Name: תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: למד פרוטוקול לניתוח וצביעת אפיתל הבטן בזבובי פירות לצורך אימונוהיסטוכימיה. השיטה מאפשרת חקר מורפוגנזה אפיתליאלית וארגון מחדש של רקמות ב-Drosophila.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם הקרן הלאומית למדע.

1. יום 1 לפני שתתחיל: אוכלוסיה בריאה של זבובים יש לשמור על שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים culturing: להסיר מבוגרים מבקבוקי או צלוחיות לאחר 3-4 ימים של ביצה להניח ולאפשר פיתוח להמשיך בטמפרטורה קבועה עד נדודים 3 rd הזחלים instar ליזום pupariation. המעבר הזחל / גלמי מסומן על ידי היווצרות של prepupae (0 נחשב שעות לאחר puparium היווצרות-APF). גלמים תנועה נבדלים גלמים מבוגרים על ידי צבע לבן שלהם מפני הזחלים, כי טרם החלו pupariation ידי מלבן שלהם, צורה מעוגלת בליטה של ​​spiracles הקדמי. יהיה עליך: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכחול לאיסוף גלמים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדר לח עבור גלמים culturing: צלחת פטרי מרופדת במגבת נייר הרטובות מכוסה בנייר מסנן המסומנים בנקודות זמן שונות של גנוטיפ אוסף, או מין של גלמים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט 1X שנאגרו מלוחים (PBS) לרחצה גלמים </li></ul> , אוסף culturing ובימוי גלמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מכחול הרטובות בעדינות להסיר 0hr APF גלמים מבקבוקי תרבות / צלוחיות למקם אותם מכסה תא לח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מכחול ו 1X PBS לשטוף בעדינות את גלמים להסיר פסולת במקרה גולם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך למיין גלמים לפי מין. Primordia בלוטת המין של גלמים ניתן להשתמש כדי למיין את המינים. Primordia בלוטת המין הגברי הם זוג לרוחב של דיסקים שקוף לראות בקלות דרך לציפורן גלמי כ 2 / 3 לאורך הגוף 5. Primordia בלוטת המין הנשי הם קטנים ולא מזוהים בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גלמים בעמדה שכותרתו כראוי בחדר לח ולחזור טמפרטורה קבועה. תרבות לנקודת הזמן המתאים ההתפתחותי. </li></ol> 2. יום 2: Dissection, קיבעון ו הדגירה נוגדן ראשוני לפני שתתחיל: יהיה עליך: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection stereomicroscope </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כירורגי מלקחיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזמל כירורגי עם מספר 11 להבים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני תשע גם דיכאון זכוכית מנות (מוצר קורנינג # 7220-85) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בארות מנה אחת עם 1X PBS: זהו מאכל שטיפה לניקוי גלמים גזור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בארות מנה שנייה עם חיץ קיבעון </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא לחים עבור הדגירה נוגדן. אנחנו משתמשים בקופסאות פלסטיק כריך סגר מרופדת במגבות נייר הרטובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ קיבוע: 1x PBS, paraformaldehyde 4%, חומצה deoxycholic 0.2% (עבור permeabilization) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלטפורמה Dissection: שקופיות מיקרוסקופ נקה עם חתיכת סרט דו צדדית דבק בצד אחד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> P100 או p200 pipettor </li></ul> בתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בעדינות להסיר את אחד גלמים בכל פעם ולמקם אותם על פלטפורמה דיסקציה עם סיום הקדמי של גלמים מול רוחב הרחב ביותר של הסרט. אם גלמים רטובות יתר על המידה, קודם למחוק אותם יבשים בעזרת מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני גלמים יש דבק לחלוטין לקלטת, להשתמש במכחול כדי למקם אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר גלמים לאוויר יבש לדבוק קלטת (5-10 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם אזמל מנתחים לנתח כל גלמים בילטרלי. מטרה זו מושגת בצורה הטובה ביותר עם חתך מהיר אחד מן הקדמי עד הסוף האחורי של גלמים. אם נעשה כראוי, לחתוך יהיה לחצות בשני הקדמי ואת האחורי זוגות spiracles. לנתח לא יותר מ 10 גלמים בכל פעם כמו כביסה וניקוי דגימות במהירות נחוצה כדי למנוע נזק proteolytic לרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מכחול, העברת כמות קטנה של 1X PBS על גלמים כל גזור כדי לשחרר אותם מן הקלטת. </li></ol> , ניקוי קיבעון ו הדגירה נוגדן ראשוני <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג מלקחיים כירורגיים לתפוס חצי אדם גולם anteriorly ומיד לטבול אותו היטב של צלחת השטיפה. הפלטפורמה לנתיחה צריך להיות מוחלף על ידי צלחת השטיפה על הבמה מיקרוסקופ. המקרה