Assay כמותי עבור אינסולין להביע המושבה יוצרי אבות

סרטון זה מדגים פרוצדורה ליצירת תרביות תלת-ממדיות המאפשרות לתאי פרוגניטור דמויי לבלב להבדיל עצמם למושבות המבטאות אינסולין. ראשית, תאים מובחנים שנגזרו מקו תאי גזע עובריים של עכבר מסוג neurogen in three EGFP Knockin מופרדים וממוינים לפי ביטוי EGFP כדי להעשיר את תאי הפרוגניטור הדמויי אנדוקרין. התאים הבודדים הממוינים החיוביים ל-EGFP נזרעים למצע חצי-מוצק המכיל matrigel וגורמי גדילה.

פעולה זו מגבילה את תנועתן של תאי פרוגניטור (progenitor cells) בודדים, תוך שהיא מאפשרת את הישרדותם, התרבותם והתמיינותם in vitro. לאחר מכן, נספרו ודורגו תחת מיקרוסקופ מספר המושבות שהתקבלו בעלות מורפולוגיה ייחודית, וזאת על מנת לחשב את שכיחות התאים הפרוגניטורים יוצרי המושבות באוכלוסייה ממוינת נתונה. ניתוח של מושבות בודדות באמצעות real-time PCR ומיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה חושף ביטוי של אינסולין במושבות שנגזרות מתאים חיוביים ל-ngn3, אך לא מתאים שליליים ל-NGN3.

היתרון המרכזי בשימוש בטכניקה זו על פני טכניקות קיימות, כגון תרביות תלויות (suspension culture) של ספירות לבלב, הוא שטכניקה זו מאפשרת לבחון כמות גדולה יותר של תאים בו-זמנית כדי לבדוק את יכולתם העצמית להיווצרות מושבות פרוגניטוריות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות הנוגעות לביולוגיה של תאי גזע ותאי פרוגניטור של הלבלב, כגון אילו סמנים (markers) מבטאים תאי הפרוגניטור, ואילו גורמים פנימיים או חיצוניים חשובים לתחזוקה, להתחדשות עצמית ולהבחנה של תאים אלו. להשלכות של טכניקה זו עשויה להיות חשיבות עבור הטיפול בסוכרת מסוג 1, שכן אם ניתן יהיה לזהות תאי פרוגניטור של הלבלב ולהבחין אותם לכיוון תאים דמויי בטא, יוכלו תאים אלו לשמש להחלפת תאי בטא פגומים בחולים עם סוכרת מסוג 1 בשלב סופי.

ניתן להחיל שיטה זו גם על מערכות אחרות, כגון חקר תאי מוצא היוצרים מושבות בלבלב לאחר הלידה ובבגרות, במוח העצם, בכבד ובטחול. בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בטכניקה זו יתקלו בקשיים, שכן פירוק התאים לתליה של תאים בודדים וטיפול במטריג'ל ובמתילצלולוז כהכנה לחלוקה עשויים להיות מורכבים. הרעיון לשיטה זו עלה בדעתי לראשונה כאשר זיהיתי שאין בדיקה קלונוגנית הבוחנת את הקשר השושלתי בין תאי מוצא לבין צאצאיהם המובחנים מהלבלב.

בדיקת מושבות מסוג זה הייתה בעלת תפקיד מרכזי בחקר תאי גזע המטופואטיים ותאים פרוגניטוריים בעבר. אני מזהה צורך בבדיקה כזו לצורך חקר הביולוגיה של תאי גזע בלבלב. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שהמרכיב החצי-מוצק של המצע הוא צמיגי מטבעו, ושלבי ההכנה והחלוקה קשים ללמידה.

את הפרוצדורות ידגימו מר מייקל וינקלר, סטודנט לתואר שני, גב' ננסי, טכנאית, וד"ר לנג ג'ינג, עמית פוסט-דוקטורט ממעבדה, במטרה להפיק מדיום מותנה עבור בדיקת מושבות שתבוצע בהמשך. תאי ES עצביים מובחלים לתאים דמויי לבלב in vitro. התחילו את הפרוצדורה בבדיקת גופי עובר בני שישה ימים תחת מיקרוסקופ אור.

לפחות 30 עד 40% מהם צריכים להיות בעלי קוטר של 150 מיקרון לפחות. גוף העובר הגדול יותר צריך להכיל נקודות כהות המעידות על דיפרנציאציה מוגברת. העבירו 80 עד 100 גופי עוברים לכל באער בלוח הצמדה בעל שש באערים, ולאחר מכן נערו בעדינות את הלוח כדי לרכז את גופי העוברים במרכז הבאערים במטרה להגביר את המגעים בין התאים.

מגעים אלו מובילים לפיתוח טוב יותר של תאים דמויי לבלב מגופי עוברים. החזירו בעדינות את הפלטות לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide עבור התרבית. A 13.

