Cut-טעינה: כלי שימושי לבחינת היקף Coupling צומת גאפ נותב בין הנוירונים רשתית
12 בינואר 2012
השיטה קלה ונוחה, כדי לקבוע את מידת צימוד צומת הפער נותב בין הנוירונים ברשתית מתואר. טכניקה זו מאפשרת לחקור את הפונקציה של סינפסות חשמליות בין הנוירונים ברשתית שלמים בתנאי תאורה שונים, בזמנים שונים של היום והלילה.
המטרה הכוללת של ניסוי טעינת החיתוך הבא היא לבחון את היקף צימוד עוקב צומת הפער בין נוירונים ברשתית השלמה בתנאי תאורה מבוקרים. השלב הראשון מושג על ידי חיתוך רשתית עם להב חד טבול בתמיסה של נוירו-ביוטין, מולקולת מעקב שיכולה להתפזר דרך תעלות צומת פתוחות, אך לא דרך קרומי התאים. בשלב השני, הרשתית מודגרת בתמיסת רינגר, המאפשרת דיפוזיה של עוקב דרך תעלות צומת מרווחים פתוחות.
אם צימוד צומת הפער חלש, הקרינה הנוירו-ביוטין תוגבל לנוירונים ברשתית הנמצאים ליד החתך. לעומת זאת, אם צימוד צומת הפער חזק, הקרינה תזוהה בתאי עצב ברשתית הרחק מהחתך. היתרון העיקרי של עומס חיתוך על פני טכניקות קיימות הוא שקל יותר לבצע אותו על נוירונים עם גופי תאים קטנים ברקמת רשתית עצבית שלמה.
כמו כן, קל יותר לשלוט בתנאי ההארה במהלך העמסת חיתוך מאשר במהלך מחקר אלקטרופיזיולוגי של נוירונים בודדים ברקמת רשתית שלמה. מכיוון שגירויי האור המשמשים במהלך הקלטה חשמלית יכולים בעצמם להוביל לשינויים בצימוד צומת הרווח, המדגים את הטכניקה יהיה ד"ר צ'ו צ'וי, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. בהליך זה, דג זהב מוחזק בחושך קבוע ביום לפחות שעה לפני הניתוח, וכל השלבים הבאים עד לקיבוע רקמת הרשתית, מבוצעים גם במהלך היום בחושך מתמיד, מרדימים עמוק את דג הזהב על ידי הוספת 150 מיליגרם לליטר מתאן סולפונאט למי האקווריום.
לאחר מכן הקריבו את דג הזהב על פי ההנחיות הפדרליות והאוניברסיטאיות והסירו את גלגלי העיניים שלו בזהירות. לאחר מכן, הסר את החלק הקדמי של כל גלגל עין. לאחר מכן הניחו פיסת נייר סינון על גבי החלק האחורי של העין והפכו את נייר הסינון והעין כך שנייר הסינון יהיה מתחת לחלק האחורי של העין.
כעת, הסר בעדינות את החלק האחורי של העין, כולל הסקלרה ואפיתל הפיגמנט מדגי הזהב המותאמים לכהות. הרשתית חתכה את עצב הראייה במספריים עדינים. כעת יש לחבר את דג הזהב העצבי, קולטן האור המכוון לרשתית כלפי מעלה לנייר הסינון לפני הוצאתו, בעוד הדג עובר הרדמה בחמישה מיליליטר מחומצן על ידי תמיסת רינגר מבוססת קרבונט עם או בלי תרופת בדיקה לכל באר של צלחת שש בארות לאחר דיסקציה של הרשתית העצבית השלמה מהחלק האחורי של העין.
העבירו את הרשתית לבארות בחושך מתמיד. לאחר מכן אטמו את הבארות בפרפורם ותנו לרקמה לדגור למשך 30 דקות. הכן 100 מיקרוליטר של תמיסת מעקב על ידי המסת 0.5% נוירו-ביוטין בתמיסת רינגר מיד לפני חיתוך הרשתית.