גלמים יש להשאיר על המדגם עד להשלמת העיבוד דגימות מוכנים להרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעודו אוחז את המחצית גולם להשתמש pipettor בעדינות כדי לשטוף את הרקמה הפנימית של הבטן. לחץ רב מדי במהלך הכביסה יכול להוביל לאובדן של תאים אפיתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את החצי נקי גולם למאגר קיבעון בטמפרטורת החדר תהליך החצאים הנותרים גולם דומה. עם, בפועל לנתיחה ושטיפת של 20 חצאים גולם צריך לקחת פחות מ -5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר גלמים כדי לדגור במאגר קיבעון בטמפרטורת החדר 1 (אחד) לשעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קבוע 3x גלמים חמש דקות 1X PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות יכול להיות מעובד באופן מיידי עבור אימונוהיסטוכימיה או עשויים להיות מאוחסנים אתנול 100% ב -20 ° C עד 3 חודשים ללא הפסד של תאים או תגובתיות epitope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאחסן דגימות, לאזן דגימות באמצעות דילולסדרה של PBS: EtOH (03:01, 01:01, 01:03) בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כל דילול לפני ההעברה EtOH 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות יש מחדש equilibrated ב PBS באמצעות סדרה הפוכה לפני עיבוד אימונוהיסטוכימיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק דגימות 1x PBS (בתוספת 2% אלבומין בסרום שור) עבור 1 (אחד) שעה לפני תוספת של הנוגדן הראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן ראשוני מדולל לריכוז המתאים 1X PBS לאורך הלילה 4 ° C ללא נדנדה. </li></ol> 3. יום 3: נוגדן הדגירה משניים, הרכבה הדמיה לפני שתתחיל: יהיה עליך: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני מלקחיים כירורגיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקשורת הרכבה (גליצרול, Vectashield [וקטור מעבדות], או Slowfade זהב [Invitrogen]) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גם דיכאון מיקרוסקופ שקופיות (0.8 מ"מ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips (24 x 40 מ"מ) </li></ul> נוגדן הדגירה ואת הרכבה משניים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות 3x דקה 10 כל אחד עם 1x PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק דגימות 1x PBS (בתוספת 2% אלבומין בסרום שור) עבור 1 (אחד) שעה לפני תוספת של נוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים משני מדולל לריכוז המתאים 1X PBS בטמפרטורת החדר בחושך בלי נדנדה במשך 3 (שלוש) שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות 3x דקה 10 כל אחד עם 1x PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, counterstain גלמים (דוגמה אנו כתם גרעינים עם DAPI [4 ',6-diamidino-2-phenylindole] מדולל PBS למשך 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן דגימות (מינימום של 30 דקות) בתקשורת המתאים לפני הרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופית המדגם. המורפולוגיה של גלמים מונע הרכבה שטוחה. דוגמאות מורכבים בבאר של שקופית דיכאון (שקופית ירידה) עבור הדמיה. מקום 75 ​​100ul התקשורת הרכבה בשקע היטב. מספר דוגמאות יכול להיות מותקן בשקופית אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקרה גולם יש להסיר מן הדגימות לפני הרכבה. אחוז מקרה בודד גולם anteriorly להיות בטוח שלא לתפוס את קרום גלמי פנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג נוסף של מלקחיים בעדינות לתפוס את קרום גלמי פנימי על ידי ראש ולהסיר ממנו במקרה גלמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את המדגם לדיכאון היטב ולהמשיך עיבוד דגימות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות עמדת בדיקה או מלקחיים דגימות אחיד הדיכאון היטב את פני השטח לרוחב פונה כלפי מעלה. בועות אוויר מזדמנים ניתן להסיר עם בדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוריד את coverslip על דגימות מקפיד שלא להכניס בועות אוויר </li></ol> 4. נציג התוצאות: דוגמאות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה לשמור על מורפולוגיה ברוטו של הבטן מבוגר. ערימות תמונה עשוי להיות מוקרן כדי ליצור תמונה דו מימדי או 3-D טיוח ניתן להחיל לחקור טופולוגיה הבטן. <img src="/files/ftp_upload/3139/3139fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. גן פילוח מוצרים תסיסנית גלמים חלבון כנפיים וביטוי Engrailed (En-gal4: כטב"מ-GFP). דמיינו היו בשעה 26 לאחר היווצרות puparium (APF) עם העכבר אנטי WG (4D4: איווה Hybridoma בנק) ואנטי GFP. הגדלה 10x, הקדמי הוא עזב הגבי הוא למעלה. Nucleii היו counterstained עם DAPI. ערימות של כ -50 תמונות (ΔZ בין פרוסות היא 2.5μm) הוקרנו.

