פרופיל Voltage-Expression מגודרת אשלגן mRNA ערוץ בנוירונים Nigral באמצעות תא יחיד RT-PCR טכניקות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות RNA שליח בנוירונים בודדים. זה מושג על ידי הידוק טלאי ורישום נוירונים בודדים, ואז שואבים לחלוטין את הציטופלזמה מכל נוירון מוקלט מ-Mr.mRNA ומהציטופלזמה. CD NA מיוצר ומוגבר על ידי PCR.

בסופו של דבר, ניתן לזהות mRNAs ספציפיים לקולטנים, תעלות יונים ואנזימים באמצעות מערכת הדמיית ג'ל קונבנציונלית. שמי הוא, אני עובד במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טנסי. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שכמות ה-MRI בנוירו-נויר בודד קטנה ביותר ואובדת בקלות.

התחל פרוטוקול זה על ידי שימוש בוויברטור לחיתוך פרוסות מוח קורונליות בעובי 300 מיקרומטר המכילות את החלק האמצעי הרוסטרלי של הניגרה המשמעותית. ניתן לבודד מוחות מחולדות ספרה דולי בנות 15 עד 40 יום. הליך חיתוך הפרוסות מבוצע בקור קרח בתמיסת חיתוך סוכרוז גבוהה, מחומצן ב-95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני, וב-pH של 7.4, מדגרים את הפרוסות בנוזל עמוד השדרה המוחי המלאכותי ומבעבעים ב-5% פחמן דו חמצני, 95% גז חמצן.

שמרו על הטמפרטורה על 34 מעלות צלזיוס והשאירו שם את הפרוסות למשך 45 דקות. לאחר מכן שמור את פרוסות המוח בטמפרטורת החדר עד להקלטה. התחל בהעברת פרוסת מוח אחת לתא הקלטה מהדק תיקון.

מועשר ברציפות בנוזל מוחי מלאכותי מחומצן ב-32 מעלות צלזיוס. מלאו את פיפטות המדבקה בתמיסה תוך-תאית חיטוי שהוכנה עם מים ללא DNA ו-RNA. הורד פיפטה טעונה לאמבטיה.

בדוק שההתנגדות היא בין שניים לשלושה מגה אוהם. ראשית, אתר את הניגרה המשמעותית לפי מיקומה המובהק והאנטומי. לאחר מכן באמצעות אופטיקה של נמר ומטרה של פי 60, בחר תאים גדולים ב- SNC וב- SNR להקלטה.

אלה הם נוירונים דופמינרגיים או GABAergic אפשריים ללא היסוס. השתמש בתצורת תא שלם קונבנציונלית אטומה של ג'יגה כדי ליצור מהדק זרם ומהדק מתח. הקלטות אלה בדרך כלל צריכות להתבצע תוך פחות מחמש דקות כדי למזער את פירוק ה-mRNA.

תוך כדקה, ניתן לספק טביעות אצבע אלקטרופיזיולוגיות לתאי העצב המעניינים על ידי רישום הממברנה ותכונות הזינוק שלהם. לאחר קבלת נתונים מתא עצב מעניין, השתמש ביניקת פה עדינה כדי לשאוב החוצה את הציטופלזמה. אין לשבור את החותם ההדוק כאחרת.

פסולת חוץ-תאית, כולל mRNA, עלולה להישאב לתוך פיפטת המדבקה ולזהם את תכולת התא. הוצא את תכולת התא לתוך צינור PCR של 0.2 מיליליטר על ידי שבירת קצה הפיפטה והפעלת לחץ חיובי קל. בסיום, הכניסו מיד את הצינור למקפיא שלילי 20 כדי לשלול זיהום של פסולת חוץ-תאית שעלולה להכיל mRNAs.

בצע בקרה שלילית על ידי איסוף תכולת פיפטת טלאי שהוורדה לתוך הרקמה ללא שימוש בשאיפה. לאחר איסוף תוכן התאים בין 10 ל-20 נוירונים מתחילים מיד את תגובת השעתוק ההפוך. כדי למזער את הפירוק של ה-mRNAs, התחל בעיכול כל DNA גנומי מזהם עם DNA, אחד למשך חמש דקות, A 25 מעלות צלזיוס.

