לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לתייג באופן פלואורסצנטי את נגיף הדנגי למחקרים מיקרוסקופיים. הכן את המאגרים הדרושים וטהר את נגיף הדנגי עם כרית סוכרוז הרכיב מחדש את צבע הזרימה של Amy React Alexa ונגיף הדנגי במאגר התיוג. סמן את נגיף הדנגי עם מאה מיקרומולר של זרימת אלקסה.

למות למשך שעה אחת ולהפסיק את תגובת התיוג עם מגיב המשנה. טהר את נגיף הדנגי של התווית באמצעות עמודת אי הכללת גודל. חזר על הנגיף המסומן על ידי בדיקת פלאק והעריך את מידת התיוג על ידי בדיקת אימונופלואורסצנטית.

היי, אני סם ג'אנג מהמעבדות הלאומיות של DSO שעובד במעבדה של ד"ר ווי בתוכנית למחלות זיהומיות מתפתחות לאחר בית הספר לרפואה של NUS. היום אני הולך להראות לכם כיצד לתייג פלואורסצנטי את וירוס דנקי עם צבע שפעת אלקסה ריאקטיבי של איימי למחקרי הדמיה. אלקסה, שפעת מתה, עדיפה על היציבות והם פחות רגישים ל-pH מאשר תזונה נפוצה כגון פלואורסצאין ומשימת רומין, מה שהופך אותם לאידיאליים למחקרים על ספיגה תאית והובלה אנדוזומלית של הנגיף.

פגם אלקסה שכותרתו נגיף דנגי יקל על ההבנה של פתוגנזה של דנגי. אז בואו נתחיל. לפני תגובת התיוג, הכינו מאגר תיוג טרי והפסיקו את המגיב על פי הפרוטוקול הכתוב וטהרו את נגיף הדנגי על ידי כרית סוכרוז, הוסיפו נפח מתאים של נגיף הדנגי המטוהר למאגר התיוג בצינור מיקרו צנטריפוגה כדי להשיג ריכוז של 300 מיליון יחידות יצירה למיליליטר.

ניתן להגדיל זאת באופן פרופורציונלי. לתיוג אצווה של וירוס. הרכיבו מחדש את צבע הרצפה של אלקסה הליופילית למילימולרית אחת במאגר התיוג ממש לפני תגובת התיוג.

צמצם את החשיפה לאור משלב זה ואילך. לצורך הדגמה, צבע הרצפה של אלקסה יישאר ללא הגנה מפני אור של 800 מיקרוליטר של המילימולר האחד. זרימת אלקסה מתה לנגיף הדנגי המדולל תוך ערבוב עדין עם קצה המיקרו פיפט.

דגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר מוגנת מאור מעורבב על ידי היפוכים עדינים כל 15 דקות לאחר שעה, צנטריפוגה את הצינורות לזמן קצר. 800 מיקרוליטר של תת האזור תוך כדי בהייה עדינה עם המיקרו פיפטה דגירה למשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר. מוגן מפני אור יוצר על ידי היפוכים עדינים כל 15 דקות.

בינתיים, הוא משווה את עמוד הטיהור ל-25 מיליליטר של מאגר HNE. לאחר הדגירה של שעה, החל את הנגיף המסומן על העמודה והתחל לאסוף את הזרימה. מלא את העמודה במאגר HNE.

לאחר שכל הנגיף המסומן נכנס למטריצה, השליכו את 2.5 מיליליטר הזרימה הראשונים ואספו את שני המיליליטרים הבאים של חלק הנגיף המסומן. אקור, וראה את הנגיף המטוהר המסומן במינוס 80 מעלות צלזיוס. קבע את הכותרת של הנגיף המסומן על ידי בדיקת פלאק.

בניסוי טיפוסי, יש להבחין בירידה של פחות מפי עשרה בשם הנגיף. לאחר התיוג, יש לבצע בדיקת אימונופלואורסצנציה כדי להעריך את מידת התיוג. לשם כך יש לספור תאים נגיפיים באמצעות ציטומטר המו ונפח מתאים של תאים למצע גידול כדי להשיג צפיפות של 50,000 תאים למיליליטר.

