תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות
July 28th, 2011
פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לפקח על התנהגות תא בודד של חיידקים שונים בתוך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות זמן לשגות. יתר על כן, אנו מספקים הנחיות כיצד לנתח את תמונות מיקרוסקופ.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות תאים חיים באמצעות גדילה וחלוקה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כך שניתן יהיה לחקור את ההשפעה של היסטוריית התאים והמוצא על התפתחות התאים של חיידקים. זה מושג על ידי העברת התאים תחילה ממדיום נוזלי עם ריכוזי חומרים מזינים גבוהים יחסית למדיום רעב נוזלי. לאחר מכן, שקופית מיקרוסקופית שעליה תאי החיידקים יגדלו למושבת מיקרו
.מכינים חד שכבתית. לאחר מכן מוקלט סרט מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר. לבסוף, הסרט מעובד והנתונים מנותחים.
בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות התפתחות של תא חיידקי בודד באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בזמן-lapse. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות כמו זרימה ציטומטרית ומיקרוסקופיה סטנדרטית, הוא שהיא מאפשרת ניטור של דינמיקת חלבונים, התנהגות תאית והתפתחות של תאים בודדים בזמן, מה שמדגים שההליך יהיה בקונוס, דוקטורנט מהמעבדה שלי להכין תאים מחוסנים ממינוס 80 מעלות צלזיוס, מלאי ב-10 מיליליטר של מיקרוסקופ זמן-lapse או מדיום TLM בצלוחיות שייק סטריליות בתוספת אנטיביוטיקה במידת הצורך, מגדלים את התאים בן לילה ב-30 מעלות צלזיוס ו-225 סל"ד בבקבוק שייק סטרילי למחרת בבוקר כדי לבזוז את התאים 1 עד 10 במדיום טרום-חם, מוגדר כימית או CDM ללא אנטיביוטיקה, לגדל את התאים העדינים ביותר של הדבורים עד לאמצע השלב האקספוננציאלי, מה שלוקח בערך ארבע שעות. מדוד את ספיגת התרבית ב-600 ננומטר ודלל את התאים ל-600 בקירוב של 0.035.
שימוש ב-CDM. OD זה מבטיח שתאים בודדים עם מרווח מתאים בין תאים יזוהו בשקופית המיקרוסקופ למיקרוסקופ זמן-lapse. שעה לפני שהתאים מגיעים לאמצע הצמיחה האקספוננציאלית.
הכן את שקופית המיקרוסקופ על ידי ניקוי שתי שקופיות זכוכית עם 70% אתנול ומים. הסר את אחד מכיסויי הפלסטיק ממסגרת גנים, והיזהר לא לגרום לפירוק של כיסוי הפלסטיק בצד השני של המסגרת. חבר את מסגרת הגן באמצע אחת משקופיות הזכוכית על ידי הדבקתה תחילה לצד אחד, ולאחר מכן הנחיית השאר עם ציפורן.
השתמש במיקרוגל כדי להמיס 150 מיליגרם של ארוס נמס נמוך ברזולוציה גבוהה. ב-10 מיליליטר CDM, ודא שה-aros מומס במלואו כדי למנוע פלואורסצנטיות ברקע. פיפטה 500 מיקרוליטר של ה-CDM החם לאמצע מסגרת הגנים, כדי לוודא שכל האזור כולל הגבולות מכוסה במלואו.
עובד במהירות למניעת ייבוש יתר של הארוס. הנח את שקופית הזכוכית השנייה על מסגרת הגן המלאה ב-Aros CDM בניסיון להימנע מבועות אוויר. מניחים את הכריך במצב אופקי על ארבע מעלות צלזיוס למשך 45 דקות כדי לאפשר לאגרוס להתמצק מספיק.
לאחר שהארוס התמצק בזהירות, החלק מהזכוכית העליונה. השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך רצועות אגרו ברוחב של כחמישה מילימטרים שעליהן יגדלו החיידקים. ניתן להשתמש בשלוש רצועות לכל היותר לכל שקופית, המופרדות על ידי רווחים של כארבעה מילימטרים משני הצדדים.
חללים אלה יספקו אוויר החיוני לצמיחת Blu. הסר בזהירות את כיסוי הפלסטיק השני והאחרון ממסגרת הגן כדי לחשוף את הצד הדביק. טען תאים בודדים בכ-2.5 מיקרוליטר נוזל על המדיום המוצק, החל מהחלק העליון של כרית האגרוס מבלי לגעת בו.
בעזרת קצה הפיפטה, אפשר למדיום להתפשט באופן שווה על ידי הטיית המגלשה למעלה ולמטה. הנח כיסוי מיקרוסקופ נקי על מסגרת הגן כדי לחבר לחלוטין את פתק הכיסוי. השתמש בציפורן כדי להפעיל לחץ אז לאחר טעינת התאים.
חשוב לחכות שהנוזל יתייבש מספיק זמן כדי שלא תקבל תאים שוחים וצמיחה במספר שכבות. עם זאת, אם התאים מיובשים זמן רב מדי, אז יהיו להם בעיות לגדול לחד-שכבת מיקרו קולון. אז הזמן הנדרש לייבוש השקופיות שלך תלוי בניסוי ולא ניתן למדוד אותו.
וכתוצאה מכך, צריך כמובן להרגיש את זה כדי למנוע בעיות מיקוד אוטומטי במהלך השעות הראשונות של ניסוי ה-Time-lapse לחמם את השקופית למשך שעה אחת ב-30 מעלות צלזיוס כדי להתכונן למיקרוסקופיה של זמן-lapse. מחממים את החדר הסביבתי לפחות שעתיים. לפני תחילת הניסוי, בחר את מסנני המטרה המתאימים ואת המראה הדיכרואית בהתאם להגדרת הניסוי שלך.
לניסויים ארוכים, ודא שמסנן UV ממוקם בין מקור האור לדגימה. בנוסף, במידת האפשר, חסום חלק מאור העירור באמצעות מסנני צפיפות ניטרלית כדי למזער את החשיפה. תכנת את הניסוי בהתאם למערך הניסוי הספציפי.
זה חכם לקבוע את כמות האור הנדרשת עבור מבנים ספציפיים כמו גם את הגדרות המיקוד האוטומטי עבור מיקרוסקופים או חיידקים אחרים לפני הניסוי בפועל. זמני חשיפה קצרים יותר ורמות נמוכות יותר של אור עירור ימזערו הלבנה ופוטוטוקסיות השתמש באור סקופי לפונקציית המיקוד האוטומטי. לבסוף, הנח את השקופית המוכנה בתא הסביבתי הקדם-חם של המיקרוסקופ ועקוב אחר צמיחת תאים בודדים לשכבה חד-שכבתית של מושבת מיקרו ב-30 מעלות צלזיוס.
ניסוי פלואורסצנטי מוצלח בזמן-lapse יפיק חד-שכבת מיקרו-מושבה הממוקמת לחלוטין בתוך שדה הראייה. בסוף הניסוי בסרט הזה, השדה הבהיר נמצא בצד שמאל וניתן לראות פלואורסצנטיות. מימין.
הנה דוגמה למיקרו-מושבת B Subtles שבה תאים מסוימים גדלו זה על גבי זה, מה שמקשה על התחקות אחר ההיסטוריה שלהם במדויק כמו גם למדוד את רמות הקרינה שלהם בצורה נכונה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין בהצלחה דגימה מיקרוסקופית למיקרוסקופיה של זמן-lapse וכיצד לבצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של זמן-lapse. התנסו בתאי BACE.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה למעקב אחר התנהגותם של תאי חיידקים בודדים לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיה אוטומטית של זמן תצלום פלואורסצנטי. הוא כולל הנחיות מפורטות להכנת דגימות וניתוח התמונות המתקבלות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- ביולוגיית תאים
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- הבנת התנהגות תאי החיידקים חיונית עבור מחקרים ביולוגיים שונים.
- מיקרוסקופיית זמן תצלום מאפשרת תצפית על דינמיקה של תאים חיים.
- שיטה זו מספקת תובנות לגבי ההשפעות של היסטוריית התא על ההתפתחות.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא ללכוד את הניואנסים של התנהגות תאים בודדים.
מטרת המחקר
- לדמיין תאי חיידקים חיים במהלך גדילה וחלוקה.
- לנתח את ההשפעה של תנאי תזונה על התפתחות תאית.
- לשפר את ההבנה של דינמיקת חלבון והתנהגות תאית.
שיטות בשימוש
- העברת תאים למדיום רעבה כדי ליזום גדילה.
- הכנת שקף מיקרוסקופי לגידול חיידקים.
- הקלטת סרטי מיקרוסקופיית זמן תצלום פלואורסצנטית.
- ניתוח הנתונים המוקלטים כדי לצפות בהתפתחות התאים.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של תאי חיידקים בודדים לאורך זמן.
- תצפית על היווצרות ופיתוח של מושבות מיקרו.
- תובנות לגבי הדינמיקה של ביטוי חלבון בתאים בודדים.
- הוכחת היתרונות של מיקרוסקופיית זמן תצלום על פני שיטות מסורתיות.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר באופן יעיל את המחקר של התנהגות תאים בודדים בחיידקים.
- מיקרוסקופיית זמן תצלום היא כלי רב עוצמה לניתוח תאי.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על השיטה הזו כדי לחקור דינמיקות חיידקים נוספות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Monitoring single-cell behavior in bacteria enables mechanistic de-risking of antimicrobial target validation by revealing heterogeneity in growth, division, and protein expression. This approach supports predictive confidence in early discovery by linking cellular history to phenotypic outcomes, informing portfolio triage for antibiotic development. Time-lapse microscopy provides translational continuity from mechanistic screening to preclinical model evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by tracking individual cell responses to nutrient shifts and genetic perturbations over time.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct observation of protein dynamics and cellular behavior in single cells.
- Predictive Value: Supports lead identification by correlating cellular ancestry with phenotypic stability across generations.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing reproducible microcolony formation on agarose pads.
- Quantitative Outputs: Generates time-resolved fluorescence and brightfield data enabling measurement of growth rates, division timing, and protein localization.
- Scalability: Supports platform reuse across bacterial species (B. subtilis, S. pneumoniae) for standardized antimicrobial target assessment.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models pathogen behavior in clinically relevant species like S. pneumoniae to inform antimicrobial mechanism of action studies.
- Translational Biomarker Alignment: Links single-cell protein dynamics to population-level phenotypes, supporting biomarker-driven go/no-go decisions.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by validating target effects at single-cell resolution.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions single-cell time-lapse imaging between target validation and lead optimization, enabling hypothesis testing and mechanistic de-risking before compound screening.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how gene expression dynamics influence cellular behavior during growth and division.
- Screening: Delivers assay-ready microcolonies with standardized spacing and monolayer formation for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variables including fluorescence intensity, division timing, and lineage tracking for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects single-cell observations to preclinical continuity through ancestry-dependent behavior modeling in pathogen systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microscopy capability for cross-project antimicrobial target assessment across Gram-positive models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of single-cell protein dynamics and behavioral heterogeneity.
- Operational Value: Standardized slide preparation and environmental controls ensure reproducibility across laboratories and experimental runs.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by de-risking targets based on single-cell response consistency rather than population averages.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of antimicrobial candidates using lineage-resolved phenotypic data to avoid false positives from population masking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial culture techniques, fluorescence microscopy, and image analysis software like ImageJ.
- Dependent on temperature-controlled environmental chambers, neutral density filters, and UV protection for long-term imaging.
- Necessitates cross-team standardization of slide preparation, agarose concentration, and cell loading protocols for inter-laboratory consistency.
- Adaptation considerations include optimizing agarose thickness and nutrient composition for different bacterial species and growth rates.
- Practical limitations include phototoxicity risks during extended imaging and challenges in tracking cells that grow in multilayer formations.
