CD4 + T-לימפוציטים לכידת באמצעות שבב Microfluidic פנויה ל-HIV
1 באוקטובר 2007
היי, שמי ריצ'רד לין ואני חוקר כאן בקבוצה של פרופסור TI Mercy בחטיבה למדעי הבריאות והטכנולוגיה של MIT בהרווארד. הפרויקט שאני עובד עליו הוא לכמת וללכוד לימפוציטים מסוג T חיוביים CD 4 ו-C3 חיוביים. בדם המטופל יש להשתמש במסגרות מוגבלות במשאבים.
אז ממש מולי כאן יש לנו מכשיר מיקרופיל שמורכב מ-PDMS, שהוא פולימתיל סלואן. המכשיר, הערוץ עצמו, הגבוה הוא 50 מיקרומטר והנפח הכולל במכשיר הוא 10 מיקרוליטר. אז זהו מכשיר מדויק ביותר שבו נשתמש כדי ללכוד לימפוציטים מסייעים מסוג T.
בעיקרון, אמת המידה האבחנתית לחולי HIV. אז פני השטח של המכשיר המיקרו-נוזלי כבר הוכנו עם חלבון וארבעה נוגדנים חיוביים CD במזרק. כרגע יש לנו רק מאגר ביולוגי PBS ב-pH של 7.4 וכעת נזרים אותו לתעלה כדי לשטוף החוצה את הנוגדן החיובי הנוסף CD 4.
בשלב זה, אין צורך לשלוט בתעריף כי אנחנו רק מנסים לשטוף את הדברים העודפים וזה לא ממש משנה מה התעריף שלנו. זה, זה המקום שבו הכניסות של המכשיר הולכות להיות ואלה הולכות להיות השקעים שלנו, משמאלי ומימינכם כאן. אז עכשיו אני אשטוף את תמיסת הנוגדנים הנוספת ואם אתה יכול להבחין מהשקע שיש לך נוזל שיוצא החוצה, אתה יודע שזו כמות זעירה מאוד, אבל אם אתה מסתכל מקרוב אתה יכול לראות שאתה נוזל אוויר שיוצא מהתעלה דרך הצינור.
אז עכשיו, לאחר ששטפנו את תמיסת הנוגדנים הנוספת, אנחנו יכולים עכשיו להכין את עצמנו לזרימה בהזרקת הדם. אז עכשיו אנתק את הצינור מהכניסה. אז עכשיו נפתח מזרק חדש לדם, דם אנושי, דם מלא.
אז זו לא דגימה של מטופל, זו דגימה בריאה, דגימה בריאה בזמן שאנחנו מכינים את עצמנו להזריק דם למכשיר המיקרופלואידי. אז נחבר את המזרק למשאבת המזרק. עכשיו נפעיל ותוכלו לראות את קצב הזרימה של המזרק והגדרנו אותו לחמישה מיקרוליטר לדקה.
ועכשיו אנחנו בעצם נכין את עצמנו להזריק דם. נמקם את משאבת המזרק בצורה אנכית מכיוון שכפי שאנו יודעים, תאי הדם עושים משקעים ואנחנו נרצה שהתאים יזרמו לתעלה. אז עדיף שמשקעי התאים יהיו לקרקעית, שנמצאת ממש ליד הצינורות שלנו.
אז עכשיו הכל מוכן לפעולה. נפח המכשיר שלי הוא 10 מיקרוליטר ל-10 מיקרוליטר. והנפח שאנחנו רוצים להזרים לקיר התעלה הוא גם 10 מיקרוליטר.
אז אני יכול לדעת אם אני זורם מספיק דם רק על ידי הסתכלות על צבע התעלה, אם הכל אדום מלא, אז יודע שאני זורם ב-10 מיקרוליטר ואני צריך לעצור את פגוש המזרק. אז עכשיו אני לוחץ על כפתור התחלה וזה יתחיל לפעמים, לפעמים לוקח זמן עד שהדם באמת נכנס לתעלה. וזה הרבה בגלל הלחץ.