החליפו את המצע במצע תרבית להיצמדות טרי, המכיל nicotinamide במינוני עודף ו-human recombinant active in beta B כדי להשרות התמיינות של תאי אנדוקרין. לאחר מכן, החזירו את התרביות לאינקובטור. ביום 16, אספו את המצע וסננו אותו דרך ממבנה polyethers sulfate של 0.2 מיקרון כדי להסיר שאריות תאים.

מנקודה זו ואילך, המצע שנאסף יכונה מצע מותנה. חלקו את המצעים המותנים לשפירים קוניים מפוליפרופילן בנפח 15 מיליליטר ואחסנו אותם בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד רגע השימוש. Neurogen 3 הוא פקטור שעתוק המובע על ידי תאי פרוגניטורים אנדוקריניים של הלבלב במהלך ההתפתחות. קדמונים אנדוקריניים המבטאים את neurogen 3 מבדילים בסופו של דבר לתאים המבטאים אלפא, בטא, דלתא, אפסילון ופוליפפטיד לבלבי. כדי להקל על זיהוי התאים המבטאים את NG N3, אלל אחד של לוקוס NNG N3 הוחלף בגן הדוחה EGFP בשורת תאי ES של עכברים בשיטת knockin. שורת התאים שהתקבלה הוגדרה כ-NGN three EGFP. כדי להשיג תאים מובחלים חיוביים ל-NGN three EGFP ושליליים ל-NGN three EEG FP.

ראשית, התאים מופרדים מהצלחות התרבית באמצעות טריפסין ביום ה-16 כדי להפיק סספנסיה של תאים בודדים. גושי התאים מדגריים עם קולגנאז B ו-DNAs one ועוברים דרך רשת של 40 או 70 מיקרון. לאחר מכן מוסיפים DPI והתאים מופרדים בממיין תאים על בסיס פיזור קדמי (forward scatter) מול פיזור צדדי (side scatter), המעידים בהתאמה על גודל התא והגרנולריות שלו, אשר ממוגלים על הגרף.

לאחר מכן נמתח שער (gate) כדי להסיר פסולת שאינה תאית. DPI משמש להבחנה בין תאים מתים, אשר ייצבעו כחיוביים. כאשר העירה מתבצעת באורך גל של 405 עד 413 ננומטר והפליטה מזוהה עם מסנן 454/40, מיון לפי רוחב פעימה (pulse width), כלומר רוחב פעימת הפיזור הקדמי האלקטרוני, חושף דובלטים (doublets), אותם יש להסיר לפני המעבר דרך מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) של ערוץ EGFP FL1 לעומת פלואורסצנציה עצמית.

שימוש בתאים מיום 16 משורת תאי הורה של ביקורת, כגון TL המוצגת בפאנל השמאלי, מאיר פלואורסצנציה אמיתית ובכך ניתן להמחיש את אוכלוסיית התאים החיוביים ל-NGN three EEG FP כפי שניתן לראות בפאנל הימני. שער המיון של תאים חיוביים ל-NGN three EGFP הוזז במכוון ימינה כפי שמוצג כאן על ידי החץ, במטרה להגביל זיהום של תאים שליליים ל-NG N three EEG FP במהלך המיון. לאחר קביעת השערים, התאים החיוביים ל-NGN three EEG, FP והתאים השליליים ל-NGN three EGFP מומינו ומאוחסנים על קרח עד לשימושם בהכנה לזריעה.

יש להניח את ה-matrigel על קרח בטמפרטורה של 4°C בלילה שלפני הניסוי. ביום הניסוי, יש להכין על קרח את הרכיבים או התמיסות הבאים: DMEM/F12, methyl cellulose, מדיום מותנה, FCS, nicotinamide, XTEND, VEGF-A ו-recombinant human active TGF-β. יש להניח קופסה סטרילית של טיפים לפיפטה בנפח 200 µL בטמפרטורה של 20°-C לפחות חצי שעה לפני השימוש. כהכנה לזריעת התאים הממוינים, יש להוסיף תחילה את רכיבי המדיום החצי-מוצק לשפופרת פוליסטירן בנפח 5 mL. ראשית, השתמשו במחט בכי মাপ 16.5 כדי לשאוב כמות קטנה של תמיסת 3.3% methyl cellulose לתוך מזרק.

לאחר מכן, דחפו מיד את התמיסה החוצה כדי להוציא את האוויר. פעולה זו תמלא את הנפח המת בתוך המזרק בתמיסה ותסייע למדידה מדויקת של נפח התמיסה החצי-מוצקה. לאחר מכן, תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר, שאבו והעבירו את הנפח הרצוי של תמיסת methyl cellose לתוך מבחנה של חמישה מיליליטר.

הוסיפו את המצע המותנה FCS nicotinamide extending four active in beta B, VEGF A ו-D-M-E-M-F 12. לאחר מכן, השתמשו בקצות פיפט קרות כדי להוסיף את ה-matrigel. לבסוף, הוסיפו את הכמות הרצויה של תאים ממוינים לתוך מבחנה בנפח 5 mL.

