ההפרדה של ה-DNA חד גדילי, פעמיים תקועים DNA ו-RNA מהקהילה ויראלי הסביבה באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite

סרטון זה מדגים הליך להפרדת מכלולים נגיפיים מעורבים על סמך הרכב חומצות הגרעין שלהם. זה מאפשר לחקור את המגוון הטקסונומי והפוטנציאל התפקודי של מכלולים נגיפיים מורכבים. כאן הידרוקסיאפטיט, צורה גבישית של סידן פוספט משמשת להפרדת חומצות גרעין.

ראשית, עמודת הידרוקסיאפטיט נארזת ולאחר מכן מוחלות חומצות גרעין נגיפיות מטוהרות מאוזנות על העמודה, אינטראקציית המטען בין יוני הסידן הטעונים חיובית של ההידרוקסיאפטיט לבין עמוד השדרה של הפוספט הטעון שלילית של תת-סוגי חומצות הגרעין קושרת את חומצות הגרעין לעמודה ניק. ה-D-N-A-R-N-A הבא ו-DNA דו-גדילי נרמזים ברצף עם ריכוזים שונים של מאגר פוספט. לאחר מכן חומצות הגרעין המתקבלות מומלחות ומרוכזות כהכנה להדמיה, כימות וזיהוי על ידי רצף DNA אלקטרופורזה של אגרוס ג'ל מאשרת שניתן להפריד את מיני חומצות הגרעין בפחות מ-9% העברה.

לפיכך, שיטה זו מאפשרת להעריך את המגוון והיכולת התפקודית של קהילות ויראליות. שלום, שמי דאג פרו, ואני עמית מחקר במעבדה של ד"ר שאנון וויליאמסון במכון ג'יי קרייג ונצ'ר. היום אראה לכם נוהל להפרדת DNA חד-גדילי, DNA דו-גדילי ו-RNA ממכלול ויראלי סביבתי.

לשיטה זו יתרונות על פני השיטות הקיימות כמו הטיפול בגרעין, המכוון ל-DNA או ל-RNA. לכרומטוגרפיה של הידרוקסיאפטיט יש את היכולת ללכוד את כל הקהילה הוויראלית. שיטה זו מאפשרת לנו לענות על מספר שאלות בתחום האקולוגיה הוויראלית.

לדוגמה, מהו השלמת הגנים הכוללת או המגוון של הקהילה הוויראלית? חשבנו לראשונה על השיטה הזו כשרצינו לחקור את כל מכלולי הפלנקטון של ריו ממפרץ צ'ספיק מבלי להקריב תת-קבוצה של החתימה הגנטית. יש להכין את התמיסות הדרושות לניסוי זה מבעוד מועד על פי ההוראות בפרוטוקול הכתוב הנלווה, ולכלול 0.12 מאגר פוספט מולרי, 0.20 מאגר פוספט מולרי, 0.40 מאגר פוספט מולרי ותמיסת פוספט מולרית אחת.

הכל ב-pH 6.8 והידרוקסיאפטיט מיובש ביום הניסוי, מאזנים את כל מאגרי הפוספט וההידרוקסיאפטיט המיובש על ידי הנחתם באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס. התחל הליך זה על ידי הכנת עמודת הכלכלה שתשמש להפרדת חומצות גרעין נגיפיות. חבר תא עצירה לקצה עמוד החסכון וודא שהוא סגור.

בעזרת צנרת הוסף מים נטולי יונים לעמוד, ואז הניח את המכסה בחלק העליון של העמוד והפוך שוב ושוב את העמוד כדי לשטוף אותו. שופכים את המים וחוזרים על שטיפה זו מספר פעמים. לאחר מכן, הסר את זין העצירה מעמוד האקון ובצע חיטוי כדי לעקר אותו.

זין העצירה אינו חיטוי מכיוון שהוא יימס. שטפו את זין העצירה במים המיוננים, ואז שוב עם אתנול 70% והניחו לו להתייבש באוויר לאחר החיטוי. החלף את זין העצירה וסגור אותו.

לאחר מכן, בעבודה במכסה אדים, הוסף מיליליטר אחד של מעיל סיגמא לעמוד וצפה את זכוכית העמוד על ידי היפוך העמוד בתנועת גלגול כפי שמוצג כאן. ציפוי בשכבת סיגמא ימזער את הדבקת חומצות הגרעין למשטח הזכוכית. במהלך ההפרדה צופו משטחי זכוכית מלח אחד.

פתח את זין העצירה ושפך לתוך צינור חרוטי. לאחר מכן, כדי לחבר את העמוד לאמבט מים במחזור, השתמש בשני מהדקים כדי לחבר את העמוד למעמד טבעת. חבר צינורות סיליקון מאמבט המים המסתובב, כך שזרימת המים מאמבט המים תהיה מלמטה למעלה.

