לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לסמן באופן פלואורסצנטי את נגיף הדנגי לצורך מחקרים מיקרוסקופיים. הכינו את התמיסות (Buffers) הדרושות וטהרו את נגיף הדנגי באמצעות כרית סוכרוז, ולאחר מכן המיסו מחדש את צבע ה-Amy React Alexa flow ואת נגיף הדנגי בתוך תמיסת סימון. סמנו את נגיף הדנגי באמצעות 100 µM של Alexa flow.

הדגירה תימשך שעה אחת, ולאחריה יש לעצור את תגובת הסימון באמצעות ריאגנט העצירה. יש לטהר את נגיף הדנגי המסומן באמצעות עמודת הפרדה לפי גודל (size exclusion column). יש לבצע תיסירציה מחדש של הנגיף המסומן באמצעות בדיקת פלאקים (plaque assay) ולהעריך את דרגת הסימון באמצעות בדיקת אימונופלואורסצנציה.

שלום, אני סם ג'אנג ממעבדות ה-DSO National Laboratories, העובד במעבדתו של ד"ר Wee בתוכנית למחלות זיהומיות מתהפעות לאחר לימודי רפואה ב-NUS. היום אראה לכם כיצד לסמן פלואורסצנטית את נגיף ה-Denki באמצעות צבע Alexa flu רגיב לאמי לצורך מחקרי דימות. לצבעי Alexa flu יש יציבות מעולה והם פחות רגישים ל-pH מאשר צבעים נפוצים כגון fluorescein ו-rhodamine, מה שהופך אותם לאידיאליים למחקרים על קליטה תאית וטרנספורט אנדוזומלי של הנגיף.

סימון נגיף הדנגי ב-Alexa fluor יסייע להבנת הפתוגנזה של הדנגי. אז בואו נתחיל. לפני תגובת הסימון, הכינו תמיסת סימון (labeling buffer) וריאגנט עצירה טריים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, וטהרו את נגיף הדנגי באמצעות כרית סוכרוז; הוסיפו נפח מתאים של נגיף הדנגי המטוהר לתמיסת הסימון באنبוב מיקרו-צנטריפוגה כדי להגיע לריכוז של 300 million forming units per milliliter.

ניתן להגדיל את הכמויות באופן יחסי. עבור סימון של מנת וירוס, יש להמיס את צבע ה-Alexa הליופיליזד לריכוז של 1 mM בבפר סימון רגע לפני תגובת הסימון.

יש לצמצם את החשיפה לאור מהשלב הזה והלאה. לצורכי הדגמה, צבע הזרימה Alexa יישאר ללא הגנה מפני אור. יש להוסיף 800 µL של צבע הזרימה Alexa בריכוז 1 mM לוירוס הדנגי המדולל, תוך כדי ערבוב עדין בעזרת קצה של מיקרופיפט.

דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, בהגנה מפני אור, תוך ערבוב באמצעות היפוכים עדינים בכל 15 דקות. לאחר שעה אחת, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה למשך זמן קצר. העבירו 800 microliter מהתת-אזור תוך כדי ערבוב עדין באמצעות מיקרופיפטה, ודגרו למשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר, בהגנה מפני אור, תוך ערבוב באמצעות היפוכים עדינים בכל 15 דקות.

בינתיים, יש לשטוף את עמודת הניקוי עם 25 milliliters של באפר HNE. לאחר דגירה של שעה אחת, יש להעביר את הווירוס המסומן לעמודה ולהתחיל באיסוף של השטף (flow through). מלאו את העמודה בבאפר HNE.

לאחר שכל הנגיף המסומן נכנס למטריצה, השליכו את 2.5 המיליליטרים הראשונים של התוצר שעבר דרך המטריצה (flow through) ואספו את שני המיליליטרים הבאים של פראקציית הנגיף המסומן. הקפיאו ושמרו את הנגיף המסומן והמזוקק בטמפרטורה של Minus 80 degrees Celsius. קבעו את התיתר של הנגיף המסומן באמצעות plaque assay.

בניסוי טיפוסי, יש לצפות לירידה של פחות מעשרה שערים (tenfold) בתר titer של הנגיף. לאחר הסימון, יש לבצע בדיקת אימונופלואורסצנציה כדי להעריך את מידת הסימון. לצורך כך, יש לספור את התאים הנגיפים באמצעות המוציטומטר ולהוסיף נפח מתאים של תאים למצע גידול כדי להגיע לצפיפות של 50,000 תאים למילליליטר.

העבר מילליליטר אחד של תאי וירוס לכל באער בצלחת בעלת ארבעה באערים המכילה כיסוי זכוכית סטרילי. דגרי את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. הוצא את הצלחת מהאינקובטור ושאב את הנוזל העליון מכל באער, ולאחר מכן דגרי את התאים עם MOI של בערך 1 של הווירוס המסומן בנפח של 100 µL למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 °C.

הסר את האינוקולום ושטוף את התאים עם 0.5 milliliters של בופר PBS לכל באר. בצע את הפעולה הזו ושחזר אותה פעמיים נוספות. קבע את התאים באמצעות 200 microliters של 3%per for multi height לכל באר בטמפרטורת החדר למשך 30 Minutes.

שטפו את התאים שלוש פעמים עם 0.5 milliliters של בופר PBS לכל באר. בצעו פרמיליזציה לתאים באמצעות תמיסת פרמיליזציה בטמפרטורת החדר למשך 30 Minutes. הסירו את כיסוי הבאר באמצעות פינצטה עדינה.

נקזז נוזלים עודפים על ידי ניגוב קצה הזכוכית המכסה. החלק אותה על נייר סופג. הנח את צד התא של המכסה.

טפטפו 25 µL של נוגדן לחלבון e של דנגי על פיסת זכוכית. הדגירו למשך שעה אחת בתא לחות בטמפרטורת החדר, תוך הגנה מאור. לאחר מכן, העבירו את כיסוי הזכוכית לפלטת שש בארות והוסיפו 2 mL של בופר שטיפה לכל באר.

שאבו את הנוזל העליון. חזרו על שלבי שטיפה אלו פעמיים נוספות לאחר השטיפה האחרונה. הסירו את כיסוי הזכוכית מהבאר באמצעות פינצטה עדינה.

נקז את הנוזל העודף על ידי טבילת קצה כיסוי הזריקה. החלק אותו אל מול נייר סופג. הנח את צד התא של הכיסוי.

טפטפו 25 µL של נוגדן משני anti-mouse מסוג Alexa Fluor 488 על פיסת פראפמנט. דגרו למשך 45 דקות בתא לחות בטמפרטורת החדר, תוך הגנה מאור. לאחר סיום הדגירה, העבירו את כיסוי הזכוכית (coverslip) לפלטת 6 בארות ושטפו את התאים שלוש פעמים עם 2 mL של תמיסת שטיפה עבור כל שטיפה. לאחר השטיפה האחרונה, הוציאו את כיסוי הזכוכית מהבאר ושטפו פעם אחת במים דה-יוניזציה.

יש לסנן את עודפי הנוזל על ידי ספיגה בנייר. יש להדביק את זכוכית הכיסוי על גבי המשקף באמצעות 8 µL של תמיסת קיבוע עדינה. יש להניח לתמיסת הקיבוע להתייצב למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C.

הדגימה מוכנה כעת להדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי. הניחו טיפה קטנה של שמן טבילה (immersion oil) על פני הזכוכית המכסה והצמידו את הזכוכית להב המיקרוסקופ על במה המיקרוסקופ.

כווננו את הבמה עד שהעדשה של המיקרוסקופ תיכנס במגע עם שמן האימרסיה. לקבלת תמונה ברורה, כבו את התאורה הסביבתית באמצעות תוכנת Zes Zen. לחצו על לשונית ocular לצפייה ישירה בדגימה דרך העינית של המיקרוסקופ.

מצאו שדה ראייה עם תאים וכוונו את המיקוד. כעת עברו למצב רכישה. כדי למזער crosstalk בין הערוצים הפלואורסצנטיים, בחרו ערוצים נפרדים עבור Alexa Fluor 488 ו-Cy5.

התאם את הצבעים והגדרות הרכישה לעירור וגילוי עוקבים. כוון את הגבר (gain) ואת ההיסט (offset) של הספק הלייזר כדי להבטיח שהתמונה אינה חשופה מדי או חסרה בחשיפה. צלם את התמונה ונתח אזור עניין באמצעות פונקציית קולוקליזציה (colocalization).

ניתן להשתמש במקדם החפיפה כדי להעריך את דרגת הסימון של נגיף הדנגי באמצעות ה-Alexa Flo Dye. בוצע מבחן אימונופלואורסצנציה פשוט על תאי נגיף, וניתן להעריך את דרגת הסימון מתוך הקולוקליזציה של הנגיף המסומן עם נוגדן przeciw לחלבון e; מקדמי החפיפה של הצביעה בנוגדנים נעים בין 0.65 ל-0.8, מה שמעיד על כך שכ-65% עד 80% מהגרסאות סומנו ב-Alexa floor dye. כדי שהליך הסימון יצליח, חשוב להכין את בופר הסימון, להשתמש בריאגנטים טריים ולשחזר את ה-Alexa floor digest לפני הסימון.

ניתן לבצע אופטימיזציה נוספת של ריכוז הצבע כדי להתאימו לצרכיכם. שיטה זו של סימון אופקי של נגיף הדנגי עשויה להותאם לסימון נגיפים אחרים. וזהו זה.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוי הסימון שלכם.