לדוגמה, כשאנחנו שמים את המזרק שם, לפעמים היינו מושכים או מזריקים את הנוזל בהתאם כדי להתאים את הדם בצינורית. אז זה יכול להיות משהו, זה יכול לקחת זמן, אבל ברגע שהוא מתחיל לשאוב לתוך ערוץ, קצב הזרימה נקבע על ly לדקה, וזה מה שאנחנו רוצים. אז אנחנו יכולים להיות קצת סבלניים כאן ולחכות, לפעמים צריך לחכות בערך שתי דקות, שלוש דקות לפני שהדם מתחיל לזרום.
למעשה אתם יכולים לראות ממש עכשיו שהדם מתחיל לזרום בערוץ. אז אתה יכול לדעת כרגע שהמכשיר התמלא כמעט לחלוטין. אוקיי, אז עכשיו נעביר את הצינור בחזרה ל-PBS כדי לשטוף החוצה את הדם שנמצא בתעלה.
ולשם כך נחזור על מה שכבר עשינו כדי להסיר את הצינור. מכיוון שאנו עדיין צריכים לשלוט בקצב זרימת ה- PBS, אנו עדיין זקוקים למשאבת המזרק. עם זאת, מכיוון שאיננו מזרימים דם יותר, איננו צריכים להשאיר את משאבת המזרק במצב אנכי מכיוון שאין תאים ב-PBS.
אז עכשיו אנחנו מוכנים ועכשיו נשטוף את הדם מהמכשיר ואני אלחץ שוב על הכפתור החד ממש כאן. אז כפי שאתה יכול לראות, המכשיר מתחיל להתנקות. הקצוות עדיין מעט דם, אבל הוא נעלם לאט.
אז ברגע שכל הדם ייעלם, נגדיל את הקצב מחמישה מיקרוליטר לדקה ל-20 מיקרוליטר לדקה. והסיבה לשינוי זה היא מכיוון שבדם ישנם למעשה שני סוגי תאים שיש להם ארבעה אנטיגנים חיוביים C. אחד מהם הוא מה שחיפשנו, לימפוציטים מסייעי T.
השני הוא מה שאנו מכנים מונוציטים. אנו רוצים לוודא שהמכשיר שלנו לוכד באופן ספציפי רק את הלימפוציטים המסייעים T ולא את שני הלימפוציטים המסייעים T והמונוציטים. והשיטה שאנו עושים זאת היא להגדיל את קצב הזרימה מכיוון שאנו יודעים שמונוציטים גדולים יותר בגודלם מתאי T מסייעים.
לכן על ידי הגדלת קצב הזרימה, המונוציטים הגדולים יותר יחוו לחץ רב יותר לעזוב את פני השטח מאשר תאי ה-T החיוביים של CD. אז עכשיו זה בערך 20 דקות. אז ביד שלי כרגע זה פתרון.
זה נקרא פתרון רישוי פקס. המטרה של זה היא לשים כדוריות דם אדומות. אז בכל מקום שבו כדוריות דם אדומות נשארות בערוץ, הפתרון הזה ישכב אותו.
זה מדולל 10, 10 פעמים מתמיסת המלאי. אז עכשיו מה שאנחנו הולכים לעשות זה לעצור את משאבת המזרק, להסיר את הצינור, ובעצם להחליף את התמיסה בזו מהמזרק הזה. אז עכשיו אני עוצר את המכונה, מסיר את הצינור, מוריד את זה, לוקח את זה עם המזרק הזה, מחליף אותו בחדש.
אוקיי, אז עכשיו כשהכל מוכן, נוריד את הקצב בחזרה לחמישה מיקרוליטר לדקה. אז נלחץ על הקצב מ-20, נוריד את זה לחמש ועכשיו נזרום בפתרון רישיון הפקס למשך 20 דקות. ועכשיו נלחץ על התחל.
אז לפנינו כרגע תמונה אופטית של המכשיר שצולמה בהגדלה של פי 10. אז אתם יכולים להבחין בכל הנקודות הלבנות האלה כאן בעצמנו. אז איך אנחנו יכולים לוודא שהתאים האלה הם אלה שאנחנו מחפשים?
לכן אנו משתמשים בכמה כתמים שונים כדי לוודא שהכתם הראשון שאנו משתמשים בו הוא מה שאנו מכנים dpi, כל זה, הוא מכתים בכתמי DPI בגרעין. אז בעצם כל תא עם גרעין כמו בעוד שתאי דם לבנים עם כל הכתמים בעוד נניח תאי הדם האדומים שאין להם גרעין לא יהיו מוכתמים ואתה יכול לדעת שזה בכל התמונה. כל הנקודות הכחולות האלה וכל אחת מהן כחולה.
הוא תא. אז עכשיו השלב הבא הוא לבדוק אם לתאים יש את מה שאנו מכנים האנטיגן החיובי C 4. זה חשוב ביותר מכיוון שכל המטרה של המכשיר שלנו היא ללכוד C ארבעה תאים חיוביים.
אז בשלב הבא, הנוגדן הפלואורסצנטי שבו אנו משתמשים הוא כמובן ספציפי ל-C 4. ועבור לשקופית הבאה. אז בתמונה הזו, התאים יוצאים הרבה יותר עמומים בגלל שהנוגדן הפלואורסצנטי שאנו משתמשים בו הוא בדרך כלל לעובדות.
אז הדילול הרבה יותר גבוה. אבל אם תסתכלו די מקרוב, עדיין תוכלו לראות שעדיין יש נקודות שמלכלכות סביב תצוגת השדה הזו. הם עמומים למדי.
אבל בבחינה מדוקדקת יותר אנו יכולים לומר שהתאים האלה נמצאים ב-DC לחיובי, וזה טוב כי זה בדיוק מה שאנחנו רוצים. והמבחן הבא הוא, כפי שציינתי קודם, ישנם שני סוגים שונים של תאי C ארבעה חיוביים. האחד הם אלה שאנו רוצים את תאי ה-T המסייעים והשני הם מה שאנו מכנים מונוציטים.
לכן אנו זקוקים שוב לנוגדנים פלואורסצנטיים נוספים כדי להבדיל בין שני התאים. אז אנחנו יודעים שבלימפוציטים מסייעים מסוג T יש להם מה שאנו מכנים CD שלושה אנטיגנים חיוביים. בעוד שעבור מונוציטים הם לא.
אז הנוגדן הבא שאנו משתמשים בו הוא ספציפי ל-CD 3, אותו נראה בתמונה זו. אז שוב, אתה יכול לדעת שהנקודות שלהם מלכלכות סביב המכשיר, הן, הנקודות נראות גדולות יותר כי לפעמים חלק מהתאים פשוט זוהרים יותר, חלק לא. אני מתכוון לזה, הרבה דברים הם במקרה הזה, אבל ברוב המקרים, הנקודות האלה בנקודות אדומות בהירות הן כולן תאים.
אז אנחנו פשוט, שוב, מה שאנחנו רוצים, כי ראשית, לוודא שהתאים שלנו הם CD 4 חיובי ו-CD 3 חיובי. אז במקרה הזה אתה יכול להגיד שהרבה מהתאים שלנו הם ב-d CD 3 חיובי, וזה טוב. זה נותן לנו ספציפיות בלכידה שלנו.
זה יכול להיות זבל, אבל הרבה פעמים מה שקורה הוא שלפעמים תא פשוט אסף עוד דיסק שלוש שטיפות ושלושה על עצמו. אז בתמונה הזו, זה אחד הנתונים שאספנו עבור מכשיר המיקרו-נוזל הזה והוא בעצם מקצוען לכידת תאים. אז בתמונה הקודמת, אתם יודעים, שקופיות, מה לא, אתם יכולים לראות שהיו הרבה, אתם יודעים, תמונות עם תאים עליהן.
אבל למה הם באמת מצטברים? ובכן, הם מצטברים לפרופיל לכידת תאים, ובמקרה זה אנו יכולים להתוות בציר X יש לנו את המרחק מהכניסה וציר ה- Y יש לנו את דיסק תא הלכידה. ואתם יכולים לדעת שלאורך כל המכשיר, אתם יודעים, הצפיפות שלכם בהתחלה גבוהה מאוד ואז לאט לאט יורדת, וזה מה שהיינו מצפים כי אנחנו לוכדים את תאי C 4 חיוביים ו-3 po, C3 חיוביים מזרם הדם והם יורדים בריכוז התאים האלה בדגימת הדם.
וכך בעצם מוצגים הנתונים שלנו בדרך כלל.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בכימות ובלכידה של לימפוציטים T חיוביים ל-CD4 וחיוביים ל-C3 מדם של מטופלים באמצעות מכשיר microfill. המכשיר תוכנן לשימוש בסביבות עם משאבים מוגבלים, ומדגים את הדיוק והיעילות שלו בלכידת לימפוציטים T מסייעים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- הנדסה ביו-רפואית
רקע
- לימפוציטים T חיוביים ל-CD4 ממלאים תפקיד מכריע בתגובה החיסונית.
- בסביבות עם משאבים מוגבלים חסר לעיתים קרובות ציוד מתקדם לניתוח תאים.
- התקנים מיקרופלואידיים יכולים לשפר את דיוק לכידת התאים.
- הבנת אוכלוסיות של תאי T חיונית ליישומים רפואיים מגוונים.
מטרת המחקר
- פיתוח התקן מיקרו-מילוי (microfill) ללכידת אוכלוסיות ספציפיות של לימפוציטים T.
- מתן אפשרות לניתוח יעיל של תאי T בסביבות מאתגרות.
- שיפור הנגישות לכלי מחקר אימונולוגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון וייצור של התקן מיקרופלואידי מבוסס PDMS.
- אפיון של ממדי התעלות ונפח ההתקן.
- יישום של ההתקן ללכידה של לימפוציטים T חיוביים ל-CD4 ו-C3.
- בחינת ביצועי ההתקן בתנאים המדמים מחסור במשאבים.
תוצאות עיקריות
- התקן המיקרו-מיל (microfill) לכד תאי לימפוציטים מסוג T helper בהצלחה.
- מימדי ההתקן עברו אופטימיזציה ללכידה יעילה של תאים.
- הוכשר פוטנציאל לשימוש בסביבות עם משאבים מוגבלים.
- התוצאות מעידות על דיוק גבוה בכימות הלימפוציטים.
מסקנות
- המכשיר המיקרופלואידי שפותח הוא כלי מבטיח למחקר אימונולוגי.
- הוא נותן מענה לצורך בשיטות נגישות לניתוח תאים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב להגדרות קליניות ומחקריות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
גישה מיקרופלואידית זו מאפשרת כימות ולכידה מדויקים של לימפוציטים T מסוג +CD4 מדם מלא, ובכך היא נותנת מענה לצורך קריטי בניטור חיסוני נגיש בסביבות בעלות משאבים מוגבלים. באמצעות שילוב של לכידה באמצעות נוגדנים ספציפיים עם הבחנה מבוססת זרימה בין סוגי תאים, השיטה תומכת בתיקוף מטרות בשלב מוקדם ובהערכת סמנים ביולוגיים במחקר על HIV. פשטות הפלטפורמה והדרישות לנפח דגימה נמוך מגבירות את הפוטנציאל שלה לפריסה בתהליכי עבודה של אבחון מבוזר.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של ביטוי משותף של CD4+ ו-CD3+ כדי לתקף את הספציפיות של לימפוציטים מסייעי T בפרופיל חיסוני.
- ערך תפעולי: משתמש בשבב PDMS חד-פעמי עם ממדי תעלות מוגדרים (גובה 50 µm, נפח 10 µL) ללכידה רפרודוקטיבית של תאים ללא זיהום צולב.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מקל על הכנת לימפוציטים שנלכדו לצורך צביעה והדמיה בהמשך, מה שמאפשר קריאות סטנדרטיות של ביטוי סממנים על פני השטח.
- ערך תפעולי: תומך בהחלפת ריאגנטים סדרתית (שטיפת נוגדנים, פרפוזיה של דם מלא, שטיפה ב-PBS, ליזיס של RBC) באמצעות בקרת משאבת מזרקים, מה שמאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה בין מפעילים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר הבחנה בין מונוציטים לתאי T מסייעים (T helper lymphocytes) על בסיס שימור תלוי-גודל תחת זרימה מוגברת (20 µL/min), ובכך משפר את הספציפיות של אוכלוסיות התאים שנלכדו.
- ערך תפעולי: מייצר פרופילי לכידה מרחביים כמותיים (מרחק מהכניסה לעומת צפיפות תאים) המתואמים עם ריכוז התאים בבסיס, ובכך תומך בכיול הבדיקה ובניטור לאורך זמן.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, שבהם פנוטיפ של תאי חיסון מספק מידע על מעורבות המטרה ומנגנון הפעולה, ובמיוחד בתוכניות לפיתוח חיסונים או תרופות אימונומודולטוריות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות בנוגע לתדירויות תתי-אוכלוסיות של CD4+ ומצבים פונקציונליים בדגימות דם ללא צורך בפרקציונציה מורכבת.
- סריקה: מספקת לכידה סטנדרטית ו可שחזרת של לימפוציטים מטרה, התומכת במוכנות של הבדיקה לקמפיינים של סריקת נוגדנים או מולקולות קטנות.
- אנליזה: מספקת נתוני התפלגות מרחבית כמותיים ותיקוף של סמן כפול (CD4+/CD3+) להשוואה בין תנאים או תורמים.
- מחקר תרגומי: תומכת ברציפות מלכידה ex vivo ועד לאפיון פנוטיפי, דבר הרלוונטי לתיקוף ביומרקרים במודלים של מחלות זיהומיות.
- שימוש חוזר ארגוני: תכנון השב disposable והתאימות למשאבת מזריק מאפשרים שימוש חוזר בפלטפורמה במגוון מחקרים עם מינימום תיקוף מחדש.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בבידוד תאי חיסון על ידי מתן אפשרות ללכידה ספציפית ואישור פנוטיפי של לימפוציטים מסוג T helper CD4+ .
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות נפחי נוזלים סטנדרטיים, קצבי זרימה מבוקרים (5 µL/min ללכידה, 20 µL/min להדרה של מונוציטים), ושלבי שטיפה/ליזיס מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go בתיקוף מטרות (target validation) על ידי אספקת נתונים כמותיים ואמינים של תאי חיסון מדגימות שעברו עיבוד מינימלי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים לאימונומודולציה בהתבסס על מדדי מעורבות מטרה (target engagement) הדירים בתאי אדם ראשוניים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול במיקרופלואידיקה, צביעה פלורסצנטית ומיקרוסקופיה לצורך זיהוי וכמות תאים מדויקים.
- תלוי בגישה למשאבות מזרקים, צינורות ומיקרוסקופיה פלורסצנטית לצורך ההקמה והקריאה.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי ציפוי נוגדנים, חסימה וצביעה בין המשתמשים השונים כדי להבטיח יעילות לכידה עקבית.
- יש להתחשב בשונות של דגימות דם ראשוניות (למשל, hematocrit, ספירת לוקוציטים) בעת פירוש יעילות הלכידה והפרופילים המרחביים.
- מגבלות מעשיות כוללות סיכון לסתימה של המכשיר בעת שימוש בדם מלא ותלות בטכניקה של המפעיל להנחלת זרימה אופטימלית ומניעת בועות.