ראה מיליליטר אחד של תאים נגיפיים לבאר בצלחת ארבע בארות המכילה כיסוי זכוכית סטרילי. ישן. דגרו על התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. הסר את הצלחת מהחממה ושאף את הסופינטור היטב למעשה, התאים עם כ-MOI אחד של הנגיף המסומן בנפח של מאה מיקרוליטר למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

הסר את החיסון ושטוף את התאים עם 0.5 מיליליטר של מאגר PBS לבאר. רוח דיס וחזור על הליך זה פעמיים נוספות. תקן את התאים עם 200 מיקרוליטר של 3% לגובה רב לבאר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

שטפו את התאים שלוש פעמים עם 0.5 מיליליטר מאגר PBS לבאר. יש לשים את התאים עם תמיסת איזציה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הסר את השינה מהכיסוי היטב באמצעות מלקחיים עדינים.

מסננים עודפי נוזלים על ידי DPing של קצה המכסה. החליקו על נייר לבן. הנח את צד התא של הכיסוי.

לישון על 25 מיקרוליטר של נוגדן חלבון דנגי e על חתיכת בושם. דגירה למשך שעה בתא לח בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. לאחר מכן, העבירו את החלקת הכיסוי לצלחת של שש בארות והוסיפו שני מיליליטר מאגר כביסה לכל שמן.

שאפו את השכבה. חזור על שלבי הכביסה הללו פעמיים נוספות לאחר הכביסה האחרונה. הסר את החלקת הכיסוי מהבאר באמצעות fp עדין.

מסננים את עודפי הנוזלים על ידי טבילת קצה הכיסוי. החליקו על מגבון נייר. הנח את צד התא של הכיסוי.

לישון על 25 מיקרוליטר של רצפת אלקסה לשמונה שמונה נוגדנים משניים נגד עכבר על חתיכת בושם. דגירה למשך 45 דקות בתא לח בטמפרטורת החדר מוגן מאור לאחר השלמת הדגירה, העבירו את שנת הכיסוי לצלחת שש בארות ושטפו את התאים שלוש פעמים עם שני מיליליטר מאגר כביסה לכל שטיפה לאחר הכביסה האחרונה. הסר את החלקת הכיסוי מהבאר ושטוף פעם אחת במים המיוננים.

מסננים את עודפי הנוזלים על ידי טבילה בנייר. נגב את החלקת הכיסוי על נורת מיקרוסקופ עם שמונה מיקרוליטרים של תמיסת הרכבה עדינה. אפשר לתמיסת ההרכבה להתייצב בלילה ארבע מעלות צלזיוס.

הדגימה מוכנה כעת להמחשה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי. הניחו טיפה קטנה של שמן טבילה על פני שנת הכיסוי והדקו את המיקרוסקופ. החלק לשלב המיקרוסקופ.

התאם את השלב עד שמטרת המיקרוסקופ תבוא במגע עם שמן הטבילה. לקבלת תמונה ברורה, כבה את אורות הסביבה באמצעות תוכנת Zes Zen. לחץ על ברז העיניים לתצפית ישירה על הדגימה דרך עינית המיקרוסקופ.

מצא מילוי בתאים והתאם את המיקוד. כעת עבור למצב רכישה. כדי למזער דיבור צולב בין מפלי פרחים, בחר מסלולים נפרדים עבור Alexa floor 4, 8, 8 ו-finite four.

צובע וסט רכישות לעירור וזיהוי עוקבים. כוונן את רווח הכוח וההיסט של הלייזר כדי להבטיח שהתמונה לא תהיה חשופה יתר על המידה. צלם את התמונה ונתח אזור עניין באמצעות פונקציית לוקליזציה.

ניתן להשתמש במקדם החפיפה כדי להעריך את מידת התיוג של נגיף הדנגי על ידי צבע Alexa Flo. בדיקה אימונופלואורסצנטית פשוטה נעשתה על תאים נגיפיים וניתן להעריך את מידת התיוג מהקולוקליזציה של הנגיף המסומן עם חלבון אנטי e, יעילות חפיפה של צביעת נוגדנים נעה בין 0.65 ל-0.8 מה שמצביע על כך שכ-65 עד 80% מהשונות סומנו בצבע הרצפה של אלקסה. כדי שהליך התיוג יצליח, חשוב להכין את מאגר התיוג ולהתחיל להשתולל טרי ולהרכיב מחדש את תקציר רצפת Alexa לפני התיוג.

ניתן לבצע אופטימיזציה נוספת של ריכוז הצבע לשימוש כך שיתאים לצרכים שלך. ניתן להתאים שיטה זו של נגיף דנגי לסימון אופק כדי לתייג נגיפים אחרים. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה על ניסוי התיוג שלך.