פרופיל Voltage-Expression מגודרת אשלגן mRNA ערוץ בנוירונים Nigral באמצעות תא יחיד RT-PCR טכניקות

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לזהות messenger RNAs בנוירונים בודדים. דבר זה מושג באמצעות patch clamping והקלטה של נוירונים בודדים, ולאחר מכן שאיבה מלאה של הציטופלזמה מכל נוירון שהוקלט לצורך בידוד ה-mRNA והציטופלזמה. לאחר מכן מיוצר cDNA המוגבר באמצעות PCR.

בסופו של דבר, ניתן לזהות mRNA ספציפי עבור רצפטורים, תעלות יונים ואנזימים באמצעות מערכת דימוי ג'ל קונבנציונלית. שמי הוא, ואני עובד במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טנסי. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה הזו יתקשו בכך, כיוון שכמות ה-mRNA בנורון בודד היא קטנה ביותר ועלולה ללכת לאיבוד בקלות.

התחילו את הפרוטוקול על ידי שימוש בויברטום (vibrator) לחיתוך פרוסות מוח קורונליות בעובי 300 micrometer המכילות את החלק הרוסטרלי המרכזי של ה-substantial nigra. ניתן לבודד מוחות מחולדות spra dolly בנות 15 עד 40 ימים. תהליך חיתוך הפרוסות מבוצע בקירור על קרח בתוך תמיסת חיתוך עם ריכוז סוכרוז גבוה, המחומצנת ב-95%oxygen ו-5%carbon dioxide, וב-pH של 7.4. דגרו את הפרוסות בנוזל חוטר תאמי בצורה מלאכותית (artificial cerebral spinal fluid) עם הזרמת גז של 5%carbon dioxide ו-95%oxygen.

שמרו על טמפרטורה של 34 °C והשאירו את הפרוסות שם למשך 45 דקות. לאחר מכן, שמרו את פרוסות המוח בטמפרטורת החדר עד להקלטה. התחילו בהעברת פרוסת מוח אחת לתא הקלטה של patch clamp.

ביצוע פרפוזיה רציפה של נוזל חוט שדרה מלאכותי מחומצן בטמפרטורה של 32 °C. מלאו את פיפטות ה-patch בתמיסה תו-תאית שעברה אוטוקלאב והוכנה במים נקיים מ-DNAs ו-RNAs. הורידו פיפטה מלאה אל תוך האמבט.

בדקו שההתנגדות היא בין שניים לשלושה mega ohms. ראשית, אתרו את ה-substantia nigra על פי מיקומה האנטומי המובהק. לאחר מכן, באמצעות אופטיקה של namar ועדשה של 60 x, בחרו תאים גדולים ב-SNC וב-SNR לצורך הקלטה.

אלו הם נוירונים דופמינרגיים או GABAergic ללא ספק. השתמשו בתצורת whole cell עם giga tight seal קונבנציונלית כדי לבצע current clamp ו-voltage clamp. הקלטות אלו צריכות להתבצע בדרך כלל בתוך פחות מחמש דקות כדי למזער את פירוק ה-mRNA.

בתוך כדקה, ניתן לספק "טביעות אצבע" אלקטרופיזיולוגיות עבור הנוירונים הרלוונטיים על ידי הקלטה של תכונות הממברנה והספייקים (spiking properties) שלהם בלבד. לאחר קבלת נתונים מנוירון רלוונטי, השתמש ביניקה עדינה עם הפה כדי לשאוב את הציטופלזמה. יש להקפיד שהאיטום ההדוק לא יישבר, שכן אחרת.

פסולת חוץ-תאית, כולל mRNA, עלולה להישאב לתוך פיפטת ה-patch ולזהם את תוכן התא. העבר את תוכן התא לשפופרת PCR בנפח 0.2 milliliter על ידי שבירת קצה הפיפטה והפעלת לחץ חיובי קל. עם הסיום, הנח מיד את השפופרת במקפיא של 20- מעלות כדי לשלול זיהום של פסולת חוץ-תאית שעשויה להכיל mRNAs.

הכינו ביקורת שלילית על ידי איסוף התוכן מפיפטת פאץ' (patch pipette) שהורדה אל תוך הרקמה ללא שימוש בשאיבה. לאחר איסוף תוכן תאי מ-10 עד 20 נוירונים, התחילו מיד בתגובת השעתוק ההפוך. כדי למזער את פירוק ה-mRNAs, התחילו בעיכול של כל DNA גנומי מזוהם באמצעות DNase, למשך חמש דקות, ב-25 degrees Celsius.

