Name: לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: למד שיטה לתיוג וירוס דנגה בפלואורסצנטיות באמצעות Alexa Fluor למחקר אינטראקציות וירוס-תא מארח. טכניקה זו מאפשרת הדמיה מיקרוסקופית של שלבי ההדבקה הראשוניים ומסייעת בפיתוח אסטרטגיות אנטי-ויראליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו כבר מומן על ידי המועצה הלאומית למחקר רפואי, סינגפור.

1. אלקסה פלואוריד תיוג של וירוס דנגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני התגובה תיוג, לטהר וירוס דנגה עם כרית סוכרוז ולהכין את הצורך ריאגנטים וציוד כמפורט בפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ביקרבונט טרי 0.2M נתרן חיץ, pH 8.5 (חיץ תיוג), ו 1.5M חיץ hydroxylamine, pH 8.3 (לעצור מגיב), ממש לפני תיוג לסנן לעקר עם מסנני מזרק 0.2μm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל כ 3x10 8 יחידות פלאק ויוצרים (pfu) של מטוהרים וירוס דנגה ב 1ml של תיוג חיץ בתוך שפופרת 2ml. זה יכול להיות scaled עד פרופורציונלי תיוג אצווה של הנגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש את lyophilized אלקסה פלואוריד 594 (AF594) אסטרים succinimidyl כדי 1mm ב תיוג חיץ מייד לפני התגובה תיוג. Fluorochromes אחרים של פלואוריד אלקסה לצבוע סדרת ניתן להשתמש בהתאם לצרכים של האדם. מזעור החשיפה לאור מכאן ואילך צעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100μl של צבע 1mm AF594 לנגיף בדילול תוך ערבוב בעדינות עם קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה תיוג לערבב בטמפרטורת החדר 1 שעות בחושך. מערבבים על ידי תנוחות הפוכות עדינות כל 15mins. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין בקצרה צינור בצנטריפוגה השולחן ולהוסיף 100μl של מגיב להפסיק לערבב את התגובה תוך ערבוב בעדינות עם קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה נוספת בחושך. מערבבים על ידי תנוחות הפוכות עדינות כל 15mins. </li></ol> 2. טיהור אלקסה פלואוריד שכותרתו וירוס דנגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, לאזן את העמודה טיהור עם המאגר של בחירה. בניסוי זה, טור PD-10 הוא equilibrated עם 25ml של חיץ HNE (Hepes 5mm, 150mm NaCl, 0.1mm EDTA), pH 7.4, לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את הנגיף שכותרתו לחלק העליון של הטור להתחיל לאסוף את הזרימה דרך אחת הנגיף שכותרתו נכנס מטריקס. מלאו את העמודה עם חיץ HNE כל פעם את הנגיף שכותרתו חתמה מטריקס. בטל 2.5ml הראשון של זרימה דרך לאסוף את 2ml הבא של שבריר וירוס הנקרא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot ולאחסן מטוהרים AF594 וירוס דנגה שכותרתו ב -80 ° C, הרחק ממקור אור. </li></ol><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי one aliquot ולקבוע את כייל של נגיף הנקרא על ידי assay פלאק לפני השימוש אצווה של וירוס הנקרא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים 5x10 4 ל Vero היטב של תאים, שגודלו בינוני M-199 גדילה, בצלחת 4-היטב עם coverslip על החלק התחתון של יום הרבה לפני זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant תרבות היטב להדביק תאים עם ריבוי הזיהום של 1 של הנגיף שכותרתו בנפח 100μl (בדילול מלא בינוני M-199 תחזוקה כנדרש) עבור 10min ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את inoculums ולשטוף coverslips פעמיים 1xPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים paraformalydehyde 3% עבור 30mins. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את coverslips 3 פעמים 1xPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize התאים עם פתרון permeabilization המכיל saponin 0.1% ו BSA 5% 1xPBS עבור 30mins. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם חי צנטריפוגה, הבהיר supernatant של 3H5 תרבות נוגדן חד שבטי hybridoma עבור 1 שעות בתא לח, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את coverslips 3 פעמים חיץ לשטוף (1xPBS המכיל כלוריד 1mm סידן, מגנזיום כלוריד 1mm saponin 0.1%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם הנוגדנים AF488 IgG נגד העכבר, 1:100 בדילול מלא בתמיסה permeabilization, עבור 45mins בתא לח, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את coverslips 3 פעמים חיץ לרחוץ ולשטוף במים deionized פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את קצה coverslip נגד מגבת נייר לניקוז המים העודפים על הר להחליק זכוכית עם Dabco 8μl 4-88 Mowiol 2.5% המכיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון הרכבה להגדיר לילה בשעה 4 ° C לפני צפייה באמצעות מיקרוסקופ confocal Zeiss. רכישות רצופות יש לבצע fluorophore מרגש אחד בכל פעם ומיתוג בין גלאי במקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות מנותחים ואז לוקליזציה משותף של חלבון מכתים נוגדנים E בווירוס שכותרתו באמצעות תוכנת LSM Zeiss זן כדי לאמוד את מידת תיוג. </li></ol> 3. נציג תוצאות דוגמה תשואה של וירוס דנגה שכותרתו עם צבע AF594 מוצג באיור 2. בדרך כלל, פחות ירידה של פי 10 מן titer הראשונית צריכה להיות שנצפו בעקבות תיוג מוצלח. עם זאת, יש לציין כי חוצצי כל צריך להיות מוכן טרי תיוג להצליח ואת פלואוריד אלקסה אסטרים succinimidyl יש להשתמש מיד לאחר הכינון מחדש כפי שהם hydrolyze לחומצות חינם nonreactive תמיסות מימיות 8. בשלב הבא, הווירוס שכותרתו יש להיבדק על הקרינה מספיק לפני השימוש בניסויים. Assay immunofluorescence פשוט נעשה על תאים Vero ומידת תיוג ניתן לאמוד מתוך לוקליזציה המשותפת של הנגיף שכותרתו עם אנטי מכתים E-נוגדן חלבון. לנתקאל התאים נבדקו תמונה confocal טיפוסי מוצגת באיור 3. Co-לוקליזציה ניתוח של תמונות באמצעות התוכנה זן LSM הפגינו חפיפה מקדמי החל 0.65-0.8, טוען כי כ -65 עד 80% של virions תויגו עם הצבע. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> תכנית איור המתאר את 1.Overall פלואוריד אלקסה תיוג צבען של ההליך וירוס דנגה. ראשית, מאגרים רלוונטיים וירוס דנגה מטוהרים מוכנים. פלואוריד הוא Alexa לצבוע מחדש והוסיף לנגיף דנגה מדולל תיוג חיץ. התגובה היא ונעצר 1 שעה מאוחר יותר עם תוספת של מגיב לעצור. לאחר מכן, הנגיף שכותרתו היא מטוהרים באמצעות עמודה הדרה גודל להסיר צבע חופשי. לבסוף, הווירוס שכותרתו מחדש טיטרציה ידי assay רובד נבדק פלואורסצנטי. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. ממוצע מספר virions קיימא (pfu / ml) כפי שנקבע על assay שלט לפני ואחרי תיוג AF594. Aliquot של וירוס דנגה AF594 שכותרתו היא מופשר מחדש טיטרציה ידי assay רובד זה בדרך כלל עולה פחות מ -10 לקפל ירידה מ titer ההתחלה. ברים שגיאה מצביעים סטיית התקן של כפילויות. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Co-לוקליזציה של AF594 תוויות עם E וירוס דנגה חלבונים בתאי Vero. התאים גדל על coverslips יום לפני נדבקו דנגה AF594 שכותרתו על הפנים של 1 במשך 10 דקות על 37 ° C. התאים היו קבועים לאחר מכן ומסומן עם נוגדנים נגד E, בדק עבור colocalization של חלבון ה '(ירוק) AF594 תיוג (אדום). אותות פלורסנט היו דמיינו בהגדלה 63X באמצעות Zeiss LSM 710 מיקרוסקופ confocal. סרגל קנה המידה 10μm. צהוב עולה תחומי colocalization, כפי שמוצג הבלעה.

