העברת גנים תת-פיאליים בחוט השדרה של העכבר כדי להעריך את ביטוי הגנים

קח עכבר מורדם, גלח את גבו וחטא את העור.

חתכו את העור, נתקו את השרירים מהחוליות ומשכו אותם באמצעות מלחציים.

קדחו לתוך הלמינה החולייתית כדי ליצור סדקים, ואז הסירו את שברי העצם כדי לחשוף את הדורה מאטר, קרום חוט השדרה החיצוני.

בעזרת מחט, צור פתח דוראלי ונקב את ה-pia mater הבסיסי כדי להיכנס לחלל התת-קרקעי לגישה ישירה לרקמת עמוד השדרה.

קח מחט אספקה המכילה תרחיף של נגיף אדנו-רקומביננטי הנושא גן המבטא חלבון פלואורסצנטי והזריק את התרחיף.

משוך את המחט, תפר את השרירים והעור ואפשר לעכבר להתאושש.

הנגיף נקשר לקולטנים על תאי עצב ותאי גליה ועובר אנדוציטוזה.

ברגע שנכנס לגרעין, הנגיף מעורר ביטוי גנים לייצור חלבונים פלואורסצנטיים.

מודל העברת הגנים התת-קרקעיים מוכן כעת להעריך את ביטוי גן המטרה בחוט השדרה.

התחל בהרדמה נכונה של בעל החיים לניתוח. משתמשים כאן באיזופלורן. ודא היעדר תגובת צביטה בכפות לפני שתמשיך. לאחר מכן כסו את העיניים במשחה עיניים. לאחר מכן, יש לגלח את גב החיה בעזרת קוצץ, ולנקות את העור עם 2% כלורהקסידין.

אם יש לבצע הזרקות תת-פיאליות מותניות, חתוך את העור המכסה את חוליות T8 עד L1 בעזרת אזמל. ואז השתמש במספריים כדי לנתק את השריר הפרה-חולייתי מחוליות עמוד השדרה T10 ל-T12. הרכיבו את החיה למסגרת סטריאוטקסית סטנדרטית באמצעות מהדקי עמוד השדרה של העכבר. לאחר מכן, השתמש במקדחה דנטלית כדי לגלח את שני צידי הלמינה של חוליות T10 עד T12 עד להופעת סדקים.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להסיר שברי עצם סדוקים ולחשוף את פני השטח הגביים של חוט השדרה המותני. הדורה נראית עכשיו. השתמש במחט נירוסטה בגודל 30 כדי לבצע חתך של 1 עד 2 מילימטר לתוך הדורה.

חשוב לחתוך בזהירות את הדורה כדי למנוע פגיעה בקרום הפיה הבסיסי.

כעת, אחזו בקצה הדורה החתוכה בעזרת מלקחיים והאריכו את פתח הדורה עד 5 מילימטרים. התקן את המחט החודרת 34 pia ומחט ההזרקה 36 על זרועות ה-Z של שני מניפולטורים נפרדים XYZ באמצעות מחזיקי נימי זכוכית.

לאחר מכן, השתמש במזרק מיקרו של 50 מיקרוליטר המחובר לצינורות PE-10 או PE-20 כדי לטעון את נגיף AAV9-UBI-GFP. לאחר טעינת הנגיף, חבר את קצה הצינור למחט ההזרקה. לאחר מכן, תוך כדי התבוננות בטווח ניתוח כירורגי המוגדר להגדלה של פי 8 עד 10, השתמש בזרוע ה-X כדי להוריד את המחט החודרת לתוך הפיה לעומק של מילימטר אחד. שמור על זווית המחט החודרת על 5 עד 10 מעלות, ביחס למשטח הרקמה.

לאחר פתיחת הפיה, השתמש בזרוע ה-X כדי להסיר את המחט החודרת לפיה מהחלל התת-פיאלי. שימו לב לאתר שחדרו באמצעות ציון דרך, כגון כלי דם. הזז את זרועות X, Y ו-Z של המניפולטור השני כדי למקם את קצה מחט ההזרקה הטעונה בנגיף AAV9 לתוך האתר שחדר ל-pia.

לאחר מכן, לאחר הכנסת קצה מחט ההזרקה כ-0.5 מילימטרים לתוך החלל התת-פיאלי, השתמש בזרוע Z כדי להרים את הפיה כ-0.3 מילימטרים, ולאחר מכן השתמש בזרוע X כדי להמשיך לקדם את המחט אופקית לתוך החלל התת-פיאלי. מקדמים את המחט עד שהיא נכנסת לחלל התת-קרקעי בעומק של כ-2 עד 3 מילימטרים.

לאחר מכן, השתמש במזרק המיקרו של 50 מיקרוליטר כדי להזריק את נגיף AAV9-UBI-GFP לחלל התת-קרקעי. הסר את מחט ההזרקה מהחלל התת-קרקעי לאחר השלמת הזרקת AAV9-UBI-GFP. סגור את השריר והעור באמצעות תפר מונופילמנט פלואורו וקליפסים כירורגיים. אפשר לבעל החיים להתאושש על כרית חימום לפני שיכון בכלוב נקי.