כדי לא לדלל את התקשורת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את התקע גומי (פקק) לחלק העליון של בקבוק זכוכית רולר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את בקבוקי רולר לתוך התוף תרבות רולר, כך חותם הדוק נוצר בין התקע ואת תוף </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל הבקבוקים היו מחוברים, וכל משבצות ריקות התוף כבר חתום wפקקים גומי ith, להפעיל את מכבש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח CO 2 ו-O 2 טנקים ולהתאים אותם כ 2 psi, כך שסתום היציאה מפרסמת בועה לשנייה. עבור E8.5-E10 עוברים, 20% O 2 ו - 5% CO 2 אמור לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא החממה מוגדר 37 ° C ו לכסות או לסגור את החממה כך עוברים מוגנים מפני האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים צריך להיבדק באופן תקופתי כדי להעריך את התפתחותם על ידי תוספת של somities, את ההתקדמות של מפנה, והיקף הסגר בצינור העצבי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2-3 שעות בתרבות, מעכבי תרופתי או טיפולים אחרים ניתן להוסיף אמצעי התקשורת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערך המחקר צריכה לכלול בקרות, כגון כלי רכב או אנלוגים פעיל של מגיב המחקר. </li></ol> 6. לאחר הערכת התפתחות התרבות העובר כולו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיבוי גז, להפסיק רולר, ולהסיר בקבוקים מן החממה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי העברה בחזרה Tyrodes או PBS בצלחת פטרי להערכת תחת stereomicroscope </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שק החלמון אמור להופיע בלון דמוי, הלב צריך להיות גלוי קצב הלב צריך להיות&gt; 120 פעימות לדקה, ומחזור הדם צריך להיות ברור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צילום עוברי לפני הסרת שק החלמון במידת הצורך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שק חלמון מעובר על ידי חיתוך חור ליד EPC ו מעיפה את שק החלמון ואת amnion מעל הראש עכוז של העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבל הטבור ניתן לחתוך כדי להפריד את שק החלמון של העובר ואת שק החלמון יכול לשמש genotyping את העובר במקרה הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את העובר במשך מספר somite ו למומים בצינור העצבי, כגון קפלי הגולגולת פתוחה, סגר חלקי של הפנים ו / או neuropore הזנב פתוח. עוברים יכול להיות מבוים על פי הסיווג Theiler שינויים המוךפו"גנטי שהולך מרובים ( <a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">http://www.emouseatlas.org/ eMap / home.html</a> ) שוב, תיעוד מצולם שלהתפתחות העובר היא שימושית. </li></ol> 7. הערות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסקציה באיכות גבוהה היא חיונית, כי כל ניק או דמעות של שק החלמון תמנע הפיכת מצליח לעכב התפתחות תקינה. EPC יכול גם להיות פגום במהלך הסרת הממברנה של רייכרט (RM), ואם EPC מופרד גם חלקית של שק החלמון, עוברים לא יפתחו כלל. עם זאת, ההסרה לא מושלמת של RM יכול לגרום עוברים להישאר ביחד ו / או תאים RM עשוי לגדול יותר בתרבות להצר הרחבת שק חלמון, אשר שניהם ימנע התפתחות תקינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים נקי וחד הם הסוד מקבל לנתיחה טוב, כי משעמם או מלקחיים