<ol><li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &amp, Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fluorescent+Protein+Color+Palette%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li>
<li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+dengue+virus%3A+implications+for+flavivirus+organization%2C+maturation%2C+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li>
<li>Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+sulfoxide+blocks+herpes+simplex+virus-1+productive+infection+in+vitro+acting+at+different+stages+with+positive+cooperativity.+Application+of+micro-array+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis.</a> BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).</li>
<li>Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+Alexa+Fluor+dye+labelling+of+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus.</a> J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Alexa+Fluor+Succinimidyl+Esters+%28Molecular+Probes%22">Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes</a>. , Invitrogen. (2009).</li>
<li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+proteins+stained+by+Alexa+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of proteins stained by Alexa dyes.</a> Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).</li>
<li>Freistadt, M. S., Eberle, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+poliovirus+for+flow+cytometric+cell+surface+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies.</a> J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).</li>
</ol>

למרות AF594 לצבוע שימש בדוח זה, מגוון רחב של fluorophores בסדרת פלואוריד אלקסה אסטרים succinimidyl זמין כימיה עם תיוג דומה. זה יכול להרחיב את היישום תיוג מעבר הדמיה. Cytometry זרימת יכול לשמש כחלופה מיקרוסקופיה confocal להערכת מידת תיוג עבור fluorophores שניתן נרגש זוהה על ידי מכונת FACS. אלקסה צבעים פלואוריד הם מולקולות קטנות להגיב עם קבוצות אמינו חופשיות, בעיקר ארגינין ליזין 9, בדרך כלל כלפי חוץ מול ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxylamine </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 159417 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום הידרוקסיד </td><td> מרק </td><td> 106498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 אסטרים succinimidyl </td><td> בדיקות מולקולריות, Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> PD-10 טור </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M-199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4 גם צלחת </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> Einst </td><td> 0111520 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות </td><td> מפרש מותג </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> 3H5 hybridoma </td><td> ATCC </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> 1 מאגר </td><td> Buf-2040-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> סידן כלוריד </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 15,812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> Tabletop צנטריפוגות </td><td> Eppendorf </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td></td></tr></tbody></table> כדי להכין את ה-M-199 בינוני צמיחה, להוסיף 50 מ&quot;ל של FBS, 5 מ&quot;ל של pyruvate נתרן של 5 מ&quot;ל שאינם חיוניים חומצות אמינו 500ml של M-199, סינון סטרילי. כדי להכין את ה-M-199 בינוני תחזוקה, להוסיף 15 מ&quot;ל של FBS, 5 מ&quot;ל של pyruvate נתרן של 5 מ&quot;ל שאינם חיוניים חומצות אמינו 500ml של M-199, סינון סטרילי.

לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

האירועים בתחילת האינטראקציה בין הנגיף לתא יכולה להיות השפעה רבה על התוצאה של זיהום. קביעת הגורמים המשפיעים על האינטראקציה הזאת יכולה להוביל להבנה משופרת של הפתוגנזה במחלה ובכך להשפיע על החיסון או עיצוב טיפולית. לפיכך, פיתוח של שיטות בדיקה זו אינטראקציה יהיה שימושי. הפיתוחים האחרונים fluorophores בפיתוח טכנולוגיית הדמיה 1-3 ו 4 ניתן לנצל כדי לשפר את הידע הנוכחי שלנו על הפתוגנזה דנגה, ובכך לסלול את הדרך כדי להפחית את מיליוני זיהומים דנגה המתרחשים מדי שנה. וירוס דנגה אפוף יש פיגום חיצונית המורכבת 90 גליקופרוטאין המעטפה (E) הדימרים להגן על הקליפה nucleocapsid, אשר מכיל גדיל RNA חיובי יחיד בגנום 5. יחידות משנה החלבון זהה על פני הווירוס ולכן יכול להיות מתויג עם צבע תגובתי אמין ו דמיינו באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescent. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה של ​​תיוג של וירוס דנגה עם אלקסה פלואוריד succinimidyl אסתר צבע מומס ישירות חיץ סודיום ביקרבונט שהניבו וירוס קיימא מאוד לאחר תיוג. אין הליך סטנדרטי עבור תיוג של נגיף חי פרוטוקול היצרן הקיימים תיוג חלבון בדרך כלל דורש את הכינון מחדש של צבע בתוך sulfoxide דימתיל. הנוכחות של sulfoxide דימתיל, אפילו בכמויות מזעריות, יכול לחסום זיהום פרודוקטיבי של הנגיף וגם לגרום cytotoxicity תא 6. הדרה של השימוש sulfoxide דימתיל בפרוטוקול זה ובכך לצמצם את האפשרות הזאת. אלקסה צבעים פלואוריד יש photostability מעולה פחות pH רגיש יותר צבעים נפוצים, כגון והעמסת ו rhodamine 2, מה שהופך אותם אידיאליים עבור מחקרים על ספיגת הסלולר תחבורה endosomal של הנגיף. נטיה של אלקסה פלואוריד לצבוע לא השפיע על זיהוי של וירוס דנגה שכותרתו ידי נוגדן וירוסים ספציפיים קולטנים המשוערת שלה בתאים לארח 7. שיטה זו יכולה להיות יישומים שימושיים במחקרים virological.

ניצול של התקדמות בפיתוח fluorophore ואת טכנולוגיית הדמיה, שיטה פשוטה של ​​אלקסה פלואוריד תיוג של וירוס דנגה תוכננה כדי לחזות את האינטראקציות המוקדמות בין וירוס לתא.

האירועים המוקדמים באינטראקציה בין הנגיף לתא עשויים להשפיע באופן משמעותי על תוצאת הזיהום. קביעת הגורמים ש...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לסמן באופן פלואורסצנטי את נגיף הדנגי לצורך מחקרים מיקרוסקופיים. הכינו את התמיסות (Buffers) הדרושות וטהרו את נגיף הדנגי באמצעות כרית סוכרוז, ולאחר מכן המיסו מחדש את צבע ה-Amy React Alexa flow ואת נגיף הדנגי בתוך תמיסת סימון. סמנו את נגיף הדנגי באמצעות 100 µM של Alexa flow.הדגירה תימשך שעה אחת, ולאחריה יש לעצור את תגובת הסימון באמצעות ריאגנט העצירה. יש לטהר את נגיף הדנגי המסומן באמצעות עמודת הפרדה לפי גודל (size exclusion column). יש לבצע תיסירציה מחדש של הנגיף המסומן באמצעות בדיקת פלאקים (plaque assay) ולהעריך את דרגת הסימון באמצעות בדיקת אימונופלואורסצנציה.שלום, אני סם ג'אנג ממעבדות ה-DSO National Laboratories, העובד במעבדתו של ד"ר Wee בתוכנית למחלות זיהומיות מתהפעות לאחר לימודי רפואה ב-NUS. היום אראה לכם כיצד לסמן פלואורסצנטית את נגיף ה-Denki באמצעות צבע Alexa flu רגיב לאמי לצורך מחקרי דימות. לצבעי Alexa flu יש יציבות מעולה והם פחות רגישים ל-pH מאשר צבעים נפוצים כגון fluorescein ו-rhodamine, מה שהופך אותם לאידיאליים למחקרים על קליטה תאית וטרנספורט אנדוזומלי של הנגיף.סימון נגיף הדנגי ב-Alexa fluor יסייע להבנת הפתוגנזה של הדנגי. אז בואו נתחיל. לפני תגובת הסימון, הכינו תמיסת סימון (labeling buffer) וריאגנט עצירה טריים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, וטהרו את נגיף הדנגי באמצעות כרית סוכרוז; הוסיפו נפח מתאים של נגיף הדנגי המטוהר לתמיסת הסימון באنبוב מיקרו-צנטריפוגה כדי להגיע לריכוז של 300 million forming units per milliliter.ניתן להגדיל את הכמויות באופן יחסי. עבור סימון של מנת וירוס, יש להמיס את צבע ה-Alexa הליופיליזד לריכוז של 1 mM בבפר סימון רגע לפני תגובת הסימון.יש לצמצם את החשיפה לאור מהשלב הזה והלאה. לצורכי הדגמה, צבע הזרימה Alexa יישאר ללא הגנה מפני אור. יש להוסיף 800 µL של צבע הזרימה Alexa בריכוז 1 mM לוירוס הדנגי המדולל, תוך כדי ערבוב עדין בעזרת קצה של מיקרופיפט.דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, בהגנה מפני אור, תוך ערבוב באמצעות היפוכים עדינים בכל 15 דקות. לאחר שעה אחת, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה למשך זמן קצר. העבירו 800 microliter מהתת-אזור תוך כדי ערבוב עדין באמצעות מיקרופיפטה, ודגרו למשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר, בהגנה מפני אור, תוך ערבוב באמצעות היפוכים עדינים בכל 15 דקות.בינתיים, יש לשטוף את עמודת הניקוי עם 25 milliliters של באפר HNE. לאחר דגירה של שעה אחת, יש להעביר את הווירוס המסומן לעמודה ולהתחיל באיסוף של השטף (flow through). מלאו את העמודה בבאפר HNE.לאחר שכל הנגיף המסומן נכנס למטריצה, השליכו את 2.5 המיליליטרים הראשונים של התוצר שעבר דרך המטריצה (flow through) ואספו את שני המיליליטרים הבאים של פראקציית הנגיף המסומן. הקפיאו ושמרו את הנגיף המסומן והמזוקק בטמפרטורה של Minus 80 degrees Celsius. קבעו את התיתר של הנגיף המסומן באמצעות plaque assay.בניסוי טיפוסי, יש לצפות לירידה של פחות מעשרה שערים (tenfold) בתר titer של הנגיף. לאחר הסימון, יש לבצע בדיקת אימונופלואורסצנציה כדי להעריך את מידת הסימון. לצורך כך, יש לספור את התאים הנגיפים באמצעות המוציטומטר ולהוסיף נפח מתאים של תאים למצע גידול כדי להגיע לצפיפות של 50,000 תאים למילליליטר.העבר מילליליטר אחד של תאי וירוס לכל באער בצלחת בעלת ארבעה באערים המכילה כיסוי זכוכית סטרילי. דגרי את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. הוצא את הצלחת מהאינקובטור ושאב את הנוזל העליון מכל באער, ולאחר מכן דגרי את התאים עם MOI של בערך 1 של הווירוס המסומן בנפח של 100 µL למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 °C.הסר את האינוקולום ושטוף את התאים עם 0.5 milliliters של בופר PBS לכל באר. בצע את הפעולה הזו ושחזר אותה פעמיים נוספות. קבע את התאים באמצעות 200 microliters של 3%per for multi height לכל באר בטמפרטורת החדר למשך 30 Minutes.שטפו את התאים שלוש פעמים עם 0.5 milliliters של בופר PBS לכל באר. בצעו פרמיליזציה לתאים באמצעות תמיסת פרמיליזציה בטמפרטורת החדר למשך 30 Minutes. הסירו את כיסוי הבאר באמצעות פינצטה עדינה.נקזז נוזלים עודפים על ידי ניגוב קצה הזכוכית המכסה. החלק אותה על נייר סופג. הנח את צד התא של המכסה.טפטפו 25 µL של נוגדן לחלבון e של דנגי על פיסת זכוכית. הדגירו למשך שעה אחת בתא לחות בטמפרטורת החדר, תוך הגנה מאור. לאחר מכן, העבירו את כיסוי הזכוכית לפלטת שש בארות והוסיפו 2 mL של בופר שטיפה לכל באר.