תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות
28 ביולי 2011
פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לפקח על התנהגות תא בודד של חיידקים שונים בתוך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות זמן לשגות. יתר על כן, אנו מספקים הנחיות כיצד לנתח את תמונות מיקרוסקופ.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לדימוי תאים חיים במהלך גדילה וחלוקה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, כדי שניתן יהיה לחקור את ההשפעה של ההיסטוריה והשושלת התאית על ההתפתחות התאית של חיידקים. הדבר מושג תחילה על ידי העברת התאים ממדיום נוזלי עם ריכוזי חומרי תזונה גבוהים יחסית למדיום הרעבה נוזלי. לאחר מכן, משתמשים בslideClass מיקרוסקופית שעל גביה יגדלו התאים החיידקיים לתוך מיקרו-מושבה.
שכבת מונולייר הוכנה. לאחר מכן, הוקלט סרטון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשיטת time lapse. לבסוף, הסרטון עובד והנתונים נותחו.
בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות התפתחות של תא חיידקי בודד באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשיטת time-lapse. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה סטנדרטית, הוא שהיא מאפשרת ניטור של דינמיקת חלבונים, התנהגות תאית והתפתחות של תאים בודדים לאורך זמן. הפרוצדורה תוצג על ידי Cone, סטודנט לדוקטורט מהמעבדה שלי. להכנת *B. subtilis*, יש להוסיף תאים ממטמון של 80°C- ל-10 milliliters של מדיום למיקרוסקופיה בשיטת time-lapse (או TLM medium) בבקבוקי ניעור סטריליים, בתוספת אנטיביוטיקה במידת הצורך. יש לגדל את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 30°C ובמהירות של 225 RPM בבקבוק ניעור סטרילי. למחרת בבוקר, יש לדלל את התאים ביחס של 1:10 במדיום מוגדר כימית (CDM) שחומם מראש וללא אנטיביוטיקה. יש לגדל את תאי ה-*B. subtilis* עד לשלב האקספוננציאלי הבינוני, תהליך שארך כארבע שעות. יש למדוד את הבליעה (absorbance) של התרבית ב-600 nanometers ולדלל את התאים עד לערך a 600 של כ-0.035.
בשימוש ב-CDM. ערך OD זה מבטיח שתאים בודדים, עם מרווחים מתאימים ביניהם, יונחו על תגית המיקרוסקופ לצורך מיקרוסקופיה של צילום רציף (time-lapse). שעה אחת לפני שהתאים מגיעים לאמצע שלב הצמיחה האקספוננציאלית.
הכינו את זכוכית המיקרוסקופ על ידי ניקוי שתי זכוכית עם 70% ethanol ומים. הסירו את אחד הכיסויים מפלסטיק ממסגרת הגנים (gene frame), תוך הקפדה שלא לגרום לפירוק של הכיסוי מפלסטיק בצדו השני של המסגרת. הצמידו את מסגרת הגנים למרכזה של אחת הזכוכיות על ידי הדבקה תחילה של צד אחד, ולאחר מכן הנחיית שאר המסגרת באמצעות הציפורן.
השתמש במיקרוגל כדי להמיס 150 milligrams של aros ברזולוציה גבוהה ובנקודת התכה נמוכה. ב-10 milliliters של CDM, ודא שה-aros מומס לחלוטין כדי למנוע פלואורסצנציית רקע. העבר בפיפט 500 microliters של agro CDM החם למרכז מסגרת הגן, תוך וידוא שכל השטח, כולל השוליים, מכוסה במלואו.
עבדו במהירות כדי למנוע ייבוש יתר של ה-agros. הניחו את הזכוכית השנייה על מסגרת הגן הממולאת ב-Aros CDM, תוך ניסיון להימנע מבועות אוויר. הניחו את ה"סנדוויץ'" במצב אופקי בטמפרטורה של 4°C למשך 45 דקות כדי לאפשר ל-agros להתמצק מספיק.
לאחר שהאגר התגבש, החלק בעדינות את זכוכית העליונה החוצה. השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך רצועות אגר ברוחב של כ-5 מילימטרים, עליהן יגדלו החיידקים. ניתן להשתמש במקסימום של שלוש רצועות לכל תכריכ, המופרדות במרווחים של כ-4 מילימטרים מכל צד.
חללים אלו יספקו אוויר החיוני לצמיחת ה-Blu. הסר בזהירות את הכיסוי הפלסטי השני והאחרון ממסגרת הגנים כדי לחשוף את הצד הדביק. טפטף תאים בודדים בערך ב-2.5 µL של נוזל על המצע המוצק, החל מהחלק העליון של פד ה-agros מבלי לגעת בו.
בעזרת קצה הפפיתה, אפשרו למצע להתפשט באופן אחיד על ידי הטיה של הזריקה למעלה ולמטה. הניחו כיסוי מיקרוסקופ נקי על מסגרת הגן כדי להצמיד את זכוכית הכיסוי באופן מלא. השתמשו בציפורן כדי להפעיל לחץ לאחר שהתאים הוטענו.
חיוני להמתין עד שהנוזל יתייבש מספיק כדי למנוע תאים "שוחים" וצמיחה בשכבות מרובות. עם זאת, אם התאים יתייבשו זמן רב מדי, הם יתקשרו לצמוח לשכבה אחת של micro cholon. לכן, הזמן הנדרש לייבוש השקופיות תלוי בניסוי ולא ניתן למדידה מדויקת.
וכתוצאה מכך, יש כמובן לפתח תחושה לגביו. כדי למנוע בעיות של פוקוס אוטומטי במהלך השעות הראשונות של ניסוי ה-time-lapse, חממו מראש את השקופית למשך שעה אחת ב-30 °C כדי להכין אותה למיקרוסקופיה בשיטת time-lapse. חממו מראש את תא הסביבה למשך שעתיים לפחות. לפני תחילת הניסוי, בחרו את העדשות, המסננים והמראות הדיכרואיות המתאימים בהתאם למערך הניסוי שלכם.
בניסויים ארוכים, ודאו שמסנן UV ממוקם בין מקור האור למדגם. בנוסף, במידת האפשר, חסמו חלק מאור העירור באמצעות מסנני צפיפות ניטרלית (neutral density filters) כדי למזער את החשיפה. תכננו את הניסוי בהתאם למערך הניסויי הספציפי.
מומלץ לקבוע את כמות האור הדרושה עבור קונסטרוקטים ספציפיים, כמו גם את הגדרות המיקוד האוטומטי עבור מיקרוסקופי time-lapse אחרים או עבור חיידקים, לפני הניסוי בפועל. זמני חשיפה קצרים יותר ורמות נמוכות יותר של אור עירור ימזערו את ההגבהלה (bleaching) ואת הרעילות הפוטו-כימית. השתמש באור מיקרוסקופי עבור פונקציית המיקוד האוטומטי. לבסוף, הנח את השקף שהוכן בתא הסביבתי המחומם מראש של המיקרוסקופ ועקב אחר צמיחת תאים בודדים לשכבה אחת של מיקרו-מושבות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius.
ניסוי פלואורסצנציה מוצלח בשיטת time-lapse יניב מונו-שכבה של מיקרו-מושבה הממוקמת כולה בתוך שדה הראייה. בסוף הניסוי בסרטון זה, ניתן לראות בצד שמאל תמונת שדה בהיר (bright field) ובצד ימין תמונת פלואורסצנציה.
כאן מוצגת דוגמה למיקרו-מושבה של B Subtles שבה חלק מהתאים גדלו זה על גבי זה, מה שמקשה על מעקב מדויק אחר ההיסטוריה שלהם וכן על מדידה נכונה של רמות הפלואורסצנציה שלהם. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעירכאות טובה לגבי האופן שבו ניתן להכין בהצלחה דגימה מיקרוסקופית למיקרוסקופיה של מסלול זמן (time-lapse) וכיצד לבצע מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של מסלול זמן. ניסוי עם תאי BACE.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתואר שיטה לניטור התנהגותן של תאי חיידקים בודדים לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אוטומטית בשיטת time-lapse. הוא כולל הנחיות מפורטות להכנת דגימות ולניתוח התמונות שהתקבלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מיקרוביולוגיה
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- הבנת התנהגות התא הבקטריאלי חיונית למחקרים ביולוגיים שונים.
- מיקרוסקופיה של צילום רצף (Time-lapse microscopy) מאפשרת תצפית על דינמיקה של תאים חיים.
- שיטה זו מספקת תובנות לגבי השפעותיה של היסטוריית התא על ההתפתחות.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא ללכוד את הניואנסים של התנהגות תא בודד.
מטרת המחקר
- לוויזואליזציה של תאי חיידקים חיים במהלך גדילה והחלוקה.
- לניתוח השפעת תנאי תזונה על התפתחות תאית.
- להעמקת ההבנה בנושא דינמיקה של חלבונים והתנהגות תאית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- העבר את התאים לתווך הרעבה כדי להתחיל את הצמיחה.
- הכן זכוכית כיסוי למיקרוסקופ לצמיחת חיידקים.
- הקלט סרטי מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בשיטת time-lapse.
- נתח את הנתונים שהוקלטו כדי לצפות בהתפתחות התאים.
תוצאים עיקריים
- דימוג מוצלח של תאי חיידקים בודדים לאורך זמן.
- תצפית על היווצרות והתפתחות של מיקרו-מושבות.
- תובנות לגבי הדינמיקה של ביטוי חלבונים בתאים בודדים.
- הדגמת היתרונות של מיקרוסקופיית time-lapse לעומת שיטות מסורתיות.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר ביצוע יעיל של מחקר על התנהגות תאים בודדים בחיידקים.
- מיקרוסקופיה של צילום רצף (Time-lapse microscopy) היא כלי רב עוצמה לניתוח תאי.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו כדי לבחון דינמיקות חיידקיות אחרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מובילה
ניטור התנהגות של תא בודד בחיידקים מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של תיקוף מטרות אנטימיקרוביאליות על ידי חשיפת הטרוגניות בצמיחה, בחלוקה וביטוי חלבונים. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור ההיסטוריה התאית לתוצאות פנוטיפיות, ובכך מסייעת במיון פורטפוליו לפיתוח אנטיביוטיקה. מיקרוסקופיה בשיטת Time-lapse מספקת רצף תרגומי מסריקה מכניסטית להערכה במודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות מעקב אחר תגובות של תאים בודדים לשינויים תזונתיים ולשיבושים גנטיים לאורך זמן.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות תצפית ישירה על דינמיקת חלבונים והתנהגות תאית בתאים בודדים.
- ערך חיזוי: תומך בזיהוי מועמדים מובילים (lead identification) על ידי מתאם בין השושלת התאית ליציבות פנוטיפית לאורך דורות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקת תרכובות בהמשך, על ידי ביסוס יצירה הדירה של מיקרו-מושבות על פדי אגרוזה.
- תוצרים כמותיים: מייצר נתוני פלואורסצנציה ושטח בהיר (brightfield) ברזולוציית זמן, המאפשרים מדידה של קצבי גדילה, תזמון חלוקה ומיקום חלבונים.
- יכולת הרחבה: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה על פני מיני חיידקים שונים (B. subtilis, S. pneumoniae) לצורך הערכה סטנדרטית של מטרות אנטי-מיקרוביאליות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה את התנהגות הפתוגן במינים בעלי רלוונטיות קלינית כגון S. pneumoniae כדי לספק מידע למחקרי מנגנוני פעולה של תרופות אנטימיקרוביאליות.
- הלימה למסמנים ביולוגיים תרגומיים: מקשר בין דינמיקה של חלבונים ברמת התא הבודד לבין פנוטיפים ברמת האוכלוסייה, ובכך תומך בהחלטות go/no-go מבוססות מסמנים ביולוגיים.
- קידום מותאם סיכונים: מפחית עמימות מכניסטית במודלים פרה-קליניים על ידי תיקוף השפעות המטרה ברזולוציית תא בודד.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה מציבה את הדימוי של תאים בודדים לאורך זמן (time-lapse) בין שלב תיקוף המטרה לבין אופטימיזציה של תרכובות מובילות, ובכך מאפשרת בדיקת השערות והפחתת סיכונים מכניסטיים לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בהבהרת מסלולים על ידי ויזואליזציה של האופן שבו דינמיקת ביטוי גנים משפיעה על התנהגות תאית במהלך גדילה וחלוקה.
- סקרים (Screening): מספקת מיקרו-מושבות מוכנות לבדיקה עם מרווחים סטנדרטיים ויצירת שכבה אחת (monolayer) להערכה אמינה של תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת משתנים תלויים כמותיים, כולל עוצמת פלואורסצנציה, תזמון חלוקה ומעקב אחר שושלות לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תצפיות בתא בודד לרצף פרה-קליני באמצעות מידול התנהגות תלויה-שושלת במערכות של פתוגנים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת מיקרוסקופיה ניתנת לשימוש חוזר להערכת מטרות אנטימיקרוביאליות בין פרויקטים שונים במודלים של חיידקים גרם-חיוביים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות תצפית ישירה על דינמיקת חלבונים בתא בודד והטרוגניות התנהגותית.
- ערך תפעולי: הכנה סטנדרטית של שקופיות ובקרות סביבתיות מבטיחות הדירות בין מעבדות ובמהלך סבבי ניסויים.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת סיכונים במטרות, בהתבסס על עקביות תגובה של תא בודד ולא על ממוצעים של אוכלוסייה.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לאנטימיקרוביאליים תוך שימוש בנתונים פנוטיפיים ברזולוציית שושלת, כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות הנובעות מהסוואה של האוכלוסייה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות לתרבית מיקרוביאלית, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ותוכנות לניתוח תמונות כגון ImageJ.
- תלוי בתאי סביבה עם בקרת טמפרטורה, מסנני צפיפות ניטרלית והגנה מפני UV לצורך דימות לטווח ארוך.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת הנסליות, ריכוז האגרוז ופרוטוקולי טעינת תאים כדי להבטיח עקביות בין מעבדות.
- שיקולי התאמה כוללים אופטימיזציה של עובי האגרוז והרכב הנוטריינטים עבור מיני חיידקים וקצבי גדילה שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות סיכוני פוטוטוקסיות במהלך דימות ממושך ואתגרים במעקב אחר תאים הגדלים במבנים רב-שכבתיים.