כפוף להפוך את הליך משמעותי יותר קשה. פיקדונות חלבון על מכשירים יוביל נזק לרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקי, בקבוקי זכוכית סטרילית גם חיוני כדי למנוע עוברים יידבקו אל הקיר בצד היותו פגום. לפני תחילת הניסוי, בקבוקי צריך להיות scrubbed עם מים וסבון, ושטף DH 2 O, ו במיקרוגל עם כמות קטנה של מים בבקבוק אחד עד שהמים ירתחו. בקבוקים הם שטופים אז EtOH עם 70% ו מותר אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה מהר ככל האפשר, כי במוקדם העובר ניתן להעביר בתקשורת תרבות חיממו בחזרה 37 מעלות צלזיוס הישרדות טובים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם לנתח את החול כולו לפני העברת כל העוברים על בקבוקי רולר כך עובר כל בטמפרטורת החדר למשך אותו פרק זמן ולהימנע מיצירת פערים בצמיחה העובר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשמור על סביבה סטרילית על מנת למנוע זיהום חיידקי של התרבויות. ניסויים בתרבות שלנו בוצעו ללא אנטיביוטיקה, אבל במעבדות רבות להוסיף אנטיביוטיקה התקשורת שלהם על מנת למנוע התפתחות חיידקים. המדיום אמור להופיע ברורה בסוף הניסוי כפי שהיה בתחילת הניסוי. אם התקשורת הפכה מעוננים או שיש לזרז גלוי, יש סיכוי קוןtamination כי נגוע בתרבות שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חילוף הגזים יעיל יכול גם לעכב את התפתחות העובר, כדי להיות בטוח יש וסת אמין שיבטיחו אספקה ​​רציפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים לפתח כ -50% איטי יותר בתרבות vivo לשעבר, ולכן זה חיוני לספור somites כדי לוודא שאתה הגיעו לשלב ההתפתחות המתאים להשלמת הניסוי. </li></ol> 8. נציג תוצאות: הופעתו של עוברי טרום ופוסט מכבש התרבות מתוארת באיור 1. בזמן דיסקציה, עוברים צריכה להיות בתצורה הפוכה (איור 1 א, ד) שבו הזנב עומד מאחורי קפלי הראש. לאחר 36 שעות בתרבית, עוברי צריך להשלים מפנה, כך שהם נמצאים בעמדה, C-מעוקל העובר, שבו הזנב מול הראש (איור 1B, C, E, F). מניפולציה תרופתי עם RhoA קינאז מעכב (Y-27632), מעכב ידוע של הרחבה מתכנסת במהלךneurulation (Ybot-גונזלס, 2007), התוצאה היא קיצור של העוברים בציר שלהם מקורי, הזנב (איור 1E, F) ומעכב גולגולתי סגר לקפל עצביים. הנתונים שלנו מראים כי מינון גדל והולך של Y-27632 בהדרגה פוגעת סגר לקפל גולגולתי (איור 2A) ומקצרת את ציר הגוף (איור 2 ב), עולה בקנה אחד עם תפקידו של הזרם RhoA איתות neurulation גולגולת הרחבה מתכנסת. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg"> באיור 1. מראה של עוברים תרבויות מניפולציה עם מעכב תרופתי Y-27632. (A, D) עוברים גזור על E8.5 לפני תרבות שלמה העובר (B, E) עוברים על E10 עם שק החלמון עדיין שלם, לאחר 36hrs של התרבות הרים. (C, F) שק חלמון הוסר כדי להמחיש מפנה מוצלחת הסגר בצינור העצבי. עוברים אשר טופלו עם Rho קינאז מעכב Y-27632 (E, F) הצליחה לעבור הרחבה מתכנסת נכונה להמחישציר הגוף מקוצר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg"> איור 2. השפעת מעכבי קינאז RhoA על סגירת הגולגולת בצינור העצבי ואת התארכות ציר. (א) אחוז עוברים כי היו מסוגלים בהצלחה קרוב קפלי הגולגולת שלהם (% NTC = סגירת הצינור העצבי אחוז) בהשוואה למינון של Y-27632 הוסיף התקשורת והתרבות. (ב) המרחק בין שלפוחית ​​forelimb otic ו צומצם משמעותית במינון הולך וגדל של Y-27632 (p &lt;0.05).

