Name: פרופיל Voltage-Expression מגודרת אשלגן mRNA ערוץ בנוירונים Nigral באמצעות תא יחיד RT-PCR טכניקות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: למדו לזהות mRNA בנוירונים בודדים באמצעות טכניקות patch clamp ו-RT-PCR. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביטוי גנים לערוצי יונים וקולטנים במערכת העצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים R01DA021194 ו R01NS058850.

1. פרוסת המוח הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעירים (15-40 ימים) זכר ונקבה Sprague-Dawley חולדות משמשות. (בנוסף, אנו משתמשים בפרוטוקול זה זהה אצל עכברים.) תחת הרדמה urethane עמוק, בעלי חיים ערופה לבין המוח הוא גזור במהירות החוצה. אז 300 מיקרומטר בעובי פרוסות המוח העטרה המכיל את חלק substantia nigra midrostral של נחתכים על vibratome לייקה (VT-1200S). פרוסת חיתוך ההליך מתבצע סוכרוז, קר כקרח גבוה מחומצן חיתוך תמיסה המכילה (מ"מ): 220 סוכרוז, 2.5 KCl, 1.25 לאא 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl 2, D-10 גלוקוז. הוא מבעבע בתערובת של 95% O CO 2 / 5% 2 כדי לשמור מחומצן ולשמור על pH 7.4. שמור את הפתרון חיתוך קר כקרח במהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות המוח מודגרת בתא דגירה מלאים בנוזל השדרתי חמצן מלאכותי (aCSF) המכיל (מ"מ): 125 NaCl, KCl 2.5, 1.25 לאא 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 2.5 CaCl 2, 1.3 MgCl 2, 10 D-גלוקוז. הוא מבעבע בתערובת של 95% O CO 2 / 5% 2 כדי לשמור מחומצן ולשמור על pH 7.4. טמפרטורת הדגירה היא 34 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות ולאחר מכן בטמפרטורת החדר עד פרוסה במוח מועבר לתא הקלטה. </li></ol> 2. טביעת אצבע של נוירונים אלקטרו nigral <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסה אחת במוח מועבר תא מהדק הקלטה תיקון perfused ברציפות ב 32 עם aCSF מחומצן ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipettes תיקון המגיעים autoclaved בורוסיליקט (KG-33) צינור זכוכית נימי (id 1.10 מ"מ, 1.65 מ"מ od, המלך Precision זכוכית, קלרמונט, CA) באמצעות חולץ PC-10 (Narishige, טוקיו, יפן) ומלא פתרון תאיים מוכן עם מים DNase-RNase חינם (פישר סיינטיפיק) (המכיל 135 mM KCl, 0.5 mM EGTA, HEPES 10 מ"מ, 1.5 מ"מ MgCl 2, ה-pH המותאמת 7.3). Pipettes תיקון יש התנגדויות של 2-3 MΩ באמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Substantia nigra מזוהה לפי המיקום האנטומי הייחודי (איור 1A1-2). תחת הדרכתו החזותי של מיקרוסקופ וידאו (אולימפוס BX51W1) מצויד Nomarski אופטיקה טבילה במים 60x עדשה, תאים גדולים nigra substantia Pars compacta (SNC) ו substantia nigra Pars reticulata (SNR) (אפשרי נוירונים התובע לבין נוירונים GABA) נבחרים הקלטה. קונבנציונלי גיגה אוהם תצורה הדוק כל תא חותם מתקבל (איור 1B1). נוכחי מהדק מתח מנתח מהדק יכול להתבצע. כדי למזער השפלה mRNA, הקלטה אלקטרו צריך להיות קצר (≤ 5 דקות). אפשרות אחת היא להקליט רק את הממברנה ותכונות spiking לתת טביעות אצבעות אלקטרו עבור הנוירונים של אינטרסים (איור B2-3). זו הקלטה קצרה לוקח רק על 1 דקות. </li></ol> 3. הציטופלסמה שאיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי אפיון אלקטרו טביעת אצבע של SNR GABA ונוירונים התובע, יניקה בפה עדין מוחל לשאוב את הציטופלסמה. גרעין התא יכול להיות גם aspirated, וכתוצאה מכך זיהום הדנ"א הגנומי. החותם הדוק לא צריך להיות שבור, פסולת תאית אחרת, כולל ה-mRNA יכול להיות נשאב לתוך פיפטה את התיקון ולזהם את תוכן התא. היושרה של החותם הדוק הוא טוב כל עוד הגידול הנוכחי מחזיק ב -70 mV אינו עולה על 100 הרשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז תוכן התא aspirated הוא גורש לתוך צינור 0.2 PCR מ"ל ידי שבירת קצה פיפטה ו לחץ חיובי קטן. תוכן אחת של התא נאספים לתוך צינור PCR אחת. לאחר שקיבל את תוכן התא, צינור איסוף PCR, טרום מקורר על הקרח, ממוקם מיד במקפיא C -20 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשלול זיהום של פסולת תאית שעשויות להכיל mRNAs, פיפטה את התיקון הוא הוריד לתוך הרקמה מבלי aspirating בציטופלסמה ולאחר מכן את תוכן פיפטה נתונה RT-PCR. </li></ol> 4. שעתוק הפוך (RT) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף תוכן התא ממספר סביר של נוירונים, בדרך כלל 10-20, RT צריך להתחיל מיד כדי למזער את ההשפלה של mRNAs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז כמות התוכן הסלולרי של נוירון יחיד הוא קטן מדי, נוהל בידוד RNA לא מבוצע. כדי להסיר את ה-DNA הגנומי פוטנציאל זיהום, תוכן התא aspirated מתעכל לראשונה על ידי DNase אני (5 μL DNase I ו 1.6 μL DNase אני הצפת, 5 דקות במהירות של 25 ° C). ואז אני DNase הוא מובטל ידי הוספת 1.2 μL 25 mM EDTA ו דוגרים על 75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cDNA הוא מסונתז באמצעות III עילי הפוך transcriptase מבוססי תאים, ישיר ערכת סינתזה cDNA (Invitrogen, טבלה 1). גדיל ראשון cDNA הוא מסונתז על 50 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות, אז התגובה היא מומת על ידי הדגרה ב 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו 1 μL RNase H היא להוסיףעורך לעכל mRNA (37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות). חד גדילי cDNA מאוחסן ב -20 מעלות הגברה PCR מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה מלאה של הדנ"א הגנומי מאומת על ידי שליטה RT-מינוס שבו transcriptase הפוכה מושמט כאשר כל מרכיבי התגובה האחרים היו בדיוק אותו הדבר. </li></ol> 5. שני ה-PCR הגברה הבמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Primers תוכננו על פי רצפים GenBank. במידת האפשר, אינטרון, פורש זוגות פריימר שימשו המסייעים לזהות זיהום הדנ"א הגנומי. זוג רצפים פריימר מפורטים בטבלה 2. היעילות של זוגות פריימר צריך להיות מאומת ראשון של mRNAs המוח כולו, כי התשואה מוצרים חיובית. Primers כל מסונתזים על ידי DNA משולב טכנולוגיות (Coralville, איווה, ארה"ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הראשון, 5 μL של 30 cDNAs μL מוגבר במשך 35 מחזורים בנוכחות זוג פריימר (טבלה 2). פרוטוקול רכיבה תרמית של Cycler תרמית (MasterCycler, Eppendorf, טבלה 1) הוא 2 דקות ב 94 מעלות denaturation הראשונית, ואז 35 מחזורים של 15 שניות על 94 ° C עד לפגל, 30 זה ב 55 ° C כדי לחשל, ו 45 שניות ב 72 מעלות צלזיוס להרחיב, ואחריו 7 דקות הארכה סופית. תקי פולימראז ה-DNA, triphosphates deoxynucleotide (dNTPs), ואת כל המרכיבים האחרים הדרושים הגברה PCR מסופקים על ידי סופר PCR לערבב (Invitrogen, טבלה 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך שלב ה-PCR השני, המוצר של μL 1 מתוך הגברה שלב 1 st PCR משמש כתבנית וזוג תחל אותה משמש בשלב הראשון משמש (טבלה 2). 40 מחזורים הם זמן לרוץ עם סיומת מקוצר עד 30 s. לערבב אותו PCR סופר משמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוצרי ה-PCR מן הגברה 2 nd הבמה מופרדים באמצעות אלקטרופורזה agarose 2.5% ג'ל, דמיינו ידי ethidium ברומיד (0.05 mg/100 מ"ל ג'ל) או gelgreen תחת אור UV, וצילם (איור B4). להקות חיוביות ואז לגזור, חילוץ באמצעות ערכת חילוץ Qiagen (טבלה 1) ואת רצף, והשוו עם רצפים לאור של גני מטרה. </li></ol> 6. נציג התוצאות: (DA) דופאמין נוירונים nigra substantia Pars compacta ו Pars reticulata ועל נוירונים שכנים הקרנת GABA ב nigra substantia Pars reticulata יש מאפיינים אלקטרו ברורים (Zhou et al 2006;. דינג et al 2011).. כפי שמוצג באיור. 1B2, SNR נוירונים GABA התערוכה spiking בתדירות גבוהה ספונטני סביב 10 הרץ. קוצים יש בסיס משך סביב 1 ms. עם hyperpolarizing הזרקת הנוכחי, SNR נוירונים GABA להציג לשקוע depolarizing חלש בתגובה hyperpolarizing הזרקת הנוכחי, המציין ביטוי חלש של אני ח הנוכחי הנוירונים האלה (איור 1B2). לעומת זאת, הנוירונים nigral התובע התערוכה תדר נמוך (סביב הרץ 2) קוצים ספונטנית, כי יש בסיס משך סביב 3 ms. נוירונים התובע גם להציג לשקוע מבוטא בתגובה hyperpolarizing הזרקת הנוכחי, המציין ביטוי חזק של אני ח הנוכחי (איור 1B3) (Zhou et al 2006;.. דינג et al 2011). scRT-PCR לאתר mRNA עבור decarboxylase חומצה גלוטמית 1 (GAD1, האנזים מפתח לסינתזה גאבא ו סמן נוירונים GABA) ב מזוהה electrophysiologically SNR נוירונים GABA, אך לא התובע נוירונים (איור 1B4, 5). לעומת זאת, מזוהה scRT-PCR mRNA עבור hydroxylase טירוזין (TH אנזים המפתח לסינתזת הדופמין סמן נוירונים DA) ב SNC מזוהה electrophysiologically ו SNR נוירונים התובע, אך לא נוירונים GABA (איור 1B4, 5). אז scRT-PCR התוצאות לאשר את הזיהוי נוירון אלקטרו. בשלב הבא, scRT-PCR שימש פרופיל ביטוי של מתח המופעל Kv3 יחידות משנה הערוץ, Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 ו Kv3.4. יחידות משנה אלה תורמים ליצירת מתח מגודרת-K + ערוצי מאפיינים שונים תלוי בהרכב למקטע (דינג et al. 2011). בדוגמה SNR GABA נוירון באיור. 1B4, mRNAs עבור Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 ו Kv3.4 התגלו. בדוגמה SNR התובע נוירון שמוצג Fig.1B5, רק Kv3.2, Kv3.3 ו Kv3.4 התגלו. ב נתונים ונקווה שלנו, Kv3.1 זוהה בתדירות גבוהה יותר נוירונים GABA SNR מאשר נוירונים nigral התובע, המעיד על רמת ביטוי גבוהה יותר של Kv3.1 ב מהיר spiking SNR GABA נוירונים (דינג et al. 2011). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3136/3136fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. זיהוי אלקטרו SNR של GABA נוירונים nigral נוירונים התובע:.. אזורים nigral ניתן לזהות על פי המיקום האנטומי שלהם ברורים A1 מציג את המיקום של SNC ו SNR בקטע Nissl מוכתם העטרה שנתפסו עם מטרה 1X. אזור התאגרף היה capturעורך עם מטרה 10X ומוצגים באמצע כפי שמציין החץ. SNC תאים עשירים לעניים SNR תאים גלויים לעין. A2 מציג את המיקום של SNC ו SNR במקטע, לחיות העטרה בלא כתם שנתפסו עם מטרה 4X. SNC תא עשיר התא עניים SNR גם לזיהוי בבירור. VTA, אזור tegmental הגחון. B1 מראה GABA SNR תיקון נוירון להיות מהודקת במצב כל תא. B2 מציג את המאפיינים אלקטרו הטיפוסי של נוירונים GABA SNR במצב הנוכחי תפס את ההקלטה. אלו נוירונים ספונטנית אש פעולה בתדירות גבוהה הפוטנציאל של זמן קצר ויש לי חלש אני ח בתיווך התגובה לשקוע אל hyperpolarizing הזרקת הנוכחי. B3 מציגה מאפיינים אלקטרו אופייני nigral נוירונים התובע במצב הנוכחי תפס את ההקלטה. הם אש נמוכה פעולה ספונטנית תדירות הפוטנציאלים של משך הזמן הארוך יש בולט אני ח בתיווך סאג (ראש החץ) בתגובה hyperpolarizing הזרקת הנוכחי. לפיכך, SNR נוירונים GABA ונוירונים דופמין nigral מזוהים בבירור electrophysiologically. B4 מראה תמונה של ג'ל scRT-PCR מוצרים אלקטרו מזוהה SNR GABA נוירון. Decarboxylase גלוטמט 1 (GAD1) ​​mRNA אך לא hydroxylase טירוזין (TH) mRNA זוהה. mRNAs עבור Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 ו Kv3.4 התגלו זה GABA SNR נוירון. B5 מראה scRT-PCR לזיהוי של נוירונים mRNAs Kv3 ערוץ התובע SNR נוירון. TH-mRNA אך לא mRNA GAD1 זוהה זוהו electrophysiologically SNR התובע נוירון. mRNAs עבור Kv3.2, Kv3.3 ו Kv3.4 התגלו זה התובע SNR נוירון. B6 מציג נתונים ונקווה. 7. פוטנציאל חיובי כוזב תוצאות שליליות שווא בהתבסס על הניסיון שלנו, מספר גורמים יכולים להוביל שווא scRT-PCR תוצאות שליליות. גורמים אלה כוללים כישלון aspirating כמות מספקת של הציטופלסמה בשל תיקון סתימת פיפטה קצה, זיהום RNase, ולא יעיל primers PCR. תיקון סתימת פיפטה קצה בדרך כלל ניתן לראות על צג וידאו והצביע על ידי התנגדות גישה מוגברת. זיהום RNase יכול להימנע על ידי שחרור משרות יסודית כפפות. יעילות ה-PCR פריימר צריך להיבדק באמצעות RNA סך של רקמת המוח אגרוף (Zhou et al 2008;.. דינג et al 2011). מאז אנחנו תמיד להשתמש DNase קודם לטפל בדגימות שלנו לפני RT, אנחנו לא נתקלים תוצאות חיוביות כוזבות. באופן תיאורטי, ללא DNase העיכול, זיהום הדנ"א הגנומי ובכך זיהוי חיובי כוזב עשוי להתרחש כאשר הגן הוא intronless או זוג פריימר אינו תוחלת האזור אינטרון.

<ol><li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li>
<li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li>
<li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li>
<li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li>
<li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li>
<li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השילוב של הקלטה תיקון מהדק ב פרוסה המוח עם scRT-PCR הראינו כאן לספק שיטה מצוינת לחקור את ביטוי ה-mRNA פרופילים עבור תעלות יונים, קולטנים, ואנזימים מפתח לסינתזה הנוירוטרנסמיטר בנוירונים מאופיין בנפרד. תכונה זו שימושית במיוחד כאשר החלבון המדובר לא ניתן לאתר מקומי בשיטות אחרות כגון אימונוהיסטוכימיה בשל רמת ביטוי נמוכה ו / או היעדר נוגדנים מתאימים (Surmeier et al 1996;.. ואו et al 2009). הרגישות סלקטיביות גבוהה של scRT-PCR לאפשר זיהוי של mRNAs שפע נמוך (Surmeier et al. 1996). בנוסף, ש...

<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table1.jpg" alt="טבלה 1"> טבלה 1. Key ריאגנטים וציוד <img src="/files/ftp_upload/3136/3136table2.jpg" alt="טבלה 2"> טבלה 2. פריימר זוגות לערוץ עכברוש העצבית Kv3, hydroxylase טירוזין (TH) ו decarboxylase חומצה גלוטמית 1 (GAD1) ​​mRNAs עבור scRT-PCR

פרופיל voltage-expression מגודרת אשלגן mrna ערוץ בנוירונים nigral באמצעות תא יחיד rt-pcr טכניקות

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

במערכת העצבים המרכזית, יונקים, סוגים שונים של נוירונים עם מאפיינים מולקולרית ופונקציונלית מגוונים הם התערבבו זה עם זה, קשה להפריד וגם לא מזוהה בקלות על ידי המורפולוגיה שלהם. לכן, לעיתים קרובות קשה לנתח ביטוי גנים בסוג נוירון ספציפי. כאן אנחנו המסמך הליך המשלב כל תא מהדק תיקון טכניקות הקלטה עם תא בודד polymerase תגובת שרשרת הפוכה שעתוק (scRT-PCR) ביטוי mRNA פרופיל סוגים שונים של נוירונים nigra משמעותי. טכניקות אלקטרו משמשים הראשון להקליט את המאפיינים neurophysiological ופונקציונלי של נוירונים בודדים. ואז, הציטופלסמה של נוירונים בודדים nigral מאופיין electrophysiologically הוא aspirated ו נתון ניתוח scRT-PCR לקבל ביטוי פרופילים mRNA לסינתזת אנזימים הנוירוטרנסמיטר, קולטנים, ואת תעלות יונים. הסלקטיביות רגישות גבוהה ולעשות שיטה זו שימושית במיוחד כאשר אימונוהיסטוכימיה לא ניתן להשתמש בשל חוסר של נוגדנים מתאימים או רמת ביטוי נמוכה של החלבון. שיטה זו היא גם החלים על הנוירונים באזורים אחרים במוח.

נוירונים מאופיינים first electrophysiologically. ואז הציטופלסמה של תא העצב המוקלט aspirated וכפופים להפוך שעתוק-PCR ניתוח כדי לזהות את הביטוי של mRNAs לסינתזה אנזימים הנוירוטרנסמיטר, תעלות יונים, ואת הקולטנים.

פרופיל Voltage-Expression מגודרת אשלגן mRNA ערוץ בנוירונים Nigral באמצעות תא יחיד RT-PCR טכניקות