שלב זה הוא קריטי להפחתת תוצאות חיוביות שגויות פוטנציאליות ואין לעקוף אותו. לאחר מכן, בצעו אינאקטיבציה ל-DNAs באמצעות 1.2 µL של EDTA בריכוז 25 mM והדגירו את הדגימות בטמפרטורה של 70 °C למשך חמש דקות. כעת, השתמשו בערכה זמינה מסחרית כדי לסנתז CD NA כדי לוודא שה-genomic DNA הוסר לחלוטין.

בצע תגובת ביקורת עבור כל דגימה ללא reverse transcriptase, כאשר כל שאר מרכיבי התגובה נותרים ללא שינוי. אחסן את התוצרים בטמפרטורה של 20°C- עד למועד השימוש בהם לעיצוב ה-PCR.

פריימרים בהתאם לרצפים ב-Gen bank; במידת האפשר, השתמשו בפריימרים המגשרים על אינטרונים כדי לסייע בזיהוי זיהום של DNA גנומי. כדי לבדוק את יעילותם של זוגות הפריימרים, בחנו אותם בשלב הראשון על cDNA של מוח שלם. בצעו הגברה ב-PCR של 5 µL מתוך 30 µL של cDNA למשך 35 מחזורים, תוך שימוש בפרוטוקול תרמי סטנדרטי.

עבור השלב השני, בצע הגברה ב-PCR למיקרוליטר אחד של תוצר ה-PCR מהשלב הראשון עם אותם הפריימרים, והשתמש בפרופיל מחזורים שונה מעט. כעת הפר את התוצרים על ג'ל AGROS בריכוז 2.5% והדמ אותם באמצעות ברומיד אתידיום או GelGreen. תחת אור UV, גזור את פסי ה-DNA החיוביים ורצף אותם באמצעות קיט זמין מסחרית לאיסוף ה-DNA.

בוצעו השוואות בין המאפיינים האלקטרופיזיולוגיים של נוירונים ב-substantia nigra, pars compacta ו-pars reticulata. נוירונים GABAergic ב-SNR הפגינו פריקה ספונטנית בתדר גבוה יותר, של כ-10 hertz. למטחני הפעולה (spikes) היה משך בסיס של כ-millisecond אחד בעת הזרקת זרם להיפר-פולריזציה.

נוירונים GABAergic ב-SNR הפגינו תגובת SAG עדינה המעידה על זרם מופעל חלש. לעומת זאת, נוירונים דופמינרגיים של הסובסטנציה ניגרה הפגינו פריקות ספונטניות בתדר נמוך עם משך בסיס של כ-3 מילישניות. נוירונים דופמינרגיים הראו גם SAG בולט בתגובה להיפר-פולריזציה המעיד על ביטוי חזק של זרם IH בנוירונים GABAergic ב-SNR, אך לא בנוירונים דופמינרגיים.

בדיקת Single cell R-T-P-C-R זיהתה mRNA עבור glutamic acid decarboxylase one, אנזים מפתח בסינתזה של GABA. לעומת זאת, Single cell R-T-P-C-R זיהתה mRNA עבור tyrosine hydroxylase, אנזים מפתח לסינתזה של dopamine, בתאי עצב דופמינרגיים שזוהו ב-SNC וב-SNR, אך לא בתאי עצב GABAergic.

בשלב הבא, נעשה שימוש ב-single cell R-T-P-C-R כדי לאפיין את הביטוי של תת-יחידות ערוץ KV 3 המופעלות על ידי מתח, אשר משנות את התכונות של ערוצי אשלגן תלויי מתח. בדוגמה של SNR gaba, mRNA של נוירונים עבור KV 3.1, 3.2, 3.3 ו-3.4 זוהו בסינגל-סל של נוירון S-N-R-D-A בלבד. KV 3.2, 3.3 ו-3.4 זוהו בנתונים מאוחדים (pooled data).

KV 3.1 זוהה בתדירות גבוהה יותר בנוירונים GABAergic של ה-SNR מאשר בנוירונים דופמינרגיים של ה-nigra, מה שמעיד על רמת ביטוי גבוהה יותר של KV 3.1 בנוירוני GABA מהירים של ה-SNR. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להרכיב כפפות ולשמור על הכלים נקיים משאריות חומרים לאחר השימוש. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי המוח לחקור את הביטוי והתפקוד של רצפטורים ותעלות יונים במערכת העצבים.