<ol><li>Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCockroft%2C+DL+%22Mammalian+Postimplantation+Embryos+A+Practical+Approach%22">Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach</a>. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. (1990).</li>
<li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+Atlas+of+Mouse+Development%22">The Atlas of Mouse Development</a>. , Academic Press Limited. San Diego. (1992).</li>
<li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+extension%2C+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li>
<li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-environment+interactions%2C+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

היכולת להפריד בין האם, גורמים תוך רחמי מאלה מהותי לעובר במהלך התפתחותו הוא כלי חשוב ללימוד כל שלבי embryogenesis. כאן יש לנו ניתחו את ההשפעות של מעכבי מולקולה קטנה של קינאז RhoA על ברחם neurulation גולגולתי לשעבר, ובכך להסיר את חילוף החומרים משתנה האימהי של התרופה. זו מניפולציה תרופתי יש השפעה עמוקה על neurulation גולגולת הרחבה מתכנסת. רגישות תרכובת זו ניתן להשוות בין שונות גנטית עכברים מוטנטים. השיטה המוצגת כאן יכול להיות מיושם גם על מחקרים של מסלולים מולקולריים אחרים בפיתוח, המאפשר מניפולציה ישירה של פונקציית הסלולר עוברים באמצעות מגוון של חומרים כימיים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Stereomicroscope עבור Dissection </td><td> לייקה </td><td> M165 </td><td></td></tr><tr><td> Precision החממה </td><td> BTC הנדסה (בריטניה) </td><td> BTC 001 </td><td></td></tr><tr><td> סיבוב התרבות בקבוק היחידה </td><td> BTC </td><td> BTC 003 </td><td></td></tr><tr><td> זכוכית בקבוקים עבור סיבוב היחידה </td><td> BTC </td><td> BTC 005 </td><td></td></tr><tr><td> גומי סיליקון באנג </td><td> BTC </td><td> BTC 007 </td><td></td></tr><tr><td> קורק גומי סיליקון </td><td> BTC </td><td> BTC 008 </td><td></td></tr><tr><td> גז Bubbler מפרצון </td><td> BTC </td><td> BTC 012 </td><td></td></tr><tr><td> גז Bubbler מלכודת מפרצון </td><td> BTC </td><td> BTC 013 </td><td></td></tr><tr><td> גז Bubbler Outlet </td><td> BTC </td><td> BTC 014 </td><td></td></tr><tr><td> גז צילינדר </td><td> TechAir </td><td></td><td> 20% O 2, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> גז הרגולטור </td><td> TechAir </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חולדה זכר סרום </td><td> הרלן מעבדות </td><td> 4520 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM w / o פנול אדום </td><td> Invitrogen </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> 10 מ&quot;ל מזרק </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק Filter </td><td> Nalgene </td><td> 190-2545 </td><td></td></tr><tr><td> הביתור מספריים גדולים (טיפ בלאנט) </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td><td></td></tr><tr><td> אקסטרה פיין בון מספריים </td><td> כלי מדעי פיין (FST) </td><td> 14084-08 </td><td></td></tr><tr><tד&gt; Dumot # 5 מלקחיים </td><td> FST </td><td> 11252-50 </td><td></td></tr><tr><td> של תמיסת מלח Tyrode </td><td></td><td></td><td> כפי שתואר Cockroft 1990 </td></tr><tr><td> 10 פנויה ס&quot;מ צלחת פטרי </td><td> BD </td><td> 351029 </td><td></td></tr></tbody></table>

tube סגירת עצבית בתרבות העובר שלם עכבר

Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

מודלים העכבר גנטית הם כלי חשוב במחקר הסגר יונקים בצינור העצבי (Gray &amp; Ross, 2009; רוס, 2010). עם זאת, המחקר של עוברים ברחם העכבר הוא מוגבל על ידי חוסר היכולת שלנו ישירות פרמקולוגית לתפעל את העוברים במנותק מן ההשפעות של מטבוליזם אימהית על מגיב של עניין. בין אם באמצעות מולקולה קטנה, חלבון רקומביננטי, או siRNA, אספקה ​​של חומרים אלה לאם, באמצעות תזונה או על ידי הזרקת יהיה כפוף התרכובות הללו יציבים למגוון ההגנות גוף שיכול למנוע מהם להגיע אל העובר. חקירות בתרבויות של עוברים כל יכול לשמש כדי להפריד אימהית מפני השפעות על התפתחות העובר מהותי. כאן, אנו מציגים שיטה עכבר עוברים culturing באמצעות מדיה מועשר במנגנון הרים החממה המאפשר סגירת נורמלי בצינור העצבי לאחר דיסקציה (קרוקט, 1990). לאחר בתרבות, עוברי יכוללטפל באמצעות קונבנציונאלי בטכניקות חוץ גופית כי שאחרת לא יהיה אפשרי אם העוברים היו עדיין ברחם. אחים עובריים ניתן לאסוף בנקודות זמן שונות כדי לחקור היבטים שונים של neurulation, המתרחשים מ-E7 7.5 (היווצרות צלחת עצביים, זמן קצר לפני תחילתו של neurulation) כדי E9.5-10 (בסיום neuropore לקפל הזנב גולגולתי הסגר, קאופמן, 1992). בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים את השיטה שלנו לנתח עוברים על timepoints כי הם אופטימליים ללימוד neurulation גולגולתי. עוברים יהיה גזור על E8.5 (כ 10-12 somities), לאחר תחילת הסגר בצינור העצבי אבל לפני הפיכת העובר ואת הגולגולת סגירה לקפל עצביים, ומתוחזק בתרבות עד E10 (26-28 somities), כאשר הגולגולת neurulation צריכה להיות מלאה.

שיטה המאפשרת מניפולציה תרופתי ישירה של עוברי עכברים במהלך neurulation עוקף מטבוליזם אימהית מתואר. הטכניקה ניתן להתאים ללמוד היבטים שונים של neurulation על ידי שינוי נקודת זמן סוכן תרופתי.

Tube סגירת עצבית בתרבות העובר שלם עכבר

מודלים גנטיים של עכברים הם כלי חשוב בחקר סגירת צינור העצבים ביונקים (Gray & Ross, 2009; Ross, 2010). עם זאת, חקר העכבר...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לנטר את האירועים בעובר של עכבר, כולל התארכות הציר העצבי וסגירת צינור העצב, בסביבה חוץ-רחמית שבה ניתן להגדיר את התנאים. דבר זה מושג תחילה על ידי הסרת קרני הרחם מעכברה רחמה תחת הרדמה ביום גסטציוני או עוברי 8.5. לאחר מכן, עוברים בודדים של עכבר מוסרים מהרחם כאשר שק החלמון שלהם שלם וחלק ניכר מהדצידואה נשאר צמוד אליהם.לאחר מכן מקצצים את רקמת הדסידואה חוץ-עוברית, כך שקונו השליה החיצוני נשאר שלם. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא העברת העובריים יחד עם שקי החלמון שלהם לבקבוקי גלגול (roller bottles) המכילים מצע גידול עם או ללא סוכנים פרמקולוגיים הנבדקים, וגידולם של העובריים למשך 18 עד 24 שעות באינקובטור עם אספקת גז רציפה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות הוספה הדרגתית של סומיטים, הצמדה של קיפולי העצב וסגירה עם סיבוב של העובר לצורת C המוכרת של תנוחת העובר.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום, כגון אילו מסלולים מולקולריים מעורבים בסגירה תקינה של צינור העצבים. אילו חומרים או תוספים יכולים לסייע בקידום סגירה תקינה, במיוחד בעוברי הנושאים מוטציות גנטיות המגבירות את הסיכון למומים בצינור העצבים (NTDs). הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית, שכן השלבים בתהליך הנתיחה עשויים להיות מאתגרים מאוד.העוברים קטנים ועלולים להינזק בקלות, ונזק לשקיק החלמון עלול לפגוע בהוספה, בסיבוב ובפיתוח של מערכת הדם, ובכך למנוע תוצאה מוצלחת. כדי להתחיל, הכין מצע תרבית על ידי הפשרת סרום של חולדה זכר ב-37 °C. לאחר מכן, בצע אינאקטיבציה לסרום החולדה למשך 30 דקות ב-55 °C.לאחר מכן, סובבו במהירות של 10,000 RPM למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) ועזבו אותו ביחס של אחד לאחד עם DMEM ללא phenol red עם רמת גלוקוז גבוהה. סטריליזו את המדיום באמצעות מסנן מזרק של 0.45 micron.בודד את הרחם והנח אותו בצלחת פטרי עם תמיסת סליין להוצאת העוברים. ראשית, שטוף את הרחם בסליין להסרת שאריות דם וגזור רקמות שומן עודפות מהחלק החיצוני. העבר אותו לצלחת נקייה עם תמיסת tyro saline בטמפרטורת החדר לשיפור הנראות תחת מיקרוסקופ סטריאו, כאשר הידיים מיוצבות על הבמה.השתמשו במספריים קטנים או בפינצטה עדינה כדי לקלף את הרחם ולהפריד בין העוברים. הכניסו פינצטה עדינה למרווח שבין דופן הרחם לבין ה-decidua, וקלפו לאחור את דופן הרחם תוך הפעלת מתח מינימלי כדי למנוע את קרעו של שק החלמון. לאחר מכן, כווןו את ה-decidua כך שהשלייה תפנה הרחק מכם.לאחר מכן, בצעו חתך באמצעות הפינצטה לאורך הקו, תוך הפרדת החלק הכהה של ה-decidua מהחלק הבהיר יותר. יש להיזהר לא לחתוך עמוק מדי. השלימו את הפרדת השליה מהחלק העליון של שק העובר.יש להקפיד לא לקרוע את ה-ecto placental cone או ה-EPC. בנקודה זו, ממברנת ה-riker על שקיק החלמון (yolk sack) אמורה להיות גלויה. הסרת ממברנת ה-Riker משקיק החלמון היא החלק המאתגר ביותר בפרוצדורה, והיא דורשת סבלנות ויד יציבה.על מנת להסיר בעדינות את ה-riker מבלי לפגוע בשקיק החלמון שמתחתיו, המשיכו בהסרה של כל ה-decidua. תוך זהירות לא לנקב את שקיק החלמון, צבטו בעדינות והסירו את ממברנת ה-riker על ידי קילופה מה-EPC. אם ה-EPC נפגע או נפרד משקיק החלמון, העוברים לא יסתובבו בצורה תקינה בין השלבים E 8.5 ל-E 9.5.