במערכת העצבים המרכזית של יונקים, סוגים שונים של נוירונים בעלי מאפיינים מולקולריים ותפקודיים מגוונים שזורים זה בזה, ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות RNA שליח בתוך נוירונים בודדים. דבר זה מושג באמצעות patch clamping והקלטה של נוירונים בודדים, ולאחר מכן שאיבה מלאה של הציטופלזמה מכל נוירון שהוקלט לצורך בידוד ה-mRNA והציטופלזמה. לאחר מכן, מכינים cDNA המוגבר באמצעות PCR.בסופו של דבר, ניתן לזהות mRNA ספציפי עבור רצפטורים, תעלות יונים ואנזימים באמצעות מערכת דימוי ג'ל קונבנציונלית. שמי הוא, אני עובד במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טנסי. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בתהליך, כיוון שכמות ה-mRNA בנורון בודד קטנה ביותר ועלולה ללכת לאיבוד בקלות.התחילו את הפרוטוקול על ידי שימוש במיקרוטום רטט (vibratome) לחיתוך פרוסות מוח קורונליות בעובי 300 µm המכילות את החלק הרוסטראלי המרכזי של ה-substantia nigra. ניתן לבודד מוחות מחולדות Sprague-Dawley בנות 15 עד 40 ימים. הליך חיתוך הפרוסות מבוצע בטמפרטורת קרח בתוך תמיסת חיתוך עשירה בסוכרוז, מחומצנת ב-95% oxygen ו-5% carbon dioxide, וב-pH של 7.4. דגרו את הפרוסות בנוזל צליקרוספליבי מלאכותי (artificial cerebral spinal fluid) עם הזרמת גז של 5% carbon dioxide ו-95% oxygen.שמרו על טמפרטורה של 34 °C והשאירו את הפרוסות שם למשך 45 דקות. לאחר מכן, שמרו את פרוסות המוח בטמפרטורת החדר עד להקלטה. התחילו בהעברת פרוסת מוח אחת לתא הקלטת patch clamp.בביצוע פרפוזיה רציפה של נוזל מוחי-שדרתי מלאכותי מחומצן בטמפרטורה של 32 °C. מלאו את פיפטות ה-patch בתמיסה תו-תאית שעברה אוטוקלאב והוכנה עם מים נקיים מ-DNAs ו-RNAs. הורידו פיפטה טעונה לתוך האמבט.בדקו שההתנגדות היא בין שניים לשלושה mega ohms. ראשית, אתרו את ה-substantial nigra לפי מיקומה האנטומי המובחן. לאחר מכן, באמצעות אופטיקת namar ועדשה של 60x, בחרו תאים גדולים ב-SNC וב-SNR לצורך הקלטה.אלו הם בוודאי נוירונים דופמינרגיים או GABAergic. השתמשו בתצורת whole cell עם giga tight seal קונבנציונלית לביצוע current clamp ו-voltage clamp. יש לבצע הקלטות אלו בדרך כלל תוך פחות מחמש דקות כדי למזער את פירוק ה-mRNA.בתוך כדקה, ניתן לספק "טביעות אצבע" אלקטרופיזיולוגיות עבור הנוירונים הרלוונטיים על ידי הקלטה של תכונות הממברנה והספייקים שלהם בלבד. לאחר קבלת נתונים מנוירון רלוונטי, השתמש בשאיבה עדינה באמצעות הפה כדי לשאוב החוצה את הציטופלזמה. יש להיזהר לא לשבור את האיטום ההדוק, שמא אחרת.פסולת חוץ-תאית, כולל mRNA, עלולה להישאב אל תוך פיפטת ה-patch ולזהם את תוכן התא. העבירו את תוכן התא לשפופרת PCR של 0.2 milliliter על ידי שבירת קצה הפיפטה והפעלת לחץ חיובי קל. עם הסיום, הניחו מיד את השפופרת במקפיא של 20- מעלות כדי לשלול זיהום של פסולת חוץ-תאית שעשויה להכיל mRNAs.הכינו בקרת שלילה על ידי איסוף התוכן מפלטת פיפט (patch pipette) שהורדה אל תוך הרקמה ללא שימוש בשאיבה. לאחר איסוף תוכן תאי מ-10 עד 20 נוירונים, התחילו מיד בתגובת השעתוק ההפוך. כדי למזער את פירוק ה-mRNAs, התחילו בעיכול של כל DNA גנומי מזוהם באמצעות DNase, למשך חמש דקות, ב-25 degrees Celsius.