הגדר את הטמפרטורה ל 60 מעלות צלזיוס והתחל את זרימת הדם. בעוד שבפועל, העמוד והצינור יהיו עטופים בחומר בידוד, כגון נייר אלומיניום או בידוד צינורות קצף. כדי למזער את אובדן החום, שלב זה אינו מוצג כאן.

על מנת לדמיין טוב יותר את ההליך, סגור את זין העצירה. בעזרת צינור, הוסף 10 מיליליטר מים ללא RNA סטריליים. פתח את זין העצירה ואפשר למים להתנקז.

לאחר מכן שטפו שוב לאחר הכביסה השנייה. יש לשטוף פעמיים עם 10 מיליליטר של RNA סטרילי ללא חוצץ פוספט מולארי של 0.12 ולשפוך בין כביסות. העמודה מוכנה כעת לכרומטוגרפיה הידרוקסיאפטית.

ודא שזין עצירת עמודת האקון סגור. לאחר מכן, בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילית של שני מיליליטר, הוסף לאט לאט שני מיליליטר של תיאבון הידרוקסי מיובש מוכן לתחתית העמודה. החזר את מכסה העמודה למקומו.

אפשר לתיאבון ההידרוקסי להתיישב תחת כוח הכבידה למשך 30 דקות. שיטה זו דורשת תשומת לב לפרטים. עמוד התיאבון ההידרוקסי עובד בקצב של 0.25 עד 0.5 מיל לדקה.

לכן חשוב מאוד לפקוח עין מקרוב על העמוד כדי שלא יתייבש. לאחר שחלפו 30 דקות, פתח את זין העצירה כדי לנקז את המאגר למיכל פסולת. סגור את זין העצירה והשליך את הזרימה דרכו.

שלב חומצות גרעין עם מאגר פוספט מולארי 0.12 בנפח סופי של 500 מיקרוליטר ודגר אותו 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. זה יאזן את חומצות הגרעין לטמפרטורת העמודה וישפר את ההפרדה בין מיני חומצות הגרעין השונות על ידי הסרת כל המבנים המשניים שעשויים להיות קיימים. בעזרת פיפטה סרולוגית של שני מיליליטר, מרחו במהירות את תמיסת חומצת הגרעין על התיאבון ההידרוקסי, והקפידו לא להפריע לעמודה.

ברגע שכל 500 המיקרוליטרים זורמים על העמוד, ניתן להוסיף כמות קטנה של 0.12 מאגר פוספט מולרי לראש העמוד כדי למנוע ממנו להתייבש. אפשר לחומצות הגרעין להיקשר לתיאבון ההידרוקסי למשך 30 דקות. לאחר הדגירה המחייבת, הניחו צינור חרוטי של 15 מיליליטר מתחת לעמוד.

לאחר מכן פתח את זין העצירה ואסוף את הדגימה הראשונית של 500 מיקרוליטר, המכילה DNA חד-גדילי. לאחר איסוף 500 מיקרוליטר, סגור את זין העצירה. לאחר מכן, הוסף שישה מיליליטר של 0.12 מאגר פוספט מולארי לתיאבון ההידרוקסי, והקפד לא להפריע לעמודה.

לאחר מכן פתח את זין העצירה והמשיך לאסוף את הזרימה דרך מכיל DNA תקוע בודד באותו צינור של 15 מיליליטר מהשלב הקודם. לאחר שנאספו כשישה מיליליטר, סגור את תא העצירה. הוסף נפח אחד של תמיסת אלכוהול איזואמיל פנול כלורופורם לצינור מעורבב במרץ על ידי מערבולת, ואז צנטריפוגה ב -3, 500 פעמים G למשך 15 דקות.

לאחר הצנטריפוגה, הצינור יכיל שתי שכבות. העבירו את שכבת ההסכמה העליונה, המכילה את גדיל ה-DNA הבודד לצינור חדש של 15 מיליליטר, ואחסנו את הדגימה בטמפרטורת החדר כדי לנטר ולטהר RNA מהעמודה, הוסיפו שישה מיליליטר של מאגר פוספט מולארי 0.20 ואספו את הזרימה לפני השימוש בצינור חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן בצע מיצוי פנול כלורופורם.

באשר לדגימת ה-DNA החד-גדילית, חזור על תהליך זה באמצעות שישה מיליליטר של מאגר פוספט מולרי של 0.40 כדי לנטרל ולטהר DNA דו-גדילי מהעמודה. לבסוף, להפשיט את העמוד מכל שאריות DNA תקוע כפול. חזור על תהליך זה פעם נוספת.