לאחר הסרת קרומי הריקר (riker's membrane), העובר אמור להיות גלוי בקלות דרך שק ה-oak. קבעו את שלב התפתחות העובר על ידי ספירת הסומיטים לאורך צד אחד, החל מתחת לבועת השמיעה (otic vesicle) ועד לקצה הזנב באמצעות מספריים. חיתכו את קצהו של פיפט טרנספר מפלסטיק כדי שניתן יהיה להשתמש בו על העובר מבלי לפגוע בשק ה-oak.מלאו בקבוקי גלגול (roller bottles) נקיים במיליליטר אחד של מצע לכל עובר. בהתאם לסוג בקבוקי הגלגול שנעשה בהם שימוש, ניתן להטעין מקסימום של שלושה עד שישה עוברים בכל בקבוק. באמצעות פיפטה חתוכה, העבירו את העוברים לבקבוק הגלגול המלא במצע, תוך העברה של כמות מינימלית ככל האפשר של tyros, כדי לא לדלל את המצע.חברו את פקק הגומי לחלקו העליון של בקבוק הגלילים מזכוכית. הכניסו את בקבוקי הגלילים לתוך תוף תרבית הגלילים כך שייווצר איטום הדוק בין הפקק לתוף. לאחר שכל הבקבוקים חוּברו, אטמו כל חריץ ריק בתוף באמצעות פקקי גומי.לאחר מכן הפעילו את הגלגלת. בשלב הבא, פתחו את מיכל תערובת ה-CO2 O2 וכווננו אותו לכ-two PSI כך ששסתום היציאה ישחרר בועה אחת לשנייה. עבור עוברים בשלבי E 8.5 ו-E 10, יש להשתמש ב-20%O2 ו-5%CO2.יש לוודא שהאינקובטור מכוון ל-37 °C ולכסות או לסגור אותו כך שהעוברים יהיו מוגנים מאור. כדי להעריך את התפתחות העוברים, יש לבדוק אותם מעת לעת כדי לזהות הופעה של סומיטים, התקדמות של הסיבוב (turning) ומידת הסגירה של צינור העצבים; לאחר שעתיים עד שלוש שעות בתרבית, ניתן להוסיף מעכבים פרמקולוגיים או טיפולים אחרים, במידה ונדרש. עם סיום האינקובציה, יש לכבות את הגז, לעצור את הגלגלת ולהוציא את הבקבוקים מהאינקובטור.העבירו את העוברים בחזרה ל-tyros או PBS בצלחת פטרי. תחת מיקרוסקופ סטריאו, שק החלמון צריך להיראות כמו בלון, פעימות לב צריכות להיות נראות והסירקולציה צריכה להיות ניכרת. הסירו את שק החלמון מהעובר על ידי חיתוך חור ליד ה-EPC והפיכת שק החלמון והשליה מעל ראשו וגבו של העובר. חתכו את חבל הטבור כדי להפריד את שק החלמון מהעובר.לבסוף, בחנו את העובר כדי לאתר מספר ופגמים בצינור העצבי, כגון קיפולים קרניאליים פתוחים, סגירה לא מלאה של הפנים ו/או נקב עצבי גבי (caudal neuropore) פתוח. ניתן לסווג את העוברים לפי סיווג Tyler של שינויים מורפוגנטיים מרובים. מראה העוברים לפני ואחרי תרבית גלילים (roller culture) מומה כאן במועד הניתוח. העובר צריך להיות בתצורה לא מסובבת, שבה הזנב נמצא מאחורי קיפולי הראש.לאחר 24 שעות בתרבית, העוברים אמורים להשלים את תהליך הסיבוב כך שיהיו בתנוחה עוברית מקוזוברת בצורת C, שבה הזנב נמצא לפני הראש. תמונה זו מציגה בשורה העליונה את התפתחותם של עוברים ללא הוספת מעכבים. השורה התחתונה מראה את ההשפעה של מניפולציה פרמקולוגית באמצעות מעכב row A kinase בשם Y 2 76 32, מעכב ידוע של התארכות קונברגנטית במהלך alation.מעכב זה גורם לקיצור של העוברים לאורך הציר הזנבי ומעכב את סגירת קיפולי העצבים הגולגולתיים. הנתונים שלנו מראים כי מינונים גדלים של Y 2 7 6 3 2 פוגמים באופן הדרגתי בסגירת הקיפולים הגולגולתיים ומקצרים את ציר הגוף, באופן העולה בקנה אחד עם תפקידו של שגורר ה-A signaling בקיפולים העצביים הגולגולתיים ובבקיעה מתבברת (convergent extension). לאחר שליטת מלאה בטכניקה, ניתן להשלים את הדיסקציה ב-60 עד 90 דקות עבור שגר של שישה עד 12 עוברים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של השלבים הנדרשים לגידול עוברי עכבר בימי הריון 8.5 עד 10, לצורך חקר מנגנוני התפתחות ברמת המערכות.

neural-tube-closure-in-mouse-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

טכניקה שלמים תרבות העובר מאפשר לנו עכבר התרבות עוברי...

שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק

זה פרוטוקול וידאו מדגים את היישום של assay neurosphere לבידוד והרחבת בתאי גזע עצביים מן יואילו הוד מעלתם ganglionic היום עובריים 14-עכבר המוח.

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

הבידוד של הרכס העצבי העובר מן הצינור העצבי מאפשרת את...

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

Mesenchyme הגולגולת עובר תנועות morphogenic דרמטיות שעשויים מספקת כוח מניע לגובה של הקפלים...

Assay Explant להערכת התנהגות ניידת של mesenchyme הגולגולת

כאן אנו מפתחים את הכלים הדרושים...

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

סרום מנוצל בתרבויות עובר מכיל מרכיבים לא ידועים שיכול להשפיע על התוצאה של ניסויים במיוחד במחקרים שכלל אינטראקציות איתות. כאן אנו מנוצלים מערכת תרבות מחומצן בסרום ללא ולהראות שעוברי עכברים באמצע ההריון תרבותי ל16-40 שעה להפגין פיתוח מורפולוגיים דומה לעוברים המתפתחים ברחם.

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

תרבית עובר שלם של יונקים (WEC) נמצאת בשימוש נרחב בטרטולוגיה ובביולוגיה התפתחותית. סרום חולדות צנטריפוגה מיידי מסופק בדרך כלל כמדיום הן ל-WEC של עכבר והן לחולדות. בסרטון זה, אנו מדגימים את הפרוטוקול הסטנדרטי שלנו להכנת סרום חולדות איכותי המתאים ל-WEC של יונקים.

הכנת סרום העכברוש מתאים לתרבות עובר שלמה יונקים

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח והתרבות של תאי ציצה עצביים הגולגולת מדגמי העכבר, בעיקר למחקר של הגירה תא. אנו מתארים את טכניקות ההדמיה החי בשימוש וניתוח של מהירות וצורה תא שינויים.

חיתוך, תרבות וניתוח של הגולגולת הראשי ציצה עצביים תאים מעכבר לחקר של ציצה של תא העצבים העצבי והגירה

פרוטוקול זה פותח כדי לנטר לאורך זמן את התכונות המכניות של רקמת הצלחת העצבית במהלך נוירולציה של עובר אפרוח. הוא מבוסס על שילוב של מיקרוסקופ ברילואין ומערכת דגירה על הבמה, המאפשרת הדמיה מכנית חיה של רקמת לוחית עצבית בעוברי אפרוחים בתרבית לשעבר .

מעקב אחר האבולוציה המכנית של רקמה במהלך סגירת הצינור העצבי של עובר אפרוח

למדו שיטה לתפעול פרמקולוגי ישיר בעוברי עכברים בתקופת סגירת הצינור העצבי, תוך עקיפת מטבוליזם אימהי. הטכניקה מאפשרת מחקר מדויק של מסלולים מולקולריים בביולוגיה התפתחותית.

Tube סגירת עצבית בתרבות העובר שלם עכבר

גלה סרטונים נוספים