שלב זה הוא קריטי להפחתת תוצאות חיוביות שגויות פוטנציאליות ואין לעקוף אותו. לאחר מכן, בצעו אינאקטיבציה של ה-DNAs באמצעות 1.2 µL של 25 mM EDTA והדגירו את הדגימות בטמפרטורה של 70 °C למשך חמש דקות. כעת, השתמשו בערכה זמינה מסחרית לסינתזה של CD NA כדי לוודא שה-genomic DNA הוסר לחלוטין.בצע תגובת ביקורת עבור כל דגימה ללא reverse transcriptase, כאשר כל שאר מרכיבי התגובה נותרים ללא שינוי. אחסן את התוצרים בטמפרטורה של 20°C- עד שיידרשו לצורך תכנון ה-PCR.פריימרים בהתאם לרצפים ב-Gen bank; במידת האפשר, יש להכין פריימרים שחוצים את אזור ה-intron כדי לסייע בזיהוי זיהום של DNA גנומי. כדי לבדוק את יעילותם של זוגות הפריימרים, יש לבחון אותם בשלב הראשון על cDNA ממוח שלם. בצעו הגברה ב-PCR של 5 µL מתוך 30 µL של cDNA למשך 35 מחזורים, תוך שימוש בפרוטוקול סטנדרטי למחזור תרמי.עבור השלב השני, בצעו הגברה באמצעות PCR למיקרוליטר אחד של תוצרי ה-PCR מהשלב הראשון עם אותם הפריימרים, והשתמשו בפרופיל מחזורים שונה מעט. כעת, הפרידו את התוצרים על ג'ל AGROS בריכוז 2.5% והדמי unopened אותם באמצעות ברומיד אתידיום או Gel Green. תחת אור UV, גזרו את פסי ה-DNA החיוביים ורצפו אותם באמצעות ערכה זמינה מסחרית לצורך איסוף ה-DNA.הומשוו המאפיינים האלקטרופיזיולוגיים של נוירונים ב-substantial nigra, pars compacta וב-pars reticulata. נוירונים GABAergic ב-SNR הפגינו פריקה ספונטנית בתדירות גבוהה יותר, של כ-10 hertz. למשפיקים (spikes) היה משך בסיס של כ-one millisecond בעקבות הזרקת זרם להיפר-פולריזציה.נוירונים GABAergic ב-SNR הראו תגובת SAG עדינה המעידה על זרם שמופעל באופן חלש. לעומת זאת, נוירונים דופמינרגיים בניגרום הראו פריקים ספונטניים בתדר נמוך עם משך בסיס של כ-3 milliseconds. נוירונים דופמינרגיים הראו גם SAG בולט בתגובה להיפר-פולריזציה, המעיד על ביטוי חזק של זרם IH בנוירונים GABAergic ב-SNR, אך לא בנוירונים דופמינרגיים.בדיקת Single cell R-T-P-C-R זיהתה mRNA עבור glutamic acid decarboxylase one, אנזים מפתח בסינתזת GABA. לעומת זאת, ב-Single cell R-T-P-C-R זוהה mRNA עבור tyrosine hydroxylase, אנזים מפתח לסינתזת דופמין, בתוך נוירונים דופמינרגיים מזוהים של SNC ו-SNR, אך לא בנוירונים GABAergic.בשלב הבא, נעשה שימוש ב-single cell R-T-P-C-R כדי לאפיין את ביטוי תתי-היחידות של תעלת KV three המופעלות על ידי מתח, המשנות את התכונות של תעלות אשלגן תלויות מתח. בדוגמה של SNR gaba, mRNA של נוירונים עבור KV 3.1, 3.2, 3.3 ו-3.4 זוהו בנאורון S-N-R-D-A לדוגמה בלבד. KV 3.2, 3.3 ו-3.4 זוהו בנתונים מאוחדים.KV 3.1 זוהה בתדירות גבוהה יותר בנוירונים GABAergic של ה-SNR מאשר בנוירונים דופמינרגיים של ה-nigra, מה שמעיד על רמת ביטוי גבוהה יותר של KV 3.1 בנוירוני ה-SNR GABA המהירים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בכפפות ולשמור על הכלים נקיים מזיהומים לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי העצבים לחקור את הביטוי והתפקוד של רצפטורים ותעלות יונים במערכת העצבים.

profiling-voltage-gated-potassium-channel-mrna-expression-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

נדגים את ההתקנה וניתוח של microRNA טרום 96-היטב עבור מערכים QPCR באמצעות רובוט, כמו גם על ידי ביד עם פיפטה מדעי רב מטריקס Thermo.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

פרופיל יחיד ביטוי התא מאפשר את הגן מפורט ביטוי בניתוח של תאים בודדים. אנו מתארים שיטות הבידוד של cardiomyocytes, והכנת lysates וכתוצאה מכך עבור microarray או transcriptome qPCR כולו או מטרות ספציפיות.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

שיטת בידוד של תאים ברשתית יחיד הגברה הבאות של cDNAs שלהם מתואר. מתא בודד transcriptomics מגלה את מידת ההטרוגניות הנוכחי הסלולר ברקמות ו חושף גנים סמן חדשים אוכלוסיות תאים נדירות. בפרוטוקול הנלווה יכול להיות מותאם כך שיתאים רבים סוגי תאים שונים.

מתא בודד פרופיל של נוירונים רשתית מתפתחות מבוגרים

חילזון ימי Aplysia californica כבר בשימוש נרחב כמודל נוירוביולוגיה למחקרים על בסיס תאי ומולקולרי של התנהגות. כאן מתוארת מתודולוגיה לחקר מערכת העצבים של Aplysia לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים של מעגלים עצביים מזוהים.

אקליפסיה (1991) הכנת גנגליה לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים

אנו מתארים פרוטוקול של PCR בזמן אמת לפרופיל מיקרו RNA בנוזל המוח והשדרה (CSF). למעט פרוטוקולי מיצוי RNA, ההליך יכול להתארך עד RNA המופק מנוזלים אחרים בגוף, תאים בתרבית, או דגימות רקמה.

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

assay ביטוי גני תא הבודד שדרוש להבנת heterogeneities בתאי גזע.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

אנו מתארים שיטה למיון תאי יונקים בודדים ולכמת את הביטוי של עד 96 גנים מעניינים בכל תא. שיטה זו כוללת שימוש בתקני qPCR פנימיים כדי לאפשר הערכה של ספירת תעתיקים מוחלטת.

תאים יחידים Gene Expression Profiling שימוש FACS ו qPCR עם סטנדרטים פנימיים

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הקריטיים של אמצעי הזהירות הנדרשים לביצוע תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך מולטיפלקס תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ. טכניקה זו היא שיטה פשוטה ויעילה כדי לנתח את פרופיל ביטוי של קבוצת גנים מתא יחיד מאופיין על ידי תיקון-קלאמפ הקלטות מראש.

תגובת שרשרת של פולימראז מולטיפלקס שעתוק במהופך תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ

פרוטוקול זה מסביר כיצד לאסוף נוירונים בודדים, microglia, ו אסטרוציטים מן הגרעין המרכזי של האמיגדלה עם דיוק גבוהה וספציפיות אנטומיים באמצעות לכידת לייזר מיקרוניתוח לכידה. בנוסף, אנו מסבירים את השימוש שלנו במיקרופלואידיג RT-qPCR כדי למדוד תת-קבוצה של התאים הללו.

שילוב לכידת לייזר ובדיקות מיקרופלוטואידים לניתוח פרופילים של תאים בודדים: גישת ביולוגיה של מערכות לתלותיות באופטואיד

אזורים מוחיים שונים כבר מעורבים לשחק תפקיד תפוקות התנהגותיות ברורות, עדיין המנגנונים המולקולריים הבסיסיים עדיין לא ידוע. עבודה זו מתארת שיטה להתרבות במהירות ולנתח קליפת המוח המוח הקטן של חצי הכדור, האזורים הקדמיים והאחוריים של ורמיס, ואת גרעיני המוח הקטן העמוקים על מנת לחקור הבדלים מולקולריים על ידי בידוד RNA ובדיקת הבדלים בביטוי הגנים.

ניתוח אזורי של Cerebellar לניתוח מולקולרי

מחקר זה מציג שיטה איתנה לבידוד mRNA אקסונים באמצעות הכנסות ממברנה נקבוביות, המאפשרת הפרדה מלאה בין נוירונים לנויריטים וטיהור RNA. בשילוב עם RTddPCR, הגישה מאפשרת כימות מוחלט של תמלילים בעותק נמוך, ומקלה על מחקרים של העברת mRNA ותרגום מקומי עם רגישות גבוהה, שחזוריות ויישום ניסויי רחב.

בידוד וכימות של mRNA אקסונליים באמצעות תוספות ממברנה נקבוביות ו-RTddPCR

למדו לזהות mRNA בנוירונים בודדים באמצעות טכניקות patch clamp ו-RT-PCR. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביטוי גנים לערוצי יונים וקולטנים במערכת העצבים.

פרופיל Voltage-Expression מגודרת אשלגן mRNA ערוץ בנוירונים Nigral באמצעות תא יחיד RT-PCR טכניקות

גלה סרטונים נוספים