Name: Assay כמותי עבור אינסולין להביע המושבה יוצרי אבות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: למד שיטה לזיהוי תאי אבות פנקריאטיים המבטאים אינסולין באמצעות מבחן קלונוגני תלת-ממדי. השיטה משתמשת בתרבית חד-תאית בתווך חצי-מוצק עם Matrigel וגורמי גדילה כדי לחקור התמיינות תאי אבות לתאי בטא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות ד&quot;ר קלאוס Kaestner על המתנה של קו Murine Ngn3-EGFP תא גזע עובריים, הגב &#39;לוסי בראון Core cytometry אנליטית לסיוע מיון התא. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי NIH מענקים R21DK069997 ו R01DK081587 הוענק HTK ו מקליפורניה המכון לרפואה הרגנרציה (CIRM) מעניקה הכשרה הוענק MW ו - LS

<ol><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Committing+embryonic+stem+cells+to+early+endocrine+pancreas+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Committing embryonic stem cells to early endocrine pancreas in vitro.</a> Stem cells. 22, 1205-1217 (2004).</li>
<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li>
<li>Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+in+vitro+differentiation+assay+for+pancreatic-like+cell+development+from+murine+embryonic+stem+cells%3A+detailed+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay.+Drug.+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an in vitro differentiation assay for pancreatic-like cell development from murine embryonic stem cells: detailed gene expression analysis.</a> Assay. Drug. Dev. Technol. 9, 403-419 (2011).</li>
<li>Lee, C. S., Perreault, N., Brestelli, J. E., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin+3+is+essential+for+the+proper+specification+of+gastric+enteroendocrine+cells+and+the+maintenance+of+gastric+epithelial+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Neurogenin 3 is essential for the proper specification of gastric enteroendocrine cells and the maintenance of gastric epithelial cell identity.</a> Genes. 16, 1488-1497 (2002).</li>
<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage%3A+NGN3%2B+cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129, 2447-2457 (2002).</li>
<li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li>
<li>Gittes, G. K., Galante, P. E., Hanahan, D., Rutter, W. J., Debase, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+morphogenesis+in+the+developing+pancreas%3A+role+of+mesenchymal+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific morphogenesis in the developing pancreas: role of mesenchymal factors.</a> Development. 122, 439-447 (1996).</li>
<li>Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+plays+a+key+role+in+morphogenesis+of+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+by+controlling+the+activity+of+the+matrix+metalloproteinase+MMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2.</a> J. Cell. Biol. 143, 827-836 (1998).</li>
<li>Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+human+islets+from+expanded+ductal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 7999-8004 (2000).</li>
<li>Gao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+endocrine+progenitor+cells+and+critical+factors+for+their+differentiation+in+human+adult+pancreatic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture.</a> Diabetes. 52, 2007-2015 (2003).</li>
<li>Gao, R., Ustinov, J., Korsgren, O., Otonkoski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neogenesis+of+human+islets+reflects+the+plasticity+of+differentiated+human+pancreatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">In vitro neogenesis of human islets reflects the plasticity of differentiated human pancreatic cells.</a> Diabetologia. 48, 2296-2304 (2005).</li>
<li>Suarez-Pinzon, W. L., Lakey, J. R., Brand, S. J., Rabinovitch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+with+epidermal+growth+factor+and+gastrin+induces+neogenesis+of+human+islet+beta-cells+from+pancreatic+duct+cells+and+an+increase+in+functional+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human islet beta-cells from pancreatic duct cells and an increase in functional beta-cell mass.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 3401-3409 (2005).</li>
<li>Hao, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+differentiation+from+nonendocrine+epithelial+cells+of+the+adult+human+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas.</a> Nature Medicine. 12, 310-316 (2006).</li>
<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li>
<li>Seaberg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nature Biotechnology. 22, 1115-1124 (2004).</li>
<li>Rovira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+centroacinar%2Fterminal+ductal+progenitor+cells+in+adult+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of centroacinar/terminal ductal progenitor cells in adult mouse pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 75-80 (2010).</li>
</ol>

אין לנו שום דבר לגלות.

מבחני המושבה המאפשרים הערכות כמותיות של אבות תפקודי לבלב הפרט היה מוגבל עד כה, אשר הקשו מאוד את ההתקדמות במחקרים של גזע הלבלב ביולוגיה של התא ובתאים. מהות assay מושבה היא שזה מודד את היכולת הפנימית של ובתאים, ולא רק הפנוטיפ שלהם, מה שמאפשר את הפונקציונליות ואת הפוטנציאלים השושלת של ובתאים להיות שנצפו. זהו גם כלי כמותי שניתן לקבוע את מספר אבות באוכלוסייה נתונה. בשדה גזע hematopoietic התא, מבחני המושבה מילאו תפקידים חשובים זיהוי, כמו גם לפענח את גורם הגדילה דרישות, אינטראקציות, מנגנונים המסדירים את המחויבות שושלת היוחסין של תאים אלה. 6 בתחום הביולוגיה אבי תא הלבלב, הלבלב איבר 7 , 8 או בתפזורת תרבויות 9-13 כבר המציאו, עם זאת, מבחני כזה לא כתובת questi ביולוגיתוספות ברמת תא בודד. בלי ניתוחים תא בודד, קיומו של גזע רב פוטנציאלי הלבלב / אבות לא ניתן להוכיח באופן חד משמעי. 14 כאן אנו מראים כי אינסולין להביע המושבה יוצרי אבות יכול להיות assayed שימוש תלת ממדי, Matrigel המכילים, חצי מוצק מערכת התרבות. למרות תרבות השעיה מערכת 15,16 פותחה המאפשרת יחיד הלבלב מבוגר אבות להתרבות ו להתמיין &quot;pancreatospheres&quot;, assay המושבה שלנו מספק יתרונות נוספים. ראשית, מערכת מוצקים למחצה התקשורת בתרבות שלנו מאפשר ציפוי של עד 25,000 תאים ממוינים לפי 500 התקשורת בתרבות μL לכל 24 היטב, תוך שמירה על הקמת המושבה וכתוצאה מכך בטווח ליניארי. 2 לעומת זאת, assay pancreatosphere ההשעיה מחייב שימוש יחיד בתצהיר תא שיטה של ​​סדרן התא כדי לאפשר ניתוח תא יחיד, ולכן נפח גדול יותר של תרבות המדיה החממה בחללנדרשים. לכן, assay המושבה שלנו היא יחסית קלה וחסכונית לנהל כאשר מספר גדול של תאים שונים צריכים להיות בו זמנית בהשוואה לפעילויות אבי. שנית, התקשורת מוצקים למחצה שלנו מאפשר התפלגות אחידה של מרכיבי תאי מטריקס ו - גורמי גדילה, אשר מאפשר גם ריבוי והתמיינות להתרחש גם אותו. לעומת זאת, קשה יותר כדי לספק סביבה כזאת, במיוחד מטריקס, אל התאים בתרבית ההשעיה. מודעים אנו לכך כי בשיטה שלנו זה לא ניתן להוכיח בוודאות כי כל המושבה היא נגזרת של תא בודד, כמו שני אבות יכול להיות ממוצבת באופן אקראי ליד המושבה כל אחד אחר הטופס. עם זאת, בעיה זו ניתן להתגבר על ידי ניתוח משני באמצעות מניפולציה תא בודד. ישיר יד קטיף של תאים בודדים מיון יכול להוכיח בוודאות את מקור תא בודד של כל המושבה. לסיכום, אינסולין להביע המושבה יוצרי הפעילות של הפרוgenitors למחצה מוצק התקשורת המתוארים לעיל מספק הזדמנויות ייחודיות עבור מחקרים מכניסטית של הלבלב אבות ברמת תא בודד. לדוגמה, בדו&quot;ח קודם מצאנו כי תוספת של Matrigel, תערובת גולמי של חלבונים תאי מטריקס, בתרבות התקשורת נדרש ליצירת האינסולין, להביע מושבות של Ngn3-EGFP תאים + 2 מציע את תאי מטריקס היא חשוב אבות אלה. שימוש assay זה המושבה, זה עכשיו יהיה אפשרי להמשיך לנתח ולהגדיר דרישות מטריצה ​​ספציפית לפעילות זו. בנוסף ללימוד אבות מתאי גזע עובריים בעכבר, אנחנו כרגע בודקים אם זו מערכת במבחנה assay תומך גם היווצרות של מושבות בולטות אחרות הנגזרות הלבלב והכבד של עכברים הלידה ומבוגרים, כמו גם רקמה אנושית הלבלב cadaveric חסר של איי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומר / מגיב </td><td> חברה </td><td> קטלוג מספר </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 1X DMEM / F-12 (01:01) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td><td></td></tr><tr><td> עגל עוברית סרום </td><td> רקמות תרבות הביולוגיים </td><td> 201 </td><td> עיין בסעיף 1.1 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> 1X Dulbecco של PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> שור סרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A8412 </td><td> 7.5% </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 356231 </td><td> צמצום צמיחה גורם </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> Sinetsu כימית, טוקיו, יפן </td><td></td><td> 1500 centipoise (High-viscosity) </td></tr><tr><td> Nicotinamide </td><td> סיגמא </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> אנושי רקומביננטי Activin βB </td><td> R &amp; D מערכות </td><td> AB-659-025 </td><td></td></tr><tr><td> Exendin-4 </td><td> סיגמא </td><td> E7144 </td><td></td></tr><tr><td> אנושי רקומביננטי VEGF-A </td><td> R &amp; D מערכות </td><td> 293-VE-010 </td><td></td></tr><tr><td> 24 גם צלחות </td><td> שחקן המשנה </td><td> 3473 </td><td> Ultra-Low התקשרות </td></tr><tr><td> 60mm צלחת פטרי עם גריד </td><td> Nunc </td><td> 169558 </td><td></td></tr></tbody></table>

assay כמותי עבור אינסולין להביע המושבה יוצרי אבות

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

השדה של גזע הלבלב ביולוגיה של התא ובתאים כבר הקשו על ידי חוסר ב מבחני חוץ גופית פונקציונלי כמותיים המאפשרים ניתוח של התא הבודד. ניתוח של אבות חד הם בעלי חשיבות קריטית משום שהן מספקות דרכים סופי חד משמעי להדגים את הפוטנציאל של אבות השושלת בודדים. למרות שיטות כבר המציאו כדי לייצר &quot;pancreatospheres&quot; בתרבות ההשעיה מתאי יחיד, מספר מגבלות קיימות. ראשית, זה זמן רב לבצע בתצהיר תא בודד עבור מספר גדול של תאים, אשר פקודות להפוך כמויות גדולות של מדיה תרבות ומרחב. ספרור שנית, של pancreatospheres המתקבל הוא עתיר עבודה, במיוחד כאשר התדירות של pancreatosphere-ליזום אבות נמוכה. שלישית, assay pancreatosphere אינה שיטה יעילה כדי לאפשר הן את התרבות והתמיינות של אבות הלבלב בתרבות אותו היטב, מחדשstricting את השימושיות של assay. כדי להתגבר על המגבלות האלה, חצי מוצק מדיה assay מושבה המבוססת על אבות הלבלב פותחה והוא מוצג בדוח זה. שיטה זו מנצלת את המושג קיים מ assay המושבה hematopoietic, שבו methylcellulose משמש כדי לספק צמיגות לתקשורת, המאפשר ובתאים להישאר במרחב תלת מימדי כפי שהם עוברים שגשוג כמו גם בידול. כדי להעשיר את האינסולין להביע המושבה יוצרי אבות מתוך אוכלוסייה הטרוגנית, אנו מנוצלים תאים המבטאים neurogenin (NGN) 3, האנדוקרינית הלבלב אבי סמן התא. Murine גזע עובריים (ES) תאים שמקורם בתאי Ngn3 להביע מתוייגים עם הכתב חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת מוינו רבים כמו גם לכל 25,000 תאים היו מצופה לתוך קובץ מצורף נמוך של 24 מנות גם תרבות. כל אחד הכיל גם 500 μL של חצי מוצק התקשורת ביחד עם הרכיבים העיקריים הבאים: פגשhylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin βB, והתקשורת מותנה שנאספו תאים שמקורם בתאי הלבלב כמו Murine ES. לאחר 8-12 ימים של תרבות, אינסולין להביע מושבות עם מורפולוגיה ייחודית נוצרו יכול להיות מנותח נוספת לביטוי הלבלב גן כמותי באמצעות RT-PCR ו מכתים immunoflourescent כדי לקבוע את ההרכב שושלת היוחסין של כל המושבה. לסיכום, assay המושבה שלנו מאפשרת זיהוי קל וכימות של אבות פונקציונלי בתוך אוכלוסיה הטרוגנית של תאים. בנוסף, פורמט חצי מוצק התקשורת מאפשר הצגה אחידה של מרכיבי תאי מטריקס ו - גורמי גדילה לתאים, המאפשר אבות להתרבות להבדיל במבחנה. זה assay המושבה מספקת הזדמנויות ייחודיות עבור מחקרים מכניסטית של ובתאים הלבלב ברמת תא בודד.

Assay תלת מימדי המאפשר clonogenic הלבלב כמו אבות להתמיין אינסולין להביע המושבות מתואר. שיטה זו מנצלת חצי מוצק מדיה המכילה גורמים, methylcellulose Matrigel וצמיחה, שבו אבות יחיד להתרבות ולהבחין<em&gt; במבחנה</em&gt;, המתיר כימות של מספר אבות תפקודית באוכלוסיה.

Assay כמותי עבור אינסולין להביע המושבה יוצרי אבות

התחום של ביולוגיה של תאי גזע ותאי פרוגניטור של הלבלב נבלם בשל מחסור בבדיקות פונקציונליות וכמותיות במעבדה (in vitro) המאפשרות את ה...

סרטון זה מדגים פרוצדורה ליצירת תרביות תלת-ממדיות המאפשרות לתאי פרוגניטור דמויי לבלב להבדיל עצמם למושבות המבטאות אינסולין. ראשית, תאים מובחנים שנגזרו מקו תאי גזע עובריים של עכבר מסוג neurogen in three EGFP Knockin מופרדים וממוינים לפי ביטוי EGFP כדי להעשיר את תאי הפרוגניטור הדמויי אנדוקרין. התאים הבודדים הממוינים החיוביים ל-EGFP נזרעים למצע חצי-מוצק המכיל matrigel וגורמי גדילה.פעולה זו מגבילה את תנועתן של תאי פרוגניטור (progenitor cells) בודדים, תוך שהיא מאפשרת את הישרדותם, התרבותם והתמיינותם in vitro. לאחר מכן, נספרו ודורגו תחת מיקרוסקופ מספר המושבות שהתקבלו בעלות מורפולוגיה ייחודית, וזאת על מנת לחשב את שכיחות התאים הפרוגניטורים יוצרי המושבות באוכלוסייה ממוינת נתונה. ניתוח של מושבות בודדות באמצעות real-time PCR ומיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה חושף ביטוי של אינסולין במושבות שנגזרות מתאים חיוביים ל-ngn3, אך לא מתאים שליליים ל-NGN3.היתרון המרכזי בשימוש בטכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון תרביות תלויות (suspension culture) של ספירות לבלב, הוא שטכניקה זו מאפשרת לבחון כמות גדולה יותר של תאים בו-זמנית כדי לבדוק את יכולתם העצמית להיווצרות מושבות פרוגניטוריות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות הנוגעות לביולוגיה של תאי גזע ותאי פרוגניטור של הלבלב, כגון אילו סמנים (markers) מבטאים תאי הפרוגניטור, ואילו גורמים פנימיים או חיצוניים חשובים לתחזוקה, להתחדשות עצמית ולהבחנה של תאים אלו. להשלכות של טכניקה זו עשויה להיות חשיבות עבור הטיפול בסוכרת מסוג 1, שכן אם ניתן יהיה לזהות תאי פרוגניטור של הלבלב ולהבחין אותם לכיוון תאים דמויי בטא, יוכלו תאים אלו לשמש להחלפת תאי בטא פגומים בחולים עם סוכרת מסוג 1 בשלב סופי.ניתן להחיל שיטה זו גם על מערכות אחרות, כגון חקר תאי מוצא היוצרים מושבות בלבלב לאחר הלידה ובבגרות, במוח העצם, בכבד ובטחול. בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בטכניקה זו יתקלו בקשיים, שכן פירוק התאים לתליה של תאים בודדים וטיפול במטריג'ל ובמתילצלולוז כהכנה לחלוקה עשויים להיות מורכבים. הרעיון לשיטה זו עלה בדעתי לראשונה כאשר זיהיתי שאין בדיקה קלונוגנית הבוחנת את הקשר השושלתי בין תאי מוצא לבין צאצאיהם המובחנים מהלבלב.בדיקת מושבות מסוג זה הייתה בעלת תפקיד מרכזי בחקר תאי גזע המטופואטיים ותאים פרוגניטוריים בעבר. אני מזהה צורך בבדיקה כזו לצורך חקר הביולוגיה של תאי גזע בלבלב. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שהמרכיב החצי-מוצק של המצע הוא צמיגי מטבעו, ושלבי ההכנה והחלוקה קשים ללמידה.את הפרוצדורות ידגימו מר מייקל וינקלר, סטודנט לתואר שני, גב' ננסי, טכנאית, וד"ר לנג ג'ינג, עמית פוסט-דוקטורט ממעבדה, במטרה להפיק מדיום מותנה עבור בדיקת מושבות שתבוצע בהמשך. תאי ES עצביים מובחלים לתאים דמויי לבלב in vitro. התחילו את הפרוצדורה בבדיקת גופי עובר בני שישה ימים תחת מיקרוסקופ אור.לפחות 30 עד 40% מהם צריכים להיות בעלי קוטר של 150 מיקרון לפחות. גוף העובר הגדול יותר צריך להכיל נקודות כהות המעידות על דיפרנציאציה מוגברת. העבירו 80 עד 100 גופי עוברים לכל באער בלוח הצמדה בעל שש באערים, ולאחר מכן נערו בעדינות את הלוח כדי לרכז את גופי העוברים במרכז הבאערים במטרה להגביר את המגעים בין התאים.מגעים אלו מובילים לפיתוח טוב יותר של תאים דמויי לבלב מגופי עוברים. החזירו בעדינות את הפלטות לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide עבור התרבית. A 13.החליפו את המצע במצע תרבית להיצמדות טרי, המכיל nicotinamide במינוני עודף ו-human recombinant active in beta B כדי להשרות התמיינות של תאי אנדוקרין. לאחר מכן, החזירו את התרביות לאינקובטור. ביום 16, אספו את המצע וסננו אותו דרך ממבנה polyethers sulfate של 0.2 מיקרון כדי להסיר שאריות תאים.מנקודה זו ואילך, המצע שנאסף יכונה מצע מותנה. חלקו את המצעים המותנים לשפירים קוניים מפוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר ואחסנו אותם בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד רגע השימוש. Neurogen 3 הוא פקטור שעתוק המובע על ידי תאי פרוגניטורים אנדוקריניים של הלבלב במהלך ההתפתחות. קדמונים אנדוקריניים המבטאים את neurogen 3 מבדילים בסופו של דבר לתאים המבטאים אלפא, בטא, דלתא, אפסילון ופוליפפטיד לבלבי. כדי להקל על זיהוי התאים המבטאים את NG N3, אלל אחד של לוקוס NNG N3 הוחלף בגן הדוחה EGFP בשורת תאי ES של עכברים בשיטת knockin. שורת התאים שהתקבלה הוגדרה כ-NGN three EGFP. כדי להשיג תאים מובחלים חיוביים ל-NGN three EGFP ושליליים ל-NGN three EEG FP.ראשית, התאים מופרדים מהצלחות התרבית באמצעות טריפסין ביום ה-16 כדי להפיק סספנסיה של תאים בודדים. גושי התאים מדגריים עם קולגנאז B ו-DNAs one ועוברים דרך רשת של 40 או 70 מיקרון. לאחר מכן מוסיפים DPI והתאים מופרדים בממיין תאים על בסיס פיזור קדמי (forward scatter) מול פיזור צדדי (side scatter), המעידים בהתאמה על גודל התא והגרנולריות שלו, אשר ממוגלים על הגרף.לאחר מכן נמתח שער (gate) כדי להסיר פסולת שאינה תאית. DPI משמש להבחנה בין תאים מתים, אשר ייצבעו כחיוביים. כאשר העירה מתבצעת באורך גל של 405 עד 413 ננומטר והפליטה מזוהה עם מסנן 454/40, מיון לפי רוחב פעימה (pulse width), כלומר רוחב פעימת הפיזור הקדמי האלקטרוני, חושף דובלטים (doublets), אותם יש להסיר לפני המעבר דרך מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) של ערוץ EGFP FL1 לעומת פלואורסצנציה עצמית.שימוש בתאים מיום 16 משורת תאי הורה של ביקורת, כגון TL המוצגת בפאנל השמאלי, מאיר פלואורסצנציה אמיתית ובכך ניתן להמחיש את אוכלוסיית התאים החיוביים ל-NGN three EEG FP כפי שניתן לראות בפאנל הימני. שער המיון של תאים חיוביים ל-NGN three EGFP הוזז במכוון ימינה כפי שמוצג כאן על ידי החץ, במטרה להגביל זיהום של תאים שליליים ל-NG N three EEG FP במהלך המיון. לאחר קביעת השערים, התאים החיוביים ל-NGN three EEG, FP והתאים השליליים ל-NGN three EGFP מומינו ומאוחסנים על קרח עד לשימושם בהכנה לזריעה.יש להניח את ה-matrigel על קרח בטמפרטורה של 4°C בלילה שלפני הניסוי. ביום הניסוי, יש להכין על קרח את הרכיבים או התמיסות הבאים: DMEM/F12, methyl cellulose, מדיום מותנה, FCS, nicotinamide, XTEND, VEGF-A ו-recombinant human active TGF-β. יש להניח קופסה סטרילית של טיפים לפיפטה בנפח 200 µL בטמפרטורה של 20°-C לפחות חצי שעה לפני השימוש. כהכנה לזריעת התאים הממוינים, יש להוסיף תחילה את רכיבי המדיום החצי-מוצק לשפופרת פוליסטירן בנפח 5 mL. ראשית, השתמשו במחט בכי মাপ 16.5 כדי לשאוב כמות קטנה של תמיסת 3.3% methyl cellulose לתוך מזרק.לאחר מכן, דחפו מיד את התמיסה החוצה כדי להוציא את האוויר. פעולה זו תמלא את הנפח המת בתוך המזרק בתמיסה ותסייע למדידה מדויקת של נפח התמיסה החצי-מוצקה. לאחר מכן, תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר, שאבו והעבירו את הנפח הרצוי של תמיסת methyl cellose לתוך מבחנה של חמישה מיליליטר.הוסיפו את המצע המותנה FCS nicotinamide extending four active in beta B, VEGF A ו-D-M-E-M-F 12. לאחר מכן, השתמשו בקצות פיפט קרות כדי להוסיף את ה-matrigel. לבסוף, הוסיפו את הכמות הרצויה של תאים ממוינים לתוך מבחנה בנפח 5 mL.הוסיפו תמיד את התאים אחרון כדי למנוע גירוי מוקדם של התאים. לאחר מכן, סגרו את השפופרת היטב במיכסע ונערה את השפופרות בעוצמה וביסודיות באופן ידני. מכיוון שניעור יוצר בועות אוויר, הניחו את השפופרות על קרח למשך חמש דקות או עד שבועות האוויר הקטנות יעלו לפני השטח.בעזרת מזרק של 1 מיליליטר עם מחט במידה 18.5, שאבו כמות קטנה של תערובת התאים במצע חצי-מוצק ורוקנו מיד את האוויר מהמזרק. לאחר מכן, העבירו באיטיות 500 µL של תערובת התאים החצי-מוצקה ישירות למרכזו של כל באר בלוח בעל 24 בארים עם היצמדות נמוכה (low attachment plate). יש לזרוע כל דגימה בארבעה כפילויות (quad duplicate); רק ארבעת העמודות הפנימיות ביותר בלוח ה-24 בארים המונח בצורה אופקית ישמשו לתרבית.מלאו את הבארים הנותרות במים סטריליים כדי לסייע בלחות של התרבית המכילה תאים. מיד לאחר הזריעה, בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ אור.תאים בודדים מפוזרים באופן אקראי ואחיד בכל הבארות. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C ובאוויר המכיל 5% carbon dioxide למשך שמונה עד 12 ימים. לאחר דגירה של שמונה עד 12 ימים, בחנו שוב את התאים תחת מיקרוסקופ.זוהי דוגמה טובה לפיזור אחיד של matrigel בתרבית. להלן דוגמה לפיזור לא אחיד של matrigel הגורם למסגרת מסוג Apache. מושבות אינן גדלות במקומות שבהם ה-matrigel חסר.זוהי דוגמה לרקע של הבאר שבה לא הוסף matrigel לתערובת המצע החצי-מוצק. כדי לספור את המושבות שהתקבלו, הצמידו סריג מתחת לצלחת. לאחר מכן, באמצעות עדשה עם הגדלה של 10 פעמים, צפו וספרו את המושבות; בשל טבעו התלת-ממדי של המצע, המושבות יופיעו בנקודות מיקוד שונות.לפיכך, ייתכן ויהיה צורך בכיול מחדש של הפוקוס עבור כל מושבה במהלך התצפית במיקרוסקופ אור. תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של מושבות המבטאות אינסולין בתרבית חצי-מוצקה לאחר שמונה עד 12 ימים מוצגות כאן; המושבות המסומנות בחצים מפוזרות באופן אקראי ונראות כצבירים קטנים, כהים ולא מחזירי אור, בעלי קוטר של כ-60 עד 100 מיקרון. אנליזת R-T-P-C-R מיקרופלואידית שבוצעה לאחר מכן על מושבות שנבחרו ידנית באופן פרטני, חשפה ביטוי של אינסולין 2 וגלוקגון, בדומה לדיווח הקודם שלנו. תוצאות אלו מדגימות את יכולתם של תאים בודדים חיוביים ל-NGN three EGFP להתמיין למושבות המכילות שני הורמוני אי לט בו-זמנית, באופן המדמה תאים אנדוקריניים פרימיטיביים דמויי גל ראשון. ביטוי חלבון של eptide, סמן לייצור אינסולין דה-נובו, אושר באמצעות צביעה פלואורסצנטית של דגימה שלמה (whole mount).לסיכום, כאשר בדיקת יחידות יוצרות מושבות המבטאות אינסולין מבוצעת כפי שהודגם בדוח זה, ניתן לקבוע בקלות את מספר התאי-הקדמונים הבודדים בעלי היכולת ליצור מושבות. כפי שהודגם כאן ובדוח הקודם שלנו, ניתן להעשיר יחידות יוצרות מושבות המבטאות אינסולין על ידי מיון תאים חיוביים ל-NGN EGFP, אך שליליים ל-ngn three EEG FP, הגזורים מתאי ES של עכברים in vitro. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה עד שלוש שעות לאחר המיון. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לדחוס את התאים לחלוטין לסספנזיה של תאים בודדים, לשמור את כל רכיבי התרבית על קרח כדי למנוע התמצקות של matrigel, ולהוסיף את התאים למבחנות בשלב האחרון כדי למנוע גירוי מוקדם של התאים בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מניפולציה של תא בודד, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האם תא בודד מספיק כדי ליזום היווצרות מושבות לאחר פיתוחן.טכניקה זו תסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של תאי גזע ותאי פרוגניטור של הלבלב. היא מאפשרת להם לבחון את יכולת ההתחדשות העצמית ואת יכולת ההבדלה לתאי דמויי בטא. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד לבצע בדיקת מושבות כמותית עבור פרוגניטורים יוצרי מושבות המבטאים אינסולין.

a-quantitative-assay-for-insulin-expressing-colony-forming-progenitors

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לכמת את טרנסלוקציה של GLUT4 מן הציטופלסמה אל קרום התא של תאים על ידי cytometry הזרימה.

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

מבחני מושבה במבחנה כדי לזהות עצמית והתחדשות והבחנה של ובתאים מבודדים לבלב בעכברים בוגר הם המציאו. מבחנים אלה, אבות לבלב להצמיח מושבות תאים בחלל 3 ממדים במדיום methylcellulose המכיל מוצק למחצה. פרוטוקולים לטיפול תאים בודדים ואפיון של מושבות בודדות מתוארים.

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

אתגרים קריטיים לתחום מחקר הסוכר מעוניינים להבין את המנגנונים המולקולריים מווסת שכפול β-cell איון לפתח שיטות מגרה התחדשות תאי β. בזאת שיטה גבוהה ההקרנה תוכן לזהות ולהעריך את הפעילות β-cell לקידום שכפול של מולקולות קטנות מוצג.

A-תכולה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלטפורמת Discovery הלבלב איילט β-cell שכפול

כאן, אנו מציגים מתודולוגיה ליצירה וניהול של מיקרוספירות פולי (חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) טעונות עניין לאיי עכבר שלמים בתרבית עם ניתוח אימונופלואורסצנטי לאחר מכן של התפשטות β תאים. שיטה זו מתאימה לקביעת היעילות של מיטוגנים β תאים מועמדים.