<ol><li>Kopp, A., Duncan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anteroposterior+patterning+in+adult+abdominal+segments+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila.</a> Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).</li>
<li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li>
<li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+rearrangements%2C+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li>
<li>Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).</li>
<li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Growth+of+the+Gonads+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 16, 212-224 (1931).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הטכניקות שהוצגו וידאו זה יכול לשמש כדי להכין תסיסנית גלמים ממגוון רחב של נקודות זמן התפתחותי. גלמים מעובד במהלך התקופה של 24 שעות ל 32 שעות APF APF נוטים ביותר לאובדן התא האפיתל. השימוש בחומרי ניקוי (כגון טריטון X-100 ו Tween-20) במהלך השלבים דגירה ממושכת מגבירה את הסבירות של אובדן תאים ולכן אינו מומלץ. במקום זאת, חומצה deoxycholic משמש חומר ניקוי במהלך השלב הראשוני קיבעון. כל הצעדים הבאים מתבצעים 1X PBS ללא חומרי ניקוי. בנוסף, נדנדה דגימות במהלך השלבים דגירה ממושכת מגבירה איבוד התא יש להימנע. דוגמאות ניתן הדמיה באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, תסיסנית גלמים מעובד כפי שתואר יכול להיות גם הדמיה באמצעות מערכת תאורה מובנית מיקרוסקופיה מניב איכות התמונה דומה טכניקות confocal.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection stereomicroscope </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כירורגי מלקחיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזמל כירורגי עם מספר 11 להבים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתשעה גם דיכאון זכוכית מנות (Corning מוצר # 7220-85) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא לחים עבור גלמים culturing </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט 1X שנאגרו מלוחים (PBS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> # 11 באזמל כירורגי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמיים צדדי קלטת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ קיבוע: 1x PBS, paraformaldehyde 4%, חומצה deoxycholic 0.2% (עבור permeabilization) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> P100 או p200 pipettor </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גם דיכאון מיקרוסקופ שקופיות (0.8 מ&quot;מ) </li></ul>