לאחר מכן, הוסיפו את תמיסת הנוירו-ביוטין לצלחת פטרי מזכוכית. לאחר מכן הקש בעדינות על נייר הסינון שאליו מחוברת הרשתית על מגבת נייר. כדי להסיר צלצולים עודפים, טבלו סכין גילוח בתמיסת הנוירו-ביוטין ובצעו חתך רדיאלי מאונך דרך הרשתית ונייר הסינון.
לאחר מכן, טבלו שוב את סכין הגילוח בתמיסת הנוירו-ביוטין וחתכו את הרשתית בפעם השנייה. חזור על פעולה זו עד ארבעה חתכים לכל רשתית. בשלב זה, העבירו את הרשתית לצלצולים טריים, בינוניים עם או בלי תרופת בדיקה למשך 15 דקות כדי לאפשר העמסה ודיפוזיה.
שטפו אותו שלוש פעמים עם צלצולים טריים, בינוניים עם או בלי תרופת בדיקה למשך חמש דקות כל אחד. לאחר מכן תקן את הרשתית עם פורמלדהיד 4%para בתמיסת חיץ פוספט מולרית 0.1 בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, שטפו את הרשתית עם 0.1 PBS מולארי למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס על ידי הכנסתה למקרר למחרת.
להגיב על הרשתית עם 2% סטרפטווידין אלקסה 4 88 ב-0.1 PBS מולארי ו-0.3% טריטון X 100 לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר ולדגור למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת. שטפו את הרשתית שלוש פעמים עם 0.1 PBS מולארי בטמפרטורת החדר בכל פעם למשך 10 דקות.
נתק את הרשתית מנייר הסינון ב-PBS. לאחר מכן בעזרת מברשת עדינה, הרכיב את צד קולטן האור של הרשתית כלפי מעלה על שקופית עם מדיום הרכבה של מגן וקטורי. העבירו את השקופית למיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר וצלמו תמונות באותה רזולוציית הגדלה והגדרות עבור כל תנאי ניסוי, כך שניתן יהיה להראות השוואות של ההשפעות של תנאי ניסוי שונים על היקף צימוד העוקב הפונקציונלי של הפער.
להלן היקף צימוד עוקב התאים של קולטני האור במהלך היום בחושך מתמיד בהשוואה במהלך היום בחושך מתמיד בנוכחות אחד אנטגוניסט קולטן דופמין D סלקטיבי. שימו לב שחתך התער בשתי התמונות נמצא משמאל. למרות שתמונה בודדת עשויה להכיל את כל התאים המסומנים, מומלץ לאסוף ערימת Z של אזור העניין ולכווץ אותה לתמונה אחת המוצגת.
להלן היקף צימוד עוקב התאים של קולטני האור כאשר נעים ברצף דרך זאק כזה. שימו לב שחתך התער בתמונה זו נמצא בצד ימין. כדי לכמת את היקף צימוד העוקב בדפדפן התמונות LSM, פתח את התמונה ולאחר מכן לחץ על ייצוא ושמור את התמונה כסרגל קנה מידה של קובץ TIF 16 סיביות שאינו דחוס צריך להיכלל בתמונת TIFF זו באמצעות תוכנת NIH image J.
מדוד את עוצמת הקרינה של Alexa 4 88 המסומן נוירו-ביוטין מתמונות בהגדלה נמוכה של רשתית הרכבה חור. פתח את קובץ ה-TIFF באמצעות תוכנת Image J ולאחר מכן צייר קו ישר המתאים לסרגל קנה המידה. לאחר מכן, עבור לניתוח, הגדר קנה מידה והזן את המרחק ויחידת האורך הידועים.
לאחר מכן לחץ על אישור. כעת ניתן להציג את מדידות הקרינה ביחידות מכוילות כגון מילימטרים. לאחר מכן, בחר את אזור העניין באמצעות כלי הבחירה המלבני.
יש למקם את שיא הפלורסנט בגבול השמאלי של הבחירה שלך. ודא שאין אות פלואורסצנטי ליד הגבול הימני. לחץ על ניתוח והתוויית פרופיל עבור נתוני הבקרה בשעות היום המתקבלים בחושך מתמיד.
עקומה עם דעיכה מעריכית מוצגת משמאל לימין. לאחר מכן לחץ על העתק בחלון המוקפץ והדבק אותו ב- Excel. כעת יש שתי עמודות, האחת מציגה את המרחק מהחתך והשנייה מציגה את עוצמת הקרינה כפונקציה של המרחק מהחתך.
לשם השוואה, השלבים לעיל חוזרים על עצמם עם נתונים המתקבלים בחושך מתמיד ביום. בנוכחות יריקה, חלקו כל ערך פלואורסצנטי גולמי בערך הקרינה המקסימלי כדי לקבל את עוצמת הקרינה היחסית. העתק שתי עמודות המתאימות למרחק מהחיתוך ולעוצמת הקרינה היחסית, ולאחר מכן הדבק אותן בתוכנת המקור.
שלבים אלה מוצגים הן עבור בקרת היום והן עבור היריקה בשעות היום. נתוני ריצה בשלב זה מתאימים את התוצאות לדעיכה המעריכית. פונקציה מספר אחת, השווה את ערכי קבועי המרחב בתנאי ניסוי שונים באמצעות מבחן T או Inova.
פונקציות אקספוננציאליות וניתוחים סטטיסטיים של בקרה ביום, פיפ רון ביום ונתוני בקרה בלילה מוצגים להשוואה. המוצג. להלן דוגמאות להיקף צימוד תאי קולטני האור ברשתית דג הזהב המותאמת בחושך ביום A, בלילה B, וביום בנוכחות אחד אנטגוניסט קולטן דופמין D סלקטיבי שני כפי שנחשף על ידי טכניקת העמסת החיתוך. כל התמונות הקונפוקליות צולמו תוך שימוש באותן הגדרות להשוואה.
בגרף זה, עוצמת הקרינה עבור שלושה תנאי ניסוי משורטטת כפונקציה של המרחק מהחתך ומותאמת על ידי הפונקציה המעריכית. טכניקת העמסת החיתוך משמשת לכימות היקף צימוד העוקב הצומת על ידי חישוב ערכי קבועי החלל כפי שמוצג כאן עבור שלושה תנאי ניסוי. ניתן להשתמש בטכניקת העמסת החיתוך גם כדי לחקור את הסינפסות החשמליות בין סוגי תאים אחרים ברשתית ובמינים אחרים.
לדוגמה, שני האיורים הללו ממחישים כי תאים אופקיים מסוג ארנב, סוג A וסוג B מציגים צימוד עוקב הומולוגי בעקבות העמסה חתוכה ודיפוזיה של נוירוביוטין בתנאים מותאמים חשוכים. השתמשנו בטכניקת העמסת החיתוך כדי לחקור את מידת דיפוזיה העוקבת דרך צמתי הפער בין מוטות לקונוסים ביום ובלילה. בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לקבוע אם צימוד עוקבים בין נוירונים אחרים ברשתית נשלט על ידי שעון הרשתית או על ידי תנאי חושך בהירים ספציפיים.
זה יכול לשמש גם לחקר צימוד עוקבים בין נוירונים באזורי מוח אחרים.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לקביעת מידת הצימוד של סמן לצמתי פער (gap junction tracer coupling) בין נוירונים ברשתית. הטכניקה מאפשרת לחקור סינפסות חשמליות ברשתית שלמה תחת תנאי תאורה משתנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של הרשתית
- תקשורת תאית
רקע
- צמתי פער (Gap junctions) מקלים על התקשורת בין נוירונים.
- הבנת הצימוד של סמנים עשויה לחשוף תובנות לגבי התפקוד הנוירונלי.
- שיטות קיימות עשויות להיות מאתגרות עבור גופי תא קטנים ברקמות שלמות.
- תנאי תאורה עשויים להשפיע על הצימוד של צומתי פער (gap junctions).
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה נוחה להערכת צימוד של צומתי פער (gap junction coupling).
- בחינת השפעות התאורה על סינפסות חשