הזרקה סטריאוטקסית של וקטורים ויראליים לתכנות מחדש של תאי גליה במודל עכבר

אבטח עכבר טרנסגני מורדם במסגרת סטריאוטקסית כשגולגולתו חשופה.

עכבר זה מבטא Cre recombinase בתאי גליה.

מקם את הזרוע הסטריאוטקסית המחזיקה את צינור הנימים מעל הגולגולת ויישר אותה מעל הברגמה.

התאם את הצירים הסטריאוטקטיים למיקוד מדויק.

קדחו חור באתר המטרה, וודאו שהדורה מאטר נשארת שלמה. הסר שברי עצם.

שטפו את צינור הנימים עם חיץ. ערכו בועת אוויר, ואז טענו את הנגיף הקשור לאדנו, הנושא תכנות מחדש של תכנות עצבי לא פעיל וגנים של חלבונים פלואורסצנטיים.

הורד את צינור הנימים לעומק המטרה והזריק את התמיסה הנגיפית לאזור העשיר בתאי גליה.

משוך בזהירות את הצינור כדי למנוע זרימה חוזרת.

סגור את החתך ואפשר התאוששות.

הנגיפים המופנמים מעבירים גנים מומתים משני צדי loxP לגרעין הגליה. Cre recombinase הופך אותם, מפעיל גנים לתכנות מחדש של עצבים ומניע המרה עצבית. אינטרנוירונים מתוכנתים מחדש מבטאים את החלבון הפלואורסצנטי תחת המקדם הספציפי לנוירונים.

כדי להזריק גורמי תכנות מחדש, הנח עכבר מורדם במסגרת הסטריאוטקסית, תן משככי כאבים מתאימים בתחילת הניתוח, ולאחר מכן הבא את קצה נימי הזכוכית של מחט ההזרקה ממש מעל ברגמה. ודא שהקצה הנימי ישר לחלוטין הן במישורי AP והן במישורי M-L. אפס את ערכי M-L ו-AP ל-0.0 במונה הקואורדינטות הדיגיטלי.

כדי לוודא שראש החיה נמצא במצב שטוח לחלוטין, השתמש במונה הקואורדינטות הדיגיטלי כדי למדוד את ערך הקואורדינטות D-V כאשר זרוע ה-AP נמצאת בפלוס 2.0 ומינוס 2.0, כמו גם כאשר זרוע ה-M-L נמצאת בפלוס 2.0 ומינוס 2.0. התאם את גובה מוט השיניים ומוטות האוזניים בהתאם. לאחר מכן, הרם מעט את המזרק וקדח חור באמצעות מקדחה דנטלית בקואורדינטות ההזרקה.

התחל לקדוח באתר, לעבוד בצורה מעגלית ועדינה. לאחר מכן, הניחו חתיכת גזה כותנה מעל החתך הפתוח ושטפו את המזרק בתמיסת מלח. לאחר השטיפה, ציירו בועת אוויר ולאחר מכן 1 מיקרוליטר של תמיסה המכילה את הווקטור הנגיפי. ודא שניתן לדמיין בקלות את התמיסה הנגיפית מתחת לבועת האוויר.

לאחר מכן, הורד את המזרק, התקדם לאט לעומק הרצוי וודא שהמסלול נקי משברי עצם. לאחר מכן, יש להזריק 1 מיקרוליטר מהתמיסה הנגיפית בקצב של 0.4 מיקרוליטר לדקה. בסיום ההזרקה, אפשר שתי דקות לדיפוזיה לפני נסיגת המזרק.

לאחר הדיפוזיה, החזר לאט את המזרק עד שקצה הנימים נסוג לחלוטין מהמוח. לאחר מכן, תפר בזהירות את החתך והסר את החיה מהמסגרת הסטריאוטקסית. עקוב אחר בעל החיים בתחנה לאחר הניתוח עד להחזרת ההכרה.

בעלי חיים מוחזקים עד 12 שבועות לאחר הזרקת הנגיף כדי לאפשר לגליה המקומית לתכנת מחדש לנוירונים בוגרים.