מיקרו-הזרקה סטריאוטקטית של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית בסטריאטום גור עכבר

קחו גור עכבר מהונדס גנטית הנושא קלטת STOP עם אגף loxP החוסמת חלבון פלואורסצנטי אדום או ביטוי RFP.

אבטח את הגור על מסגרת סטריאוטקסית בהתאמה אישית וכסה אותו בקרח כדי לשמור על הרדמה.

יש לחטא את הקרקפת ולסמן את הלמבדה כנקודת הייחוס.

יישר את מחט ההזרקה לקואורדינטות סטריאטליות ביחס ללמבדה וניקב את הגולגולת.

משוך את המחט למשטח הגולגולת, ולאחר מכן הכנס אותה לעומק המטרה.

הזרקת הווקטור הנגיפי המעורבב בצבע לסטריאטום בקצב מבוקר. הווקטור מקודד חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים או GFPs ו-Cre recombinase.

משוך את המחט לאט כדי למנוע זרימה חוזרת של התמיסה.

הסר את הגור ואפשר התאוששות.

בתאים סטריאטליים, הנגיף משחרר את הגנום שלו, ומאפשר ביטוי של Cre recombinase ו-GFP. Cre מסיר את קלטת ה-STOP המוקפת ב-loxP, ומפעיל ביטוי RFP.

ביטוי GFP ו-RFP בו זמנית מאשר מניפולציה מוצלחת של גנים.

מקם את הגור עם הכפפה במגש הראש והניח מעט קרח כתוש סביב שרוול הלטקס כדי לשמור על הרדמת ההיפותרמיה. לאחר מכן שפשפו את ראש הגור ב-70% אתנול ואתרו את נקודת הציון של הלמבדה. סמן אותו בטוש. לאחר מכן כוון את קצה המחט אל הלמבדה והגדר את הקואורדינטות הרוחביות הקדמיות, האחוריות והמדיאליות לאפס.

לאחר מכן, בהתייעצות עם אטלס מוח, העבר את זרוע ההזרקה לאתר המטרה. לדוגמה, הסטריאטום של גורי P2 הוא 2.4 מילימטרים קדמיים ללמבדה, 1.0 מילימטרים משני צידי קו האמצע ו-1.7 מילימטרים גחוניים. לאחר מכן, סמן את מיקום הצבע הירוק המהיר על צינור PE10 באמצעות עט. לאחר מכן התחל לאט לאט לחדור למחט דרך העור והגולגולת עד שקצה המחט נוגע במשטח הגולגולת.

הגדר את קואורדינטת הגחון הגבי כאפס. לאחר מכן הורד את המחט לאט לאתר היעד. לאחר המיקום, המתן דקה אחת כדי לאפשר לפרנכימה לחזור לצורתה הרגילה. לאחר מכן הפעל את תוכנית המיקרו-הזרקה במהירות של 100 ננוליטר לדקה. במהלך ההזרקה, צפו בצבע הירוק המהיר נע בצינור ה-PE.

זה קריטי לחדור לאט למחט דרך העור והגולגולת עד שקצה המחט נוגע במשטח הגולגולת. במהלך ההזרקה, חובה לצפות בצבע הירוק המהיר נע בצינור ה-PE.

לאחר השלמת ההזרקה, המתן דקה אחת ולאחר מכן העלה לאט את המחט למחצית מעומק ה-DV שחדר. לאחר מכן המתן עוד 30 שניות לפני שתמשיך במשיכה האיטית של המחט מראשו של הגור.

לאחר השלמת ההזרקה, חשוב להמתין דקה אחת לפני העלאת המחט לאט למחצית מעומק ה-DV החודר, ולאחר מכן להמתין 30 שניות נוספות לפני הוצאת המחט לאט מראשו של הגור.

לאחר הזרקת כל האתרים הממוקדים, חממו את הגור למשך 20 דקות באינקובטור של 33 מעלות צלזיוס.

בדקו את הגור כל חמש דקות עד שהוא חזר לשכיבה על עצם החזה. לאחר מכן החזירו את הגור לסכר שלו.