שאבו את הנוזל העליון. חזרו על שלבי שטיפה אלו פעמיים נוספות לאחר השטיפה האחרונה. הסירו את כיסוי הזכוכית מהבאר באמצעות פינצטה עדינה.נקז את הנוזל העודף על ידי טבילת קצה כיסוי הזריקה. החלק אותו אל מול נייר סופג. הנח את צד התא של הכיסוי.טפטפו 25 µL של נוגדן משני anti-mouse מסוג Alexa Fluor 488 על פיסת פראפמנט. דגרו למשך 45 דקות בתא לחות בטמפרטורת החדר, תוך הגנה מאור. לאחר סיום הדגירה, העבירו את כיסוי הזכוכית (coverslip) לפלטת 6 בארות ושטפו את התאים שלוש פעמים עם 2 mL של תמיסת שטיפה עבור כל שטיפה. לאחר השטיפה האחרונה, הוציאו את כיסוי הזכוכית מהבאר ושטפו פעם אחת במים דה-יוניזציה.יש לסנן את עודפי הנוזל על ידי ספיגה בנייר. יש להדביק את זכוכית הכיסוי על גבי המשקף באמצעות 8 µL של תמיסת קיבוע עדינה. יש להניח לתמיסת הקיבוע להתייצב למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C.הדגימה מוכנה כעת להדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי. הניחו טיפה קטנה של שמן טבילה (immersion oil) על פני הזכוכית המכסה והצמידו את הזכוכית להב המיקרוסקופ על במה המיקרוסקופ.כווננו את הבמה עד שהעדשה של המיקרוסקופ תיכנס במגע עם שמן האימרסיה. לקבלת תמונה ברורה, כבו את התאורה הסביבתית באמצעות תוכנת Zes Zen. לחצו על לשונית ocular לצפייה ישירה בדגימה דרך העינית של המיקרוסקופ.מצאו שדה ראייה עם תאים וכוונו את המיקוד. כעת עברו למצב רכישה. כדי למזער crosstalk בין הערוצים הפלואורסצנטיים, בחרו ערוצים נפרדים עבור Alexa Fluor 488 ו-Cy5.התאם את הצבעים והגדרות הרכישה לעירור וגילוי עוקבים. כוון את הגבר (gain) ואת ההיסט (offset) של הספק הלייזר כדי להבטיח שהתמונה אינה חשופה מדי או חסרה בחשיפה. צלם את התמונה ונתח אזור עניין באמצעות פונקציית קולוקליזציה (colocalization).ניתן להשתמש במקדם החפיפה כדי להעריך את דרגת הסימון של נגיף הדנגי באמצעות ה-Alexa Flo Dye. בוצע מבחן אימונופלואורסצנציה פשוט על תאי נגיף, וניתן להעריך את דרגת הסימון מתוך הקולוקליזציה של הנגיף המסומן עם נוגדן przeciw לחלבון e; מקדמי החפיפה של הצביעה בנוגדנים נעים בין 0.65 ל-0.8, מה שמעיד על כך שכ-65% עד 80% מהגרסאות סומנו ב-Alexa floor dye. כדי שהליך הסימון יצליח, חשוב להכין את בופר הסימון, להשתמש בריאגנטים טריים ולשחזר את ה-Alexa floor digest לפני הסימון.ניתן לבצע אופטימיזציה נוספת של ריכוז הצבע כדי להתאימו לצרכיכם. שיטה זו של סימון אופקי של נגיף הדנגי עשויה להותאם לסימון נגיפים אחרים. וזהו זה.תודה לצפייה ובהצלחה בניסוי הסימון שלכם.

visualizing-dengue-virus-through-alexa-fluor-labeling

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פונקציה-Spacer-ליפידים (FSL) בונה לאפשר את תכונות פני השטח של תאים חיים virions להיות שונה ללא אובדן חיוניות. השיטה דורשת מגע פשוט רק פתרון לבנות FSL עם תא / virion ושילוב משטח יציב ספונטנית מתרחשת.

FSL בונה: שיטה פשוטה שינוי Cell / Virion משטחים עם מגוון רחב של סמנים ביולוגיים מבלי להשפיע ליכולת הקיום שלהם

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

חלקיקים adenovirus מתוכננים להכיל אנלוגי טבעי חומצת אמינו azidohomoalanine או סוכר...

שינוי Chemoselective של משטחים ויראלי באמצעות כימיה לחץ Bioorthogonal

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

מקור: Zaeck, L.,  et al.} הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של זיהום בנגיף הכלבת ברקמת מוח מנוקה ממסים. J. Vis. exp. (2019).  סרטון זה מדגים את תהליך ההכנה וההדמיה של רקמת מוח של עכברים שנדבקו בנגיף הכלבת (RABV) כדי להעריך את התקדמות ההדבקה. הוא מתאר שלבים מרכזיים, כולל צביעת רקמות עם סמנים פלואורסצנטיים, התייבשות, ניקוי והרכבה למיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, ששיאו ביצירת ייצוג תלת מימדי.

הדמיה תלת מימדית של זיהום בנגיף הכלבת ברקמת מוח של עכבר

ההחזקה של virions על פני השטח היא דרישה להדמיית virion יחיד על ידי הדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה סופר או מיקרוסקופיה כוח אטומי (AFM). כאן אנו מדגימים שיטת הכנה לדוגמה להדבקה מבוקרת של virions למשטחי זכוכית המתאימים לשימוש AFM והדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה סופר.

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

וירוסים או שלפוחיות חוץ-תאיות נלכדו חיסונית עם ננו-חלקיקים מגנטיים של 15 ננומטר יחד עם נוגדנים המזהים אנטיגנים על פני השטח. הנגיפים או השלפוחיות שנתפסו סומנו בנוגדנים פלואורסצנטיים כנגד אנטיגנים אחרים על פני השטח. הקומפלקסים שהתקבלו הופרדו בשדה מגנטי גבוה ונותחו באמצעות ציטומטרים זרימה קונבנציונליים המופעלים על פלואורסצנטיות.

זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

כאן אנו מציגים רגיש, מהיר, ומפלה שיטת להפלות מכתים את התמונה rnas מתויג עם ה-RNA מנגו aptamers I, II, III, או IV, באמצעות מקורי או באמצעות הרפתקאות אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (PAGE) ג'לים. לאחר הפעלת ג'לים סטנדרטיים של דף, מנגו-מתויג RNA יכול להיות מוכתם בקלות עם TO1-Biotin ולאחר מכן ניתח באמצעות קוראי קרינה זמינים נפוץ.

הדמיית פלורסנט של מנגו-מתויג RNA ב-Pvc פוליאקרילאמיד באמצעות שיטת Poststaining

מוצג כאן פרוטוקול לגישת הדמיה פלואורסצנטית, multiplex immunofluorescent c ell-based detection של DNA, RNA, ו- protein (MICDDRP), שיטה המסוגלת להדמיה פלואורסצנטית סימולטנית חד-תאית של חלבונים נגיפיים וחומצות גרעין מסוג וגדילה שונים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות.

הדמיה פלואורסצנטית מרובת תאים בודדים כדי לדמיין חומצות גרעין וחלבונים ויראליים ולפקח על HIV, HTLV, HBV, HCV, נגיף זיקה וזיהום שפעת

כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה המשלבת פלואורסצנטיות RNA בהכלאה במקום (RNA-FISH) עם כשל חיסוני כדי לדמיין תסמונת נשימתית חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) RNA. פרוטוקול זה עשוי להגביר את ההבנה של המאפיינים המולקולריים של אינטראקציות מארח SARS-CoV-2 RNA ברמת תא יחיד.

הדמיה של SARS-CoV-2 באמצעות אימונו RNA-פלואורסצנטיות בהכלאה Situ

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר שיטה מהירה ויעילה למדידת נוגדנים מנטרלים נגד חלבון ספייק SARS-CoV-2 על ידי הערכת היכולת של דגימות סרום הבראה לעכב זיהום על ידי חלבון פלורסנט ירוק משופר שכותרתו וירוס סטומטיטיס פסאודוטיפ עם גליקופרוטאין ספייק.

זיהוי נוגדנים מנטרלים SARS-CoV-2 באמצעות הדמיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה של זיהום פסאודווירוס

למד שיטה לתיוג וירוס דנגה בפלואורסצנטיות באמצעות Alexa Fluor למחקר אינטראקציות וירוס-תא מארח. טכניקה זו מאפשרת הדמיה מיקרוסקופית של שלבי ההדבקה הראשוניים ומסייעת בפיתוח אסטרטגיות אנטי-ויראליות.

לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

גלה סרטונים נוספים