Name: תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: למד הדמיה חיה של חיידקים Bacillus subtilis ו-Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה טווח-זמן אוטומטית. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר התנהגות תאים בודדים ודינמיקת חלבונים לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה בקבוצה של JWV נתמך על ידי מארי קירי של האיחוד האירופי Reintegration המלגה, גרנט Sysmo2 (NWO-ALW/ERASysBio), אופק מענק (ZonMW) ועל ידי מלגה VENI (NWO-ALW). הקבוצה של OPK נתמכת על ידי מספר מענקים STW (NWO), SYSMO1 (IGdeJ) ו SYSMO2 מענק, Eurocores ESF SynBio מענק (SynMod) ועל ידי המרכז Kluyver עבור Genomics של תסיסה תעשייתי במכון מובילות המזון והתזונה.

<ol><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistability%2C+epigenetics%2C+and+bet-hedging+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev Microbiol. 62, 193-193 (2008).</li>
<li>Dubnau, D., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bistability+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bistability in bacteria.</a> Mol Microbiol. 61, 564-564 (2006).</li>
<li>Locke, J. C., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (5), 383-383 (2009).</li>
<li>Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bet-hedging+and+epigenetic+inheritance+in+bacterial+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Bet-hedging and epigenetic inheritance in bacterial cell development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (11), 4393-4393 (2008).</li>
<li>de Jong, I. G., Veening, J. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochronic+phosphorelay+gene+expression+as+a+source+of+heterogeneity+in+Bacillus+subtilis+spore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Heterochronic phosphorelay gene expression as a source of heterogeneity in Bacillus subtilis spore formation.</a> J. Bacteriol. 192 (8), 2053-2053 (2010).</li>
<li>Veening, J. W., Murray, H., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+cell+cycle+regulation+of+sporulation+initiation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A mechanism for cell cycle regulation of sporulation initiation in Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 23 (16), 1959-1959 (2009).</li>
<li>Eberhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+localization+of+choline-utilization+proteins+in+Streptococcus+pneumoniae+using+novel+fluorescent+reporter+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems.</a> Mol Microbiol. 74 (2), 395-395 (2009).</li>
<li>Vasantha, N., Freese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+changes+during+Bacillus+subtilis+sporulation+caused+by+deprivation+of+guanine+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Enzyme changes during Bacillus subtilis sporulation caused by deprivation of guanine nucleotides.</a> J Bacteriol. 144 (3), 1119-1119 (1980).</li>
<li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+death+in+an+organism+that+reproduces+by+morphologically+symmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division.</a> PLoS. Biol. 3, 45-45 (2005).</li>
<li>Rosenfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1962 (2005).</li>
<li>Guberman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSICIC%3A+noise+and+asymmetry+in+bacterial+division+revealed+by+computational+image+analysis+at+sub-pixel+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">PSICIC: noise and asymmetry in bacterial division revealed by computational image analysis at sub-pixel resolution.</a> PLoS. Comput. Biol. 4 (11), 1000233-1000233 (2008).</li>
<li>Montero, L. lopis P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466, 77-77 (2010).</li>
<li>Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types%3A+Induction+of+transformation+by+a+desoxyribonucleic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J Exp. Med. 79, 137-137 (1944).</li>
<li>Hoskins, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+of+the+bacterium+Streptococcus+pneumoniae+strain+R6%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6.</a> J Bacteriol. 183, 5709-5709 (2001).</li>
<li>Martin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+is+part+of+a+competence-induced+operon+and+controls+lysogenic+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The recA gene of Streptococcus pneumoniae is part of a competence-induced operon and controls lysogenic induction.</a> Mol Microbiol. 15, 367-367 (1995).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בניגוד אחרים טכניקות רבות תא בודד, בשיטה זמן לשגות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתואר כאן ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר ההיסטוריה של תא ספציפי לגבי אבותיה, התנהגותה, אירועים חלוקה. בשילוב עם היזמים היעד או חלבונים שכותרתו fluorescently, מסלול ספציפי ההפעלה התפתחותית ניתן בעקבות בזמן ולוקליזציה חלבון, כמו גם הדינמיקה חלבון יכול להיות פיקוח במהלך התפתחות חיידקים. כפי שצוין לעיל, מחקרים להתרכז מיני חיידקים שונים ניתן לבצע על ידי התאמת תנאי הגידול בהתאם לדרישות עבור חיידק ספציפי. המגבלות רק נתקלנו קשורות התנאים לצמיחה גודל המדגם. בשל הסביבה אטום, התנאים בינוני לא ניתן לשנות במהלך הניסוי. יתר על כן, לכל היותר ארבעה זנים לכל ניסוי ניתן לפקח ביעילות. בהתחשב כמה צעדים קריטיים, שיטת הניתוח תא יחיד המתואר כאן יכול בקלות להיות מיושם באמצעות כל מיקרוסקופ אוטומטיות. בחלק הבא, סקירה של השלבים הקריטיים תינתן. מידע מפורט ניתן למצוא את הטקסט העיקרי הכנה כללי:. רצוי לבדוק את הגדרות פוקוס אוטומטי נדרש חיידק ספציפי לפני הניסוי. כמו כן, הגדרות אופטימליות המשוער עבור להדמיה של הקרינה יש לקבוע מראש, אם אפשר. יתר על כן, לאחר שהוכן קו הזמן עוזר לקבל את כל החומר מוכן לשימוש בזמן (לפני ההתחממות קאמרית מיקרוסקופ, תכנות ההגדרות מיקרוסקופ, בהכנת שעה שקופית אחת לפני התאים נמצאים בשלב הצמיחה הרצוי, ראה תרשים 1) . הצמיחה של B. subtilis ב TLM ו CDM: TLM ו CDM מוגדרים כימי התקשורת הרעבה שבו B. subtilis רק גדל לאט. זמן התקופה שבה התאים גדלים בתקשורת עלול להיות ממושך בהתאם לזן הספציפי. הצמיחה האיטי מונע תאים נערמים אחד על השני הכנת המדגם מיקרוסקופ:. בועות אוויר בין מסגרת הגן, את השקופית זכוכית לכסות את הפתק צריך להיות מונע על מנת למנוע ייבוש נרחב של המדיום agarose מבוסס. הוא הדין ממשק בינוני / לכסות את הפתק. זה חיוני כדי לאפשר לתאים יבש מספיק, כדי למנוע שחייה ו / או צמיחה שכבת מרובים זמן לשגות מיקרוסקופ פלואורסצנטי:. טרום ההתחממות של השקופית, כמו גם את חדר הסביבה הוא חיוני כדי למנוע בעיות פוקוס מרכזי. תאים יש לבחור באמצע כרית אגר, שכן אלה יש את הסיכוי הגבוה ביותר להישאר בתחום ולהתמקד במהלך הניסוי (בתנאי המדגם היה יבש מספיק טוב). עד 10 מקומות לכל הניסויים עדיין עובד כמו שצריך. לאחר שנבחר על התא הראשון עניין רק להשתמש בתוכנה כדי לכוון את המיקוד (ראה טקסט לפרטים נוספים). בדוק אם התאים הם עדיין להתמקד במהלך השעות הראשונות של הניסוי ב 30 דקות במרווחים ניתוח:. חשוב לבדוק לפני ניתוח ההליכים הוארכה אם הרקע של המדיום יש ערכים דומים בערוצים פלואורסצנטי. חלקיקי אבק קטנים, רכיבים בינוני, עדשות מלוכלך או גושים זעירים agarose יכול לתרום הקרינה גדל באופן מקומי, מה שהופך את הסרט קשה או בלתי אפשרי לנתח בעיות הירי:. אם התאים לגדול על גבי אחד את השני, זה עלול גם להצביע על כך coverslip היה מצורף מוקדם מדי או כי המדיום אינו מתאים לצמיחה של monolayers microcolony. אם התאים עניין ברציפות למות בטרם עת, ואילו בתאים אחרים בשקופית לחלק בשמחה, אולי כדאי לך לבדוק אם אתה שם את UV-מסנן במצב. זה יכול גם לעזור כדי להקטין את זמן החשיפה או עוצמת האור במהלך הניסויים הארוך.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> ג&#39;ין מסגרת </td><td> ABgene </td><td> AB-0578 </td><td> 1.7 x 2.8 ס&quot;מ </td></tr><tr><td> רזולוציה גבוהה נמוך ההיתוך agarose </td><td> סיגמא </td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td> מכסה גדול להחליק </td><td> מספר </td><td></td><td> 24 x 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> אם רוצים, קרום צבע, למשל FM 5-95 </td><td> Invitrogen </td><td> T23360 </td><td> צבעים קרום אחרים זמינים גם: <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td> זמן לשגות מיקרוסקופ עם תא סביבתי </td><td> מספר </td><td></td><td> לראות את הפרטים של המכשיר שלנו בסעיפים המתאימים </td></tr></tbody></table>

תא הדמיה חיה של bacillus subtilis ו streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

במהלך השנים האחרונות הפך מדענים מודעים יותר ויותר כי נתונים שהתקבלו בניסויים הממוצע באוכלוסייה חיידקים מבוסס אינם נציג מעמד התנהגות, או הפנוטיפ של תאים בודדים. בעקבות תובנה חדשה זו מספר מחקרים תא בודד עולה בהתמדה (עבור הסקירות האחרונות לראות 1,2,3). עם זאת, רבים של טכניקות תא בודד להחיל אינם מאפשרים מעקב אחר התפתחות והתנהגות של תא אחד בודד מסוימת בזמן (cytometry זרימת למשל או במיקרוסקופ רגיל). כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של שיטה מיקרוסקופית שימוש במחקרים האחרונים מספר 4, 5, 6, 7, אשר מאפשר הקלטה הבאים (הקרינה של) תאים חיידקיים בודדים של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות צמיחה וחלוקת במשך דורות רבים. הסרטים וכתוצאה מכך ניתן להשתמש כדי לבנות שושלת עצים פילוגנטי על ידי התחקות בחזרה את ההיסטוריה של תא בודד בתוך אוכלוסיה שמקורם מאב קדמון משותף אחד. זמן לשגות זה מיקרוסקופ פלואורסצנטי השיטה יכולה לשמש לא רק לחקור, צמיחה חלוקה והתמיינות של תאים בודדים, אלא גם לנתח את ההשפעה של ההיסטוריה התא ממוצא על התנהגות סלולרית ספציפית. יתרה מכך, זמן לשגות מיקרוסקופ הוא אידיאלי לבחון ביטוי גנים הדינמיקה לוקליזציה חלבון במהלך מחזור תא החיידק. השיטה מסביר כיצד להכין את תאים חיידקיים ולבנות את השקופית מיקרוסקופ כדי לאפשר את תולדה של תאים בודדים לתוך microcolony. בקיצור, תאים בודדים הם הבחינו על משטח מוצק למחצה המורכב בינוני צמיחה בתוספת agarose שבו הם גדלים ומתחלקים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתוך חדר מבוקר טמפרטורה סביבתיים. תמונות נלכדים במרווחים ספציפיים מנותחים מאוחר יותר בעזרת תוכנות קוד פתוח ImageJ.

פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לפקח על התנהגות תא בודד של חיידקים שונים בתוך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות זמן לשגות. יתר על כן, אנו מספקים הנחיות כיצד לנתח את תמונות מיקרוסקופ.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

במהלך השנים האחרונות, מדענים הפכו מודעים יותר ויותר לכך שנתונים ממוצעים המתקבלים מניסויים המבוססים על אוכלוסיות מיקרוביאליות אינם...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לדימוי תאים חיים במהלך גדילה וחלוקה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, כדי שניתן יהיה לחקור את ההשפעה של ההיסטוריה והשושלת התאית על ההתפתחות התאית של חיידקים. הדבר מושג תחילה על ידי העברת התאים ממדיום נוזלי עם ריכוזי חומרי תזונה גבוהים יחסית למדיום הרעבה נוזלי. לאחר מכן, משתמשים בslideClass מיקרוסקופית שעל גביה יגדלו התאים החיידקיים לתוך מיקרו-מושבה.שכבת מונולייר הוכנה. לאחר מכן, הוקלט סרטון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשיטת time lapse. לבסוף, הסרטון עובד והנתונים נותחו.בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות התפתחות של תא חיידקי בודד באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשיטת time-lapse. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה סטנדרטית, הוא שהיא מאפשרת ניטור של דינמיקת חלבונים, התנהגות תאית והתפתחות של תאים בודדים לאורך זמן. הפרוצדורה תוצג על ידי Cone, סטודנט לדוקטורט מהמעבדה שלי. להכנת *B. subtilis*, יש להוסיף תאים ממטמון של 80°C- ל-10 milliliters של מדיום למיקרוסקופיה בשיטת time-lapse (או TLM medium) בבקבוקי ניעור סטריליים, בתוספת אנטיביוטיקה במידת הצורך. יש לגדל את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 30°C ובמהירות של 225 RPM בבקבוק ניעור סטרילי. למחרת בבוקר, יש לדלל את התאים ביחס של 1:10 במדיום מוגדר כימית (CDM) שחומם מראש וללא אנטיביוטיקה. יש לגדל את תאי ה-*B. subtilis* עד לשלב האקספוננציאלי הבינוני, תהליך שארך כארבע שעות. יש למדוד את הבליעה (absorbance) של התרבית ב-600 nanometers ולדלל את התאים עד לערך a 600 של כ-0.035.בשימוש ב-CDM. ערך OD זה מבטיח שתאים בודדים, עם מרווחים מתאימים ביניהם, יונחו על תגית המיקרוסקופ לצורך מיקרוסקופיה של צילום רציף (time-lapse). שעה אחת לפני שהתאים מגיעים לאמצע שלב הצמיחה האקספוננציאלית.הכינו את זכוכית המיקרוסקופ על ידי ניקוי שתי זכוכית עם 70% ethanol ומים. הסירו את אחד הכיסויים מפלסטיק ממסגרת הגנים (gene frame), תוך הקפדה שלא לגרום לפירוק של הכיסוי מפלסטיק בצדו השני של המסגרת. הצמידו את מסגרת הגנים למרכזה של אחת הזכוכיות על ידי הדבקה תחילה של צד אחד, ולאחר מכן הנחיית שאר המסגרת באמצעות הציפורן.השתמש במיקרוגל כדי להמיס 150 milligrams של aros ברזולוציה גבוהה ובנקודת התכה נמוכה. ב-10 milliliters של CDM, ודא שה-aros מומס לחלוטין כדי למנוע פלואורסצנציית רקע. העבר בפיפט 500 microliters של agro CDM החם למרכז מסגרת הגן, תוך וידוא שכל השטח, כולל השוליים, מכוסה במלואו.עבדו במהירות כדי למנוע ייבוש יתר של ה-agros. הניחו את הזכוכית השנייה על מסגרת הגן הממולאת ב-Aros CDM, תוך ניסיון להימנע מבועות אוויר. הניחו את ה"סנדוויץ'" במצב אופקי בטמפרטורה של 4°C למשך 45 דקות כדי לאפשר ל-agros להתמצק מספיק.לאחר שהאגר התגבש, החלק בעדינות את זכוכית העליונה החוצה. השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך רצועות אגר ברוחב של כ-5 מילימטרים, עליהן יגדלו החיידקים. ניתן להשתמש במקסימום של שלוש רצועות לכל תכריכ, המופרדות במרווחים של כ-4 מילימטרים מכל צד.חללים אלו יספקו אוויר החיוני לצמיחת ה-Blu. הסר בזהירות את הכיסוי הפלסטי השני והאחרון ממסגרת הגנים כדי לחשוף את הצד הדביק. טפטף תאים בודדים בערך ב-2.5 µL של נוזל על המצע המוצק, החל מהחלק העליון של פד ה-agros מבלי לגעת בו.בעזרת קצה הפפיתה, אפשרו למצע להתפשט באופן אחיד על ידי הטיה של הזריקה למעלה ולמטה. הניחו כיסוי מיקרוסקופ נקי על מסגרת הגן כדי להצמיד את זכוכית הכיסוי באופן מלא. השתמשו בציפורן כדי להפעיל לחץ לאחר שהתאים הוטענו.חיוני להמתין עד שהנוזל יתייבש מספיק כדי למנוע תאים "שוחים" וצמיחה בשכבות מרובות. עם זאת, אם התאים יתייבשו זמן רב מדי, הם יתקשרו לצמוח לשכבה אחת של micro cholon. לכן, הזמן הנדרש לייבוש השקופיות תלוי בניסוי ולא ניתן למדידה מדויקת.וכתוצאה מכך, יש כמובן לפתח תחושה לגביו. כדי למנוע בעיות של פוקוס אוטומטי במהלך השעות הראשונות של ניסוי ה-time-lapse, חממו מראש את השקופית למשך שעה אחת ב-30 °C כדי להכין אותה למיקרוסקופיה בשיטת time-lapse. חממו מראש את תא הסביבה למשך שעתיים לפחות. לפני תחילת הניסוי, בחרו את העדשות, המסננים והמראות הדיכרואיות המתאימים בהתאם למערך הניסוי שלכם.בניסויים ארוכים, ודאו שמסנן UV ממוקם בין מקור האור למדגם. בנוסף, במידת האפשר, חסמו חלק מאור העירור באמצעות מסנני צפיפות ניטרלית (neutral density filters) כדי למזער את החשיפה. תכננו את הניסוי בהתאם למערך הניסויי הספציפי.מומלץ לקבוע את כמות האור הדרושה עבור קונסטרוקטים ספציפיים, כמו גם את הגדרות המיקוד האוטומטי עבור מיקרוסקופי time-lapse אחרים או עבור חיידקים, לפני הניסוי בפועל. זמני חשיפה קצרים יותר ורמות נמוכות יותר של אור עירור ימזערו את ההגבהלה (bleaching) ואת הרעילות הפוטו-כימית. השתמש באור מיקרוסקופי עבור פונקציית המיקוד האוטומטי. לבסוף, הנח את השקף שהוכן בתא הסביבתי המחומם מראש של המיקרוסקופ ועקב אחר צמיחת תאים בודדים לשכבה אחת של מיקרו-מושבות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius.ניסוי פלואורסצנציה מוצלח בשיטת time-lapse יניב מונו-שכבה של מיקרו-מושבה הממוקמת כולה בתוך שדה הראייה. בסוף הניסוי בסרטון זה, ניתן לראות בצד שמאל תמונת שדה בהיר (bright field) ובצד ימין תמונת פלואורסצנציה.כאן מוצגת דוגמה למיקרו-מושבה של B Subtles שבה חלק מהתאים גדלו זה על גבי זה, מה שמקשה על מעקב מדויק אחר ההיסטוריה שלהם וכן על מדידה נכונה של רמות הפלואורסצנציה שלהם. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעירכאות טובה לגבי האופן שבו ניתן להכין בהצלחה דגימה מיקרוסקופית למיקרוסקופיה של מסלול זמן (time-lapse) וכיצד לבצע מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מסלול זמן. ניסוי עם תאי BACE.

live-cell-imaging-bacillus-subtilis-streptococcus-pneumoniae-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הקלטה התנהגות תאיים ב Myxococcus xanthus Biofilms באמצעות זמן לשגות Microcinematography

מאמר זה מתאר את התהליך להכנת גרסה מתויגת-fluorescently של bacteriophage מבדה, זיהום...

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

מקור: Schlimpert, S. et al. הדמיית זמן-lapse פלואורסצנטית של מחזור החיים השלם של S. venezuelae באמצעות מכשיר מיקרופלואידי. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הדמיית זמן-lapse פלואורסצנטית של מחזור החיים המלא של החיידק Streptomyces venezuelae באמצעות מכשיר מיקרופלואידי כדי להמחיש נביטה, צמיחת קורים ונבגים בזמן אמת.

הדמיית זמן-lapse פלואורסצנטית של מחזור החיים של Streptomyces venezuelae

מקור: Makowski, Ł., ואחרים. הדמיה של תאים חיים של טורף חיידקי Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה בזמן-לפס. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים הדמיית פלואורסצנציה בזמן אמת של חיידק בדלוביבריו הטורף E. coli מקובע מתחת לכרית אגרוז, ומאפשר הדמיה בזמן אמת של שכפול תוך-תאי ושחרור צאצאים לצורך חקר טורף חיידקים ואינטראקציות בין מאכסן-פתוגנים.

דימות טיימלפס בתאי חיים של טורפות בקטריובורוס של Bdellovibrio על E. coli

אנו מתארים רזולוצית סופר שיטת הדמיה כדי לבחון את המבנה הארגוני של FtsZ טבעת החיידקים, מנגנון חיוני לחלוקת תא. שיטה זו מבוססת על ניתוחים כמותיים של מיקרוסקופיה תמונות לוקליזציה photoactivated (PALM) ויכולה להיות מיושמת על חלבוני cytoskeletal חיידקים אחרים.

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

הבנת תפקידה של תהליכים חיוניים של חיידקים הוא מאתגר. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ עם צבעי במטרה יכול לספק תובנות מפתח לתוך התא מיקרוביאלי התקדמות וצמיחה של מחזור התא. כאן, Agrobacterium tumefaciens משמש חיידק דגם כדי לסמן שיטות הדמיה תא חי פלואורסנציה לאפיון תהליכים חיוניים.

חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

אנו מציגים שיטה לניתוח microfluidic של שושלות בודדים תא החיידק Bacillus subtilis כדוגמא. השיטה מתגבר על החסרונות של שיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה בכך שהוא מאפשר התבוננות של מאות דורות תא תחת תנאי הגידול בחוזקה לשליטה ואחידה.

ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis

מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד כדי לחקור את הדינמיקה לוקליזציה של חלבון subcellular ולנטר שינויים מורפולוגיים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה ב subtilis מקרתגו ו סטיילוולוקוקוס.

מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית החיה כדי לחקור את הלוקליזציה של חלבון Subcellular ושינויי מורפולוגיה של תאים בחיידקים

הדמיה של תאים חיידקיים היא גישה ביולוגיה מערכות מתפתחים התמקדו הגדרת תהליכים סטטיים ודינאמיים המכתיבים את הפונקציה של מכונות macromolecular גדולות. כאן, שילוב של הדמיה תא כמותי לחיות וטומוגרפיה מסוג ההקפאה משמשת לחקר הלגיונרים האלה הפרשת מערכת הפרשה ופונקציות.

החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

מוצג כאן פרוטוקול המתאר ניטור של מחזור החיים המלא של חיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצני זמן לשגות בשילוב עם כרית agarose ומנות הדמיה תא.

הדמיה חיה של מחזור החיים של החיידק טורף Bdellovibrio bacteriovorus באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצני זמן לשגות

בכתב יד זה, אנו מספקים פרוטוקול מקיף להערכת הישרדות אנטיביוטיקה עבור Pseudomonas aeruginosa ו - Staphylococcus aureus, הפיכת פלסמידים ל - P. aeruginosa ו- S. aureus כדי ליצור זני כתב ולדמיין וריאנטים פנוטיפיים, כגון מתמידים, על ידי מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהילוך מהיר.

הדמיית מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהילוך מהיר של Pseudomonas aeruginosa ו - Staphylococcus aureus פנוטיפים הטרוגניים

למד הדמיה חיה של חיידקים Bacillus subtilis ו-Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה טווח-זמן אוטומטית. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר התנהגות תאים בודדים ודינמיקת חלבונים לאורך זמן.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

גלה סרטונים נוספים