Name: CD4 + T-לימפוציטים לכידת באמצעות שבב Microfluidic פנויה ל-HIV (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:03:52.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: למד ללכוד לימפוציטי T עוזרים חיוביים ל-CD4 מדגימות דם באמצעות מכשיר מיקרו-נוזלי מבוסס PDMS. שיטה זו מאפשרת ניתוח תאים מדויק בסביבות עם משאבים מוגבלים למחקר אימונולוגי ואבחון HIV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ערוץ microfluidic עם משטח + אנטי CD4 biotinlayted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 10 מ&quot;ל של דם מדגם ב 5 מ&quot;ל / דקה לתוך התעלה microfluidic עם משאבת מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הדם 20 מ&quot;ל / דקה במשך 20 דקות עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק פתרון FACS בדילול lysing (בדילול מלא 10% מן המניות עם פתרון PBS) בשעה 5ul/min במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק CD3 העיקרי + פתרון נוגדן (בדילול מלא 10% מן המניות עם פתרון PBS) בשעה 5 מ&quot;ל / דקה במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש החוצה עם ערוץ PBS ב 5 מ&quot;ל / דקה במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 20% AF488 CD4 + נוגדן, 0.2% פתרון DAPI מניות, ו -10% משני CD3 + נוגדן ב 5 מ&quot;ל / דקה במשך 20 דקות באותו זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הערוץ עם PBS ב 5 מ&quot;ל / דקה במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבן (אופטי) - שחור ולבן: תא ואבק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> UV (DAPI) - כחול: תא בלבד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כחול (CD4 +) - ירוק: לימפוציטים מסוג T ו מונוציטים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרין (CD3 +) - אדום: לימפוציטים מסוג T בלבד </li></ol></li></ol>

<table><tbody><tr><td>מיקרו-ערוץ PDMS</td><td></td><td></td><td></td><td>יוצר באמצעות תבנית SU-8</td></tr><tr><td>דם</td><td></td><td></td><td></td><td>דם נתרם מנבד אנושי בריא. Mass General Hospital, 10 X WBC בצפיפות גבוהה או Brigham and Women&amp;rsquo;s Hospital.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>בופר</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td>1x Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphated Buffered Saline.</td></tr><tr><td>תמיסת ליזיס ל-FACS</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>מהולה ל-10% מתמיסת המקור עם PBS.</td></tr><tr><td>נוגדן Anti-CD4+ מסומן בביוטין</td><td></td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>IM0704</td><td>המשטח הוכנה עם נוגדן Anti-CD4+ מסומן בביוטין, מהולה ל-10% מתמיסת המקור עם PBS/BSA לאחר ערבוב עם 0.2mg תמיסת מקור ו-1ml מים דה-יוניים.</td></tr><tr><td>goat anti-hCD3delta</td><td>pAB</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1128</td><td>מהולה ל-10% מתמיסת המקור עם PBS</td></tr><tr><td>rabbit anti-goat IgG PE</td><td></td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-3755</td><td>נוגדן שני עבור נוגדן anti-CD3, מהולה ל-10% מתמיסת המקור עם PBS</td></tr><tr><td>anti-human CD4+</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>557695</td><td>מסומן ב-Alexa Fluor 488, מהולה ל-20% מתמיסת המקור עם PBS.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>4&amp;rsquo;,6-dianidino-2-phenylindole, תמיסת dihydrochloride, מהולה ל-0.2% מתמיסת המקור עם PBS.</td></tr></tbody></table>

cd4 + t-לימפוציטים לכידת באמצעות שבב microfluidic פנויה ל-hiv

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-לימפוציטים לכידת באמצעות שבב Microfluidic פנויה ל-HIV

שלום, שמי ריצ'רד לין ואני חוקר כאן בקבוצה של פרופסור TI Mercy בחטיבה למדעי הבריאות וטכנולוגיה של הרווארד MIT. הפרויקט שבו אני עובד הוא כימות ולכידה של לימפוציטים T חיוביים ל-CD4 וחיוביים ל-C3. דם של מטופלים ישמש בסביבות עם משאבים מוגבלים.כאן לפניי ישנו התקן מיקרופלואידי העשוי מ-PDMS, שזהו Polymethylsiloxane. גובה התעלה עצמה הוא 50 micrometers והנפח הכולל בהתקן הוא 10 microliter. זהו התקן מדויק ביותר שבו נשתמש כדי ללכוד לימפוציטים מסוג T helper.ביסודו של דבר, זהו מדד האבחנה עבור חולי HIV. פני השטח של המכשיר המיקרו-פלואידי כבר הוכשרו עם חלבון, ובמזרק נמצאים נוגדנים חיוביים ל-CD4. כעת יש לנו רק בופר ביולוגי PBS ב-pH של 7.4, ואנו נזרימה אותו לתוך התעלה כדי לשטוף את עודפי הנוגדנים החיוביים ל-CD4.בשלב זה, אין צורך לשלוט בקצב הזרימה כיוון שאנו רק מנסים לשטוף את השאריות ואין באמת חשיבות לקצב הזרימה שלנו. כאן יהיו הכניסות למכשיר, ואלו יהיו היציאות, משמאלי וממימינכם כאן. כעת אשטוף את תמיסת הנוגדנים העודפת, ואם תבחינו ביציאה, תוכלו לראות את הנוזל שיוצא; מדובר בכמות מזערית מאוד, אך אם תסתכלו מקרוב תוכלו לראות נוזל יוצא מהתעלה דרך הצינורית.כעת, לאחר ששטפנו את תמיסת הנוגדנים העודפת, אנו יכולים להתכונן להזרקת הדם. לכן, אני אנתק כעת את הצינור מהכניסה. כעת נפתח מזרק חדש עבור הדם, דם אנושי, דם מלא.מדובר בדגימה מבריאה ולא בדגימה מחולה, דגימה מנבד בריא, בזמן שאנו נערכים להזרקת הדם למכשיר המיקרופלואידי. כעת נחבר את המזרק למשאבת המזרקים. נפעיל את המשאבה, וניתן לראות את קצבי הזרימה של המזרק; קבענו אותם ל-5 µL לדקה.כעת נכין את עצמנו להזרקה לתוך הדם. נמקם את משאבת המזרקים בצורה אנכית, כיוון שכפי שאנו יודעים, תאי דם שוקעים, ואנו נרצה שהתאים יזרמו אל תוך הערוץ. לכן, עדיף שהתאים ישקעו לתחתית, שנמצאת ממש ליד הפיתול שלנו.כעת הכל מוכן לפעולה. הנפח של המכשיר שלי הוא 10 µL ל-10 µL. והנפח שאנו רוצים להזרים אל דופן התעלה הוא גם 10 µL.כך אני יכול לדעת אם זרם מספיק דם רק על ידי התבוננות בצבע של התעלה; אם היא אדומה לגמרי ומלאה, אדע שזרמו 10 µL ואצטרך להפסיק את מעצור המזרק. כעת אלחץ על כפתור ההפעלה וזה יתחיל; לעיתים לוקח זמן עד שהדם נכנס בפועל לתעלה, ודבר זה נובע במידה רבה מהלחץ.לדוגמה, כאשר אנו מניחים שם את המזרק, לעיתים נשאב או נזריק את הנוזל בהתאם כדי לווסת את הדם בתוך הצינורית. לכן הדבר עשוי להיארך זמן מה, אך ברגע שהשאיבה לתעלה מתחילה, קצב הזרימה נקבע על ly לדקה, כפי שנדרש. לכן עלינו להיות סבלניים ולהמתין; לעיתים יש להמתין כשתי או שלוש דקות לפני שהדם מתחיל לזרום לתעלה.ניתן לראות כעת שהדם מתחיל לזרום לתוך התעלה. לפיכך ניתן להבחין שהמכשיר כמעט מלא לחלוטין. כעת נחזיר את הצינור ל-PBS כדי לשטוף את הדם שנמצא בתעלה.וכדי לעשות זאת, נחזור על הפעולות שכבר ביצענו כדי להסיר את הצינוריות. מכיוון שעדיין עלינו לשלוט בקצב זרימת ה-PBS, אנו עדיין זקוקים למשאבת המזרקים. עם זאת, כיוון שאיננו מזרימים יותר דם, אין צורך להשאיר את משאבת המזרקים במצב אנכי, כיוון שאין תאים ב-PBS.כעת כשהכל מוכן, נשטוף את הדם מהמכשיר, ואלחץ שוב על כפתור ה-sharp ממש כאן. כפי שניתן לראות, המכשיר מתחיל להתנקות. בשוליים עדיין נותר מעט דם, אך הוא נעלם לאט לאט.ברגע שכל הדם יסולק, נגדיל את הקצב מ-5 µL לדקה ל-20 µL לדקה. הסיבה לשינוי זה היא שבדם קיימים למעשה שני סוגי תאים בעלי אנטיגנים חיוביים ל-C4. אחד מהם הוא התאים שחיפשנו, הלימפוציטים מסוג T helper.הסוג השני הוא מה שאנו מכנים מונוציטים. אנו רוצים לוודא שהמכשיר שלנו לוכד באופן ספציפי רק את הלימפוציטים מסוג T helper, ולא גם את הלימפוציטים מסוג T helper וגם את המונוציטים. והשיטה שבה אנו עושים זאת היא על ידי הגדלת קצב הזרימה, כיוון שידוע לנו שמונוציטים גדולים יותר בתאיהם מתאי T helper.לכן, על ידי הגדלת קצבי הזרימה, המונוציטים הגדולים יותר יחוו לחץ רב יותר לעזוב את הפני השטח מאשר תאי T helper חיוביים ל-CD4. כעת זה לוקח בערך 20 דקות. כרגע בידי יש תמיסה.זהו תמיסות ריסוס (lysing solution). מטרתה במקרה זה היא להמיס תאי דם אדומים. כך, בכל מקום שבו נותרו תאי דם אדומים בתעלה, תמיסה זו תמיס אותם.זה끔 מהול פי 10 מהתמיסת המקור. כעת נמסיק להפסיק את פעולת משאבת המזרקים, להסיר את הפיתול ולהחליף את התמיסה בזו שבמזרק זה. אני עוצר כעת את המכונה, מסיר את הפיתול, מנתק אותו ומחליף אותו במזרק חדש.בסדר, עכשיו כשסידרתי את הכל, נחזיר את קצב הזרימה ל-5 µL לדקה. לכן נלחץ על הקצב, נשנה אותו מ-20 ל-5, וכעת נזרים את תמיסת ה-fax license למשך 20 דקות. כעת נלחץ על start.כעת מופיעה לפנינו תמונה אופטית של המכשיר שצולמה בהגדלה של 10x. ניתן לראות את כל הנקודות הלבנות הללו. כיצד נוכל לוודא שתאים אלו הם אכן התאים שאנו מחפשים?לפיכך, אנו משתמשים במספר צבעים שונים כדי לוודא; הצבע הראשון שבו אנו משתמשים נקרא DPI, והוא צובע את הגרעין. באופן בסיסי, כל התאים בעלי גרעין, כגון תאי דם לבנים, ייצבעו, בעוד שתאי דם אדומים, שאין להם גרעין, לא ייצבעו, וניתן לראות זאת לכל אורך התמונה. אלו הן כל הנקודות הכחולות הללו, וכל אחת מהן צבועה בכחול.הוא תא. לכן, השלב הבא הוא לבדוק אם לתאים יש את מה שאנו מכנים אנטיגן C4 חיובי. זה חשוב ביותר מכיוון שהמטרה הכוללת של המכשיר שלנו היא ללכוד תאים עם C4 חיובי.אם כן, הנוגדן הפלואורסצנטי הבא שבו אנו משתמשים הוא כמובן ספציפי ל-C4. נעבור לשקף הבא. בתמונה זו, התאים נראים עמומים הרבה יותר מכיוון שהנוגדן הפלואורסצנטי שבו השתמשנו הוא בדרך כלל עבור facts.לכן הדילול גבוה בהרבה. אך אם תסתכלו מקרוב, עדיין ניתן להבחין בנקודות הפזורות בשדה הראייה. הן עמומות למדי.אך בבחינה מקרוב נוכל לראות שתאים אלו הם CD4 חיוביים, וזה טוב מכיוון שזה בדיוק מה שאנחנו מחפשים. והבדיקה הבאה היא, כפי שהזכרתי קודם, שישנם שני סוגים שונים של תאים CD4 חיוביים. חלקם הם אלו שאנו רוצים, תאי T מסייעים (T helper cells), והשניים הם אלו שאנו מכנים מונוציטים.לכן אנו זקוקים שוב לנוגדן פלורסצנטי נוסף כדי להבחין בין שני התאים. ידוע כי בלימפוציטים מסוג T helper קיימים עליהם אנטיגנים שאנו מכנים CD3 positive, בעוד שמונוציטים אינם מחזיקים בהם.כך, הנוגדן הבא שבו נשתמש הוא ספציפי ל-CD3, כפי שניתן לראות בתמונה זו. שוב, ניתן להבחין בנקודות המפוזרות על פני המכשיר; הנקודות נראות גדולות יותר מכיוון שלעיתים תאים מסוימים פשוט זוהרים בעוצמה רבה יותר מאחרים. כלומר, במקרה זה דברים רבים תלויים במקריות, אך ברוב המקרים, נקודות אלו, הנקודות האדומות הבהירות, הן כולן תאים.לכן, שוב, מה שאנו רוצים הוא, ראשית, לוודא שהתאים שלנו הם CD4 positive ו-CD3 positive. במקרה זה ניתן לראות שרבים מהתאים שלנו הם CD3 positive, וזה טוב. זה מעניק לנו ספציפיות בתהליך הלכידה.הנקודות הגדולות עלולות להיות פסולת, אך במקרים רבים מה שקורה הוא ש לעיתים תא פשוט צבר יותר CD3, כלומר CD3 על פניו. בתמונה זו, זהו אחד הנתונים שאספנו עבור התקן מיקרו-פלואידי זה, והוא למעשה פרוטוקול ללכידת תאים. בשקופיות הקודמות, כפי שניתן לראות, היו תמונות רבות עם תאים עליהן.אך למה הם באמת מצטברים? ובכן, הם מצטברים לפרופיל לכידת תאים, שבמקרה זה נוכל להושיג כאשר בציר X נסמן את המרחק מהכניסה ובציר Y נסמן את דיסק לכידת התאים. וניתן לראות שלאורך המכשיר, אתם יודעים, הצפיפות שלכם היא גבוהה ביותר בתחילה ואז פוחתת באיטיות, וזה מה שהיינו מצפים לו מכיוון שאנו לוכדים תאים חיוביים ל-C4 וחיוביים ל-C3 מזרם הדם, ויהיה ריכוז פוחת של תאים אלו בדגימת הדם.וכך מוצגים בדרך כלל הנתונים שלנו.

cd4-t-lymphocyte-capture-using-a-disposable-microfluidic-chip-for-hiv

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תא לכידת באמצעות מכשיר microfluidic

ניסוי זה הוא מדריך חזותי עבור ניצול שיבוט מולקולרי פלואורסצנטי של HIV עבור לחיות ניסויים הדמיה confocal.

חזותי Cell ל-תא העברה של HIV באמצעות המשובטים פלורסנט של HIV מיקרוסקופיה confocal חיים

פיתחנו וקטור lentiviral שיש לה, בנוסף LTR תאת מגיב, את אלמנט Rev-תגובה (RRE) כי ניתן לווסת את ביטוי הגן הכתב בצורה HIV-1 ו-תאת Rev-מותנה. וקטור מאפשר את זיהוי ספציפי של שכפול HIV בתאים חיים באמצעות ביטוי ה-GFP.

סימון ספציפיות של HIV-1 תאים חיוביים באמצעות וקטור Rev-מותנה lentiviral מבטא את חלבון פלואורסצנטי ירוק

שבב microfluidic תרמופלסטיים משולב פותח לשימוש כאבחון מולקולרי. השבב מבצע חילוץ חומצות גרעין, transcriptase ההפוכה, וה-PCR. שיטות לבודה והפעלת השבב מתוארות.

ייצור שבבים microfluidic ושיטה לגילוי שפעת

במאמר זה אנו מציגים שבב microfluidic לניתוח תא בודד. זה מאפשר כימות של חלבונים תאיים, אנזימים, cofactors, ושליחים שני באמצעות מבחני או immunoassays ניאון.

שבב microfluidic לניתוח הכימי תכליתי של תאים בודדים

תיאר מתודולוגיה quantitate את הביטוי של גנים 96, 18 פני שטח חלבונים על ידי תאים בודדים לשעבר vivo, המאפשרות הזיהוי באופן שונה באה לידי ביטוי גנים, חלבונים בתאים הנגועים בנגיף ביחס תאים נגוע. אנו מיישמים את הגישה ללימוד CD4 הנגועים סיב+ T תאים מבודד קופי מקוק רזוס.

תא בודד כימות של mRNA וביטוי חלבונים השטח ב- CD4 הנגועים בנגיף+ T תאים מבודדים מן קופי מקוק רזוס

אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא לדווח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה יכול לשמש כדי לבדוק את מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא.

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

מוצג כאן פרוטוקול לגישת הדמיה פלואורסצנטית, multiplex immunofluorescent c ell-based detection של DNA, RNA, ו- protein (MICDDRP), שיטה המסוגלת להדמיה פלואורסצנטית סימולטנית חד-תאית של חלבונים נגיפיים וחומצות גרעין מסוג וגדילה שונים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות.

הדמיה פלואורסצנטית מרובת תאים בודדים כדי לדמיין חומצות גרעין וחלבונים ויראליים ולפקח על HIV, HTLV, HBV, HCV, נגיף זיקה וזיהום שפעת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שבו תאים בודדים מנוטרים לאירועים חריפים וזיהום HIV-1 פרודוקטיבי במכשיר ננופלואידי. נתוני דימות מגדירים אינטראקציות של קולטן מארח וירוסים ודינמיקה של מסלולי איתות. זוהי השיטה הראשונה עבור תרבות תא יחיד אורך תפוקה גבוהה ננופלואידית והדמיה ללמוד קינטיקה איתות ואינטראקציות מולקולריות.

אפיון תא יחיד של זרם סידן וזיהום HIV-1 באמצעות פלטפורמה אופטופלוידית רב-מפרקית

השבב המיקרופלואידי הקליני הוא טכניקת ניתוח ביו-רפואית חשובה המפשטת עיבוד מקדים של דגימות דם קליניות של מטופלים ומכתימה באופן אימונופלואורסצנטי תאי גידול במחזור הדם (CTCs) באתרם על השבב, ומאפשרת זיהוי וזיהוי מהירים של CTC יחיד.

פלטפורמת שבבים מיקרופלואידית קלינית לבידוד תאי גידול רב-תכליתיים במחזור הדם

תאי גידול במחזור (CTC) הם קריטיים לחקר התקדמות הסרטן והגרורות. מאמר זה מציג פרוטוקול משולב בעל תפוקה גבוהה להעשרת CTC וריצוף CTC יחיד, המשפר את יעילות הלכידה וטוהר ה-CTC תוך הפחתת עלויות הזיהום והריצוף, ובכך מקדם מחקר אונקולוגי מדויק ויישומים קליניים.

טכנולוגיית מיון תאי גידול במחזור וריצוף תאים בודדים מבוססת מיקרופלואידיקה

למד ללכוד לימפוציטי T עוזרים חיוביים ל-CD4 מדגימות דם באמצעות מכשיר מיקרו-נוזלי מבוסס PDMS. שיטה זו מאפשרת ניתוח תאים מדויק בסביבות עם משאבים מוגבלים למחקר אימונולוגי ואבחון HIV.

CD4 + T-לימפוציטים לכידת באמצעות שבב Microfluidic פנויה ל-HIV

גלה סרטונים נוספים