הוסיפו תמיד את התאים אחרון כדי למנוע גירוי מוקדם של התאים. לאחר מכן, סגרו את השפופרת היטב במיכסע ונערה את השפופרות בעוצמה וביסודיות באופן ידני. מכיוון שניעור יוצר בועות אוויר, הניחו את השפופרות על קרח למשך חמש דקות או עד שבועות האוויר הקטנות יעלו לפני השטח.

בעזרת מזרק של 1 מיליליטר עם מחט במידה 18.5, שאבו כמות קטנה של תערובת התאים במצע חצי-מוצק ורוקנו מיד את האוויר מהמזרק. לאחר מכן, העבירו באיטיות 500 µL של תערובת התאים החצי-מוצקה ישירות למרכזו של כל באר בלוח בעל 24 בארים עם היצמדות נמוכה (low attachment plate). יש לזרוע כל דגימה בארבעה כפילויות (quad duplicate); רק ארבעת העמודות הפנימיות ביותר בלוח ה-24 בארים המונח בצורה אופקית ישמשו לתרבית.

מלאו את הבארים הנותרות במים סטריליים כדי לסייע בלחות של התרבית המכילה תאים. מיד לאחר הזריעה, בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ אור.

תאים בודדים מפוזרים באופן אקראי ואחיד בכל הבארות. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C ובאוויר המכיל 5% carbon dioxide למשך שמונה עד 12 ימים. לאחר דגירה של שמונה עד 12 ימים, בחנו שוב את התאים תחת מיקרוסקופ.

זוהי דוגמה טובה לפיזור אחיד של matrigel בתרבית. להלן דוגמה לפיזור לא אחיד של matrigel הגורם למסגרת מסוג Apache. מושבות אינן גדלות במקומות שבהם ה-matrigel חסר.

זוהי דוגמה לרקע של הבאר שבה לא הוסף matrigel לתערובת המצע החצי-מוצק. כדי לספור את המושבות שהתקבלו, הצמידו סריג מתחת לצלחת. לאחר מכן, באמצעות עדשה עם הגדלה של 10 פעמים, צפו וספרו את המושבות; בשל טבעו התלת-ממדי של המצע, המושבות יופיעו בנקודות מיקוד שונות.

לפיכך, ייתכן ויהיה צורך בכיול מחדש של הפוקוס עבור כל מושבה במהלך התצפית במיקרוסקופ אור. תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של מושבות המבטאות אינסולין בתרבית חצי-מוצקה לאחר שמונה עד 12 ימים מוצגות כאן; המושבות המסומנות בחצים מפוזרות באופן אקראי ונראות כצבירים קטנים, כהים ולא מחזירי אור, בעלי קוטר של כ-60 עד 100 מיקרון. אנליזת R-T-P-C-R מיקרופלואידית שבוצעה לאחר מכן על מושבות שנבחרו ידנית באופן פרטני, חשפה ביטוי של אינסולין 2 וגלוקגון, בדומה לדיווח הקודם שלנו. תוצאות אלו מדגימות את יכולתם של תאים בודדים חיוביים ל-NGN three EGFP להתמיין למושבות המכילות שני הורמוני אי לט בו-זמנית, באופן המדמה תאים אנדוקריניים פרימיטיביים דמויי גל ראשון. ביטוי חלבון של eptide, סמן לייצור אינסולין דה-נובו, אושר באמצעות צביעה פלואורסצנטית של דגימה שלמה (whole mount).

לסיכום, כאשר בדיקת יחידות יוצרות מושבות המבטאות אינסולין מבוצעת כפי שהודגם בדוח זה, ניתן לקבוע בקלות את מספר התאי-הקדמונים הבודדים בעלי היכולת ליצור מושבות. כפי שהודגם כאן ובדוח הקודם שלנו, ניתן להעשיר יחידות יוצרות מושבות המבטאות אינסולין על ידי מיון תאים חיוביים ל-NGN EGFP, אך שליליים ל-ngn three EEG FP, הגזורים מתאי ES של עכברים in vitro. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה עד שלוש שעות לאחר המיון. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לדחוס את התאים לחלוטין לסספנזיה של תאים בודדים, לשמור את כל רכיבי התרבית על קרח כדי למנוע התמצקות של matrigel, ולהוסיף את התאים למבחנות בשלב האחרון כדי למנוע גירוי מוקדם של התאים בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מניפולציה של תא בודד, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האם תא בודד מספיק כדי ליזום היווצרות מושבות לאחר פיתוחן.

טכניקה זו תסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של תאי גזע ותאי פרוגניטור של הלבלב. היא מאפשרת להם לבחון את יכולת ההתחדשות העצמית ואת יכולת ההבדלה לתאי דמויי בטא. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד לבצע בדיקת מושבות כמותית עבור פרוגניטורים יוצרי מושבות המבטאים אינסולין.