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

הבטן גלמי תסיסנית היא מערכת מודל הוקמה לחקר המורפוגנזה אפיתל לבין התפתחות מינית מורפולוגיות דימורפית 1-3. במהלך התגלמות, אשר משתרע על פני כ 96 שעות (במהירות של 25 ° C), אוכלוסיות של תאים מתרבים דמותי להחליף את האפידרמיס הזחל כדי ליצור את קטעי בטן מבוגר. תאים אלה דמותי, נולד במהלך embryogenesis, קיימים זוגות לרוחב של קינים histoblast בכל מגזר בטן של הזחלים. ארבעה זוגות של קנים histoblast להצמיח לציפורן הגב מבוגר (קינים הגבית קדמית אחורית), לציפורן הגחוני (קינים הגחון) ואת spiracles קשור כל פלח (קינים spiracle) 4. עם puparation, תאים אלה דיפלואידי (להבחין לפי גודל גדול יותר מן הזחל polyploid אפידרמיס התאים-LECs) להתחיל בתהליך סטריאוטיפי של הגירה התפשטות, והחלפת LECs. כלים מולקולריים וגנטיים שונים יכול להיות מועסק לחקור את תרומתם של המסלולים הגנטיים המעורבים המורפוגנזה של הבטן מבוגר. פנוטיפים מבוגר האולטימטיבי מנותחים בדרך כלל לנתיחה הבא של העור הקרני בטן מבוגר. עם זאת, חקירה של התהליכים המולקולריים שבבסיס דורש ניתוח immunohistochemical של האפיתל גלמי, אשר נוכח אתגרים ייחודיים. באופן זמני המורפוגנזה דינמי את יחסי הגומלין של שתי אוכלוסיות נפרדות אפיתל (הזחל ואת דמותי) ליצור רקמת שברירי מועדים לאובדן התא מופרז במהלך עיבוד לנתיחה שלאחר מכן. פיתחנו שיטות לנתיחה, קיבעון, הרכבה הדמיה של האפיתל תסיסנית abdominem גלמי ללימודי immunohistochemical שיוצרים עקבי דגימות באיכות גבוהה מתאים מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal או רגיל.

נוגדן מכתים של<em&gt; תסיסנית</em&gt; גלמים יכול לשפר ניתוח גנטי של מבוגר גנטיקה התפתחותית הבטן. אנו מציגים פרוטוקול שלנו מכתים, דיסקציה קיבוע של נוגדן ו מבוים<em&gt; תסיסנית</em&gt; גלמי הבטן.

בטן הבבאה של ה-Drosophila היא מערכת מודל מבוססת לחקר מורפוגנזה אפיתליאלית ופיתוח של מאפיינים בעלי דמיון מיני...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין את אפיתל הבטן של זבובי הפירות (drosophila puy) עבור אימונוהיסטוכימיה. זאת על ידי ביצוע ניתוח דו-צדדי של זבובי הפירות (drosophila puy) בשלב ההתפתחותי המתאים, והסרת האיברים הפנימיים כך שרק אפיתל הבטן, המורכב מתאי דיסקים אימגינליים (imaginal discs) במצב של שגשוג, תאי אוסטאובלסטים ותאי אפיתל של הלרבה, יישאר מחובר לממברנת הפופה.לאחר מכן, הרקמה מקובעת ומודגרה עם נוגדנים שהוסרו ממעטפת האישון החיצונית, והיא ממיויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה כדי להראות את המורפולוגיה הגסה של אפיתל הבטן ואת הביטוי של חלבוני העניין. שלום, אני ג'ון יודר. המעבדה שלי נמצאת באוניברסיטת אלבמה במחלקה למדעי הביולוגיה.שלום, אני וון. אני סטודנט במעבדת Yoda. היום נדגים לכם את השיטה שלנו לדיסקציה של בובת ה-Drosophila וביצוע immunohistochemistry לבטן בובת ה-Drosophila.ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור תהליכים של מורפוגנזה אפיתליאלית וארגון מחדש של רקמות. אנו משתמשים בטכניקה זו באופן ספציפי כדי לחקור את ההתפתחות של מורפולוגיה בעלת דמיון מיני בבטן של זבוב הדרוסופילה הבוגר. מתוך מבחנה אוכלוסייה בטמפרטורה של 25 °C, זהו פופות (pupae) שזה עתה הוקבעו ושקוטיקולת שלהן טרם החלה להשחים; אלו ייחשבו כנקודת זמן של 0 שעות לאחר הפופציה. בעזרת מכחול רטוב, העבירו בעדינות את הפופות הללו והניחו אותן על מכסה של תא לח. בעזרת המכחול ו-PBS, שטפו בעדינות שאריות ממסבי הפופות במידת הצורך.מיינו את ה-puy לפי מין בשעה 0. ניתן לזהות בקלות את ה-goad primordial של זכרי PF דרך הקוטיקולה של האישון. בערך כשני שלישים לאורך הגוף, ה-goad primordial של הנקבות קטנים יותר ולא ניתנים לזיהוי בקלות.כעת, הניחו את הפופה על נייר הסינון הרטוב בתא הלחות. החזירו את המכסה והעבירו אותם חזרה לסביבה בעלת טמפרטורה קבועה. כאשר בעלי החיים הגיעו לנקודת הזמן ההתפתחותית הרלוונטית, המשיכו לניתוח.יש לשים לב כי אישונים שעיבדו במשך 24 עד 32 שעות לאחר ה-PF הם בעלי הנטייה הגבוהה ביותר לאובדן תאים אפיתליים במהלך העיבוד הבא. הכינו את הדיסקציה על ידי הדבקת פס של סרט דביק דו-צדדי לאורך צד אחד של סלייד שקוף. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי לתפוס בעדינות כל אישון בין השכבות הספריות הקדמיות והניחו אותם על הסרט כשצדם הגבי פונה כלפי מעלה.סדרו מקסימום 10 PPE באופן זה, כדי למנוע עבודה איטית מדי. תוך חמישה עד 10 דקות, ה-PPE יתייבשו לחלוטין, אך לפני שזה קורה, השתמשו במכחול כדי לפרוש אותם באופן אחיד ולסדר אותם במקביל. ייבוש ממושך בשלב זה יפגע באיכותם.לכן, פעלו במהירות. כעת השתמשו בסכין מנתחים כדי לנצח כל בובה A משני הצדדים. בצעו חתך מהיר אחד מהקצה האנטריורי לקצה הפוסטריורי של הבובה.בביצוע נכון, החיתוך יחלק לשניים הן את הזוגות הספריים הקדמיים והן את האחוריים, ויניב חצאים שמאלי וימני סימטריים כדי לשחרר את הבוחנה מהסרט. השתמש במכחול כדי למרוח כמות קטנה של PBS על כל בוחנה מופרדת באמצעות פינצטה כירורגית. אחז בחצי בוחנה בקצה הקדמי שלו טבול אותו בתוך כלי שטיפה מלא ב-PBS על משטח המיקרוסקופ למחקר, ובזמן שהבוחנה עדיין מוחזקת, השתמש בפיפטור כדי לשטוף בעדינות את הרקמה הפנימית על ידי הזרמת PBS אל תוך חלל הבטן.הימנעו מהפעלת לחץ רב מדי, שכן הדבר יגרום לאובדן תאים מהאפיתל. טבלו מיד את הרקמה הנקייה ב-400 µL של בופר קיבוע בטמפרטורת החדר, ונקו את כל חצאי הגולם. בדומה לכך, עם תרגול בדיסקציה ושטיפה, טיפול ב-20 חצאי גולם אמור לקחת פחות מחמש דקות.השאירו את ה-puy להתרגב בבופר הקיבוע בטמפרטורת החדר למשך שעה, ולאחר מכן שטפו אותם שלוש פעמים ב-400 µL של PBS למשך חמש דקות לכל שטיפה. לצורך אחסון הדגימות, שטפו אותן תחילה פעמיים במתנול 100%, ולאחר מכן העבירו אותן לאתנול 100% לאחסון. ניתן לאחסן דגימות אלו באתנול 100% בטמפרטורה של 20- °C למשך עד שלושה חודשים ללא אובדן של תאים או פגיעה בריאקטיביות של האפיטופ.כדי לעבד דגימות מאוחסנות, יש להחזין אותן תחילה ב-PBS באמצעות סדרת אתנול. המשיכו בפרוטוקול האימונוהיסטוכימיה על ידי חסימת הדגימות ב-PBS עם 2%BSA למשך שעה בטמפרטורת החדר וללא תנועה (rocking). תנועה של הדגימות מגבירה משמעותית את אובדן התאים מהאפיתל הבטני.לאחר מכן, החליפו את תמיסת החסימה בנוגדן ראשוני המדולל לריכוז המתאים ב-PBS. דגרו את הדגימות למשך לילה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס ללא תנועת נדנוד ובתוך תא לחות סגור למניעת התאייה ביום למחרת. שטפו את הדגימות שלוש פעמים ב-PBS ללא תנועת נדנוד, למשך 10 דקות לכל שטיפה.לאחר מכן, חסמו את הדגימות למשך שעה ללא טלטול ב-PBS עם 2% BSA. החליפו את תמיסת החסימה בנוגדן משני ב-PBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו את הדגימות בחושך למשך שלוש שעות וללא טלטול.במידת הצורך, בצעו לאחר הנוגדן המשני שלושה שטיפות ב-PBS למשך 10 דקות כל אחת. צבעו את הדגימות בצבע נגדי; לדוגמה, ניתן לצבוע את הגרעינים באמצעות דגירה של 10 דקות ב-DPI המדולל ב-PBS. לאחר מכן, השקיעו את הדגימות בתוסף עיגון למשך 30 דקות לפחות.כדי להרכיב את הדגימות, אחזו בכל מארז אישון בחלקו הקדמי, תוך הימנעות ממגע עם קרום האישון הפנימי בעזרת זוג פינצטות שני. אחזו בעדינות בקרום האישון הפנימי בחלקו העליון. לאחר מכן, משכו בעדינות את הדגימה מתוך מארז האישון.העבירו את דגימת ה-unca לשקף עם שקע המכיל 75 עד 100 µL של מדיום להרכבה (mouthing media). ניתן להרכיב מספר דגימות על שקף אחד. כעת, השתמשו בprobe ובפינצטה כדי למקם את הדגימות באופן אחיד בתוך השקע.סובב אותם כך שפניהם הצדדיות יפנו כלפי מעלה והסר בועות אוויר באמצעות פרובה. לבסוף, הנח בעדינות את זכוכית הכיסוי על הדגימות מבלי להחדיר בועות אוויר בהכנה זו. מיקרוסקופיית הארה מובנית תהיה דומה לטכניקות קונפוקאליות.זוהי הקרנה של 50 תמונות קונפוקאליות עם מרווח של 2.5 microns בין הפרוסות. הרקמה היא בנקודת זמן של 26 שעות לאחר ההפריה (PF), והצביעה מראה את תבנית הביטוי של חלבון wingless ושל GFP המונחה על ידי grail, וכן את הגרעינים. הצד האנטריורי נמצא משמאל ומאפיינים דורסליים נמצאים בחלק העליון של המסך.סרטון זה מדגים כיצד המורפולוגיה הגולמית של הדגימות נשמרת על ידי הפרוצדורה. בכך מתאפשר שחזור תלת-ממדי של ערימות תמונות. ניתן לשמר מספר עשרות אישונים של תולעי West ולהעבירם למסיינ תקיעה בתוך פחות מ-30 דקות.בנוסף, דגימות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה מתאימות לביצוע היברידיזציה, מה שהופך אותו לפרוטוקול בעל ערך למחקרי ביטוי גנים.

drosophila-pupal-abdomen-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע אימונוהיסטוכימיה על הזחל תסיסנית גזור.

תסיסנית הזחל NMJ אימונוהיסטוכימיה

נתיחה ואימונוהיסטוכימיה של זחל, גלמים ומבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רשתיות

המבנים הבוגרים של דרוזופילה נגזרים ממבנים דמויי שק הנקראים דיסקים דמיוניים. ניתוח דיסקים אלה מספק תובנה לגבי תהליכים התפתחותיים רבים כולל קביעת רקמות, קביעת גבול תאים, התפשטות תאים, מפרט גורל התא וקוטביות תאים מישוריים. פרוטוקול זה משמש להכנת דיסקים דמיוניים למיקרוסקופ אור/פלורסנט.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ Melanogaster דרוזופילה

מטרת טכניקה זו היא לאפשר לחוקרים לבצע דיסקציה, צביעה חיסונית והרכבה של דיסקים של עין גולם מדרוזופילה מלנוגסטר בכל גיל.

נתיחה והתקנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי דיסקי העין

מוצג פרוטוקול של צביעה חיסונית שלמה על עוברי כנימות, בו מטופלים תנאים קריטיים להפחתת צביעת רקע והגברת חדירות הרקמות. תנאים אלה פותחו במיוחד לזיהוי יעיל של ביטוי חלבונים ברקמות העובריות של כנימות.

זיהוי של תנאים קריטיים לImmunostaining באפונה בכנימות עוברים: הגדלת רקמות חדירות והפחתת מכתים רקע

היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים ברקמות דרוזופילה הוא קריטי עבור הלומדים שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח. הנה התיאור של תהליך פשוט לנתח כנפיים הגולמי. אלה כנפיים יכול לשמש כדוגמאות מספר טכניקות (אימונוהיסטוכימיה, PCR assay, וכו ').

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

השחלה דרוזופילה הוא מערכת דגם מעולה ללימוד פיתוח גומחת תאי גזע. על פי שיטות ניקוד השחלות זחל ומבוגרים פורסמו, השחלה הגולמי והניתוחים דורשות טכניקות שונות זה לא פורסמו בפירוט. כאן אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול לנתח, מכתים של הרכבה השחלות הגולמי.

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

מאמר זה מציג שיטה כירורגית ניקוד דרוזופילה הרשתיות הגולמי יחד עם פרוטוקולים עיבוד רקמה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA-חילוץ.

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

הפרוטוקול הנוכחי מפרט את ההכנה וההדמיה של רקמה קבועה של נוטום דרוזופילה פופאל. זה יכול לשמש עבור רקמה שלמה או פצועה, ואת הארכיטקטורה המקורית של הרקמה נשמרת. ההליכים לניתוח, תיקון וצביעה מתוארים כולם במאמר זה.

ניתוח, תיקון והדמיה של ה-Drosophila Pupal Notum

דרוזופילה היא מודל רב עוצמה להבנת מנגנונים בסיסיים של מיוגנזה. פרוטוקול זה לדיסקציה והכנה של חצאי בית החזה מאפשר ניתוח מיקרוסקופיה של שרירי תעופה עקיפים הן משלב הגולם והן משלב הבוגר. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה קונפוקלית של מורפולוגיה תאית, לוקליזציה של חלבונים, מבנה שרירים והיבטים רבים אחרים של מיוגנזה.

דיסקציה של שרירי טיסה עקיפים של Drosophila melanogaster לגישות מיקרוסקופיות

למד פרוטוקול לניתוח וצביעת אפיתל הבטן בזבובי פירות לצורך אימונוהיסטוכימיה. השיטה מאפשרת חקר מורפוגנזה אפיתליאלית וארגון מחדש של רקמות ב-Drosophila.

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

גלה סרטונים נוספים