שלב זה הוא קריטי בהפחתת תוצאות חיוביות כוזבות פוטנציאליות ואין לעקוף אותו. לאחר מכן השביתו את הדנ"א עם 1.2 מיקרוליטר של 25 מילי-מולרי EDTA ודגרו על הדגימות בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. כעת, השתמשו בערכה זמינה מסחרית כדי לסנתז CD NA כדי לוודא שה-DNA הגנומי הוסר לחלוטין.

הפעל תגובת בקרה של כל דגימה ללא טרנסקריפטאז הפוך. בעוד שכל שאר מרכיבי התגובה נשארים זהים. אחסן את המוצרים במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהם נחוצים לתכנון PCR.

פריימרים על פי הרצפים בבנק Gen, במידת האפשר, הופכים את מבוא T לתיקונים ראשוניים כדי לסייע באיתור זיהום DNA גנומי. כדי לבדוק את היעילות של זוגות הפריימר, בדוק אותם על CD NA של כל המוח בשלב הראשון. PCR מגביר חמישה מיקרוליטר של 30 מיקרוליטר CDNA למשך 35 מחזורים באמצעות פרוטוקול רכיבה תרמית סטנדרטי.

בשלב השני, PCR מגביר מיקרוליטר אחד של מוצר PCR בשלב הראשון עם אותו תיקון ראשוני ומשתמש בפרופיל רכיבה שונה מעט. כעת הפרד את המוצרים על ג'ל 2.5% AGROS ודמיין אותם באמצעות AUM ברומיד או ג'ל ירוק. תחת אור UV, כרתו את רצועות ה-DNA החיוביות ורצפו אותן באמצעות ערכה זמינה מסחרית לאיסוף ה-DNA.

הושוו המאפיינים האלקטרופיזיולוגיים של נוירונים ב-nigra, pars, compacta ו-pars reticulata. נוירונים של SNR GABAergic הפגינו תדר גבוה יותר, זינוק ספונטני בסביבות 10 הרץ. לדוקרנים היה משך בסיס של כאלפית שנייה אחת עם הזרקת זרם היפרפולריזציה.

נוירונים של SNR GABAergic הציגו תגובת SAG עדינה המצביעה על זרם מופעל שבועי. לעומת זאת, הנוירונים הדופמינרגיים השחורים הפגינו קוצים ספונטניים בתדר נמוך עם משך בסיס של כשלוש אלפיות השנייה. נוירונים דופמינרגיים הראו גם SAG בולט בתגובה להיפרפולריזציה, מה שמצביע על ביטוי חזק של זרם IH בתאי עצב SNR GABAergic, אך לא בנוירונים דופמינרגיים.

תא יחיד R-T-P-C-R זיהה mRNA עבור חומצה גלוטמית דקרבוקסילאז 1, אנזים מפתח בסינתזה של GABA. לעומת זאת, נוירונים דופמינרגיים מזוהים SNC ו-SNR, אך לא בנוירונים GABAergic. תא יחיד R-T-P-C-R זיהה mRNA עבור טירוזין הידרוקסילאז, אנזים מפתח לסינתזת דופמין.

התא היחיד הבא R-T-P-C-R שימש לפרופיל הביטוי של תת-יחידות תלת ערוציות KV המופעלות במתח, אשר משנות את המאפיינים של תעלות אשלגן מגודרות מתח. בדוגמה SNR gaba, mRNAs של נוירונים עבור KV 3.1, 3.2, 3.3 ו-3.4 זוהו בדוגמה של נוירון S-N-R-D-A בלבד. KV 3.2, 3.3 ו-3.4 זוהו בנתונים מאוגדים.

KV 3.1 זוהה בתדירות גבוהה יותר בתאי עצב SNR GABAergic מאשר בנוירונים דופמינרגיים כושיים, מה שמצביע על רמת ביטוי גבוהה יותר של KV 3.1 בנוירונים המהירים של ויקינגים SNR GABA. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור ללבוש כפפות ולשמור על הכלים חופשיים ממדע לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור את הביטוי והתפקוד של קולטנים ותעלות יונים במערכת העצבים.