הפעם באמצעות שישה מיליליטר של 1.00 מאגר פוספט מולארי כדי להפיל את דגימות חומצות הגרעין. העבירו ארבעה עד חמישה מיליליטר מכל דגימה למכשיר מסנן צנטריפוגלי אולטרה ארבעה במשקל מולקולרי המצויד בדגימת תרכיז קרום תא אולטרה במשקל מולקולרי לפחות מ-500 מיקרוליטר על ידי סיבוב ב-6,000 GS ב-30 מעלות צלזיוס למשך כחמש דקות ברוטור בזווית קבועה. לאחר השלכת הזרימה, הוסף את שאר הדגימות למסנן.

העלה את עוצמת הקול לארבעה עד חמישה מיליליטר עם מאגר XTE אחד ללא RNA. ואז סובב שוב עד להשגת נפח מרוכז. כחמש דקות לאחר הסיבוב, הוסף ארבעה עד חמישה מיליליטר של RNA ללא מאגר XTE אחד למסנן ורכז.

שוב, חזור על שטיפה זו וחמש פעמים נוספות כדי להפיל לחלוטין דגימות חומצות גרעין. לאחר שהדגימות מרוכזות לחלוטין ומומלחות, העבירו את דגימות חומצות הגרעין הנותרות לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי של 1.7 מיליליטר. זרז את חומצות הגרעין על ידי הוספת עשירית מנפח הנתרן אצטט, שני נפחים של 100% אתנול ומיקרוליטר אחד של גליקו כחול מעורבב היטב על ידי צנטריפוגה מערבולת.

28,000 GS ארבע מעלות צלזיוס. 60 דקות לקנט. הקפידו לא להפריע לגלולה.

הוסף 300 מיקרוליטר של 70% אתנול מסתובב בטמפרטורת החדר של 28,000 GS למשך 10 דקות כדי לא להתייבש ולהשעות מחדש כל שבר בנפח מתאים של RNAs. מאגר TE חופשי ריכוזים שווים של חומצות הגרעין הנגיפיות M 13 MP 18, DNA חד-גדילי MS שני חד-גדיליים, RNA FI שישה דו-גדיליים, RNA ו-DNA דו-גדילי למבדה שולבו, ואז הופרדו באמצעות כרומטוגרפיה הידרוקסיאפטיט כפי שמוצג בסרטון זה. ריכוזים שווים של M 13 MP 18, DNA חד-גדילי MS שתיים, חד-גדילי, RNA חמישה שישה דו-גדיליים, RNA ו-DNA דו-גדילי למבדה שולבו כפי שמוצג בנתיב שש והוחלו על עמודת הידרוקסיאפטיט כפי שניתן לראות כאן.

D-N-A-R-N-A חד-גדילי ו-DNA דו-גדילי נרמזו באופן עצמאי מעמודת ההידרוקסיאפטיט באמצעות 0.12 מולארי, 0.18 מולארי, 0.40 מולארי ו-1.00 מולארי פוספט. סולם KB אחד שימש לאישור גדלי הגנום. תוצאות אלו מצביעות על כך שניתן להשתמש בשיטה זו כדי להפריד בהצלחה DNA חד-גדילי, DNA דו-גדילי ו-RNA עם פחות מ-9% העברה משבר אחד למשנהו.

שיטה זו שימשה גם להפרדת חומצות גרעין שבודדו מקהילה ויראלית בתוך מפרץ צ'ספיק, כפי שמוצג כאן. D-N-A-R-N-A חד-גדילי ו-DNA דו-גדילי נרמזו באופן עצמאי באמצעות ריכוזי חיץ פוספט של 0.12 מולארי, 0.20 מולרית ו-0.40 טוחנת, או 1.00 טוחנת בהתאמה, סולם DNA בעל מסה גבוהה בנתיב 1 וסולם KB אחד בנתיב 2 שימשו לאישור חזותי של משקל מולקולרי משוער ומסה של חומצות גרעין כפי שניתן לראות כאן, DNA דו-גדילי היה סוג חומצת הגרעין הדומיננטי שהופק מהפלנקטון של מפרץ צ'ספיק וריו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להפריד חומצות גרעין ממכלול ויראלי מעורב באמצעות כרומטוגרפיה של הידרוקסיאפטיט.

זה כולל הכנת עמודת ההידרוקסיאפטיט וחומצות הגרעין, הפרדה ואשליה של חומצות גרעין באמצעות ריכוזים שונים של בופר פוספט והתפלה, וריכוז חומצות הגרעין לאחר ההפרדה.