מנהל מתמשך של mitogens β-cell כדי איי עכבר Intact<em&gt; Ex Vivo</em&gt; שימוש פוליפוני מתכלה (לקטית-שיתוף גליקולית וחומצה) מיקרוסכמות

כאן, אנו מציגים הומוגנית זמן נפתרה תדאג (HTRF) בתור שיטה יעילה לגילוי מהיר של אינסולין מופרש מתאי.

פורסטר זמן לפתור הומוגנית תהודה אנרגיה מבוססת על העברת Assay גילוי של הפרשת האינסולין

הציגו כאן הוא פרוטוקול למדידת תאים מתרבים CD4+ T בתגובה לחלבונים אנטיגניים או פפטידים באמצעות דילול צבען. שיטת הפעולה רגישה במיוחד לתאי T נדירים הספציפיים לאנטיגן וניתן לשנותם כדי להקל על השכפול של תאים ספציפיים לאנטיגן.

קוונפיקציה של מתרבים אנטיגן אנושי-ספציפי CD4+ T תאים באמצעות Carboxyפלואורומיתאת הדיקן אסתר

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע מהירה בעלות נמוכה לוציפרראז בחני בתפוקה בינונית באמצעות העברת אינסולין מקושרת של גאוסיה לוציפראז כפרוקסי עבור הפרשת אינסולין מתאי בטא. ניתן לבצע את האפשרות עם מרבית קוראי הצלחות והפיפטות רב ערוצית.

מדידת הפרשת אינסולין יחסית באמצעות מחליף שכונתיות לוציפראז

התמיינות תאי גזע לתאי איון מספקת פתרון חלופי לטיפול קונבנציונלי בסוכרת ולמידול מחלות. אנו מתארים פרוטוקול מפורט של תרבית תאי גזע המשלב ערכת התמיינות מסחרית עם שיטה שאושרה בעבר כדי לסייע בייצור איים מפרישי אינסולין שמקורם בתאי גזע בצלחת.

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לצברי איים מייצרי אינסולין

מאמר זה מציג פרוטוקול להתמיינות מכוונת וניתוח פונקציונלי של תאים דמויי תאי β. אנו מתארים תנאי תרבית אופטימליים ומעברים עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לפני יצירת תאי לבלב מייצרי אינסולין. ההתמיינות בת ששת השלבים מתקדמת מיצירת אנדודרם סופית לתאים פונקציונליים דמויי תאי β המפרישים אינסולין בתגובה לגלוקוז.

פרוטוקול אופטימלי ליצירת תאים תפקודיים מפרישי אינסולין בלבלב מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

הקמנו מבחן הכלאה דופלקס באתרו למיפוי איזופורמים של קולטני אינסולין IR-A ו-IR-B במקלעת הכורואיד של העכבר, תוך התגברות על מגבלות השיטות המסורתיות. גישה ברזולוציה גבוהה זו חושפת ביטוי ספציפי לאיזופורמים, ומציעה תובנות חדשות לגבי איתות אינסולין במוח וטיפולים ממוקדי איזופורמים פוטנציאליים להפרעות נוירולוגיות.

הדמיה מדויקת של קולטני אינסולין A ו-B במוח עכברים עם בדיקת היברידיזציה של RNA באתרו

מחקר זה פיתח שיטה פשוטה לחילוץ יעיל של איים ראשוניים תפקודיים ותאי אקינר מהלבלב בעכבר, ומציע כלי חשוב לחקר תקשורת בין-תאית בפתוגנזה של סוכרת מונעת מדלקת לבלב חריפה.

שיטה פשוטה ומהירה לבידוד סימולטני של איים ראשוניים ותאי אצינר ראשוניים בלבלב מעכברים

למד שיטה לזיהוי תאי אבות פנקריאטיים המבטאים אינסולין באמצעות מבחן קלונוגני תלת-ממדי. השיטה משתמשת בתרבית חד-תאית בתווך חצי-מוצק עם Matrigel וגורמי גדילה כדי לחקור התמיינות תאי אבות לתאי בטא.

Assay כמותי עבור אינסולין להביע המושבה יוצרי אבות

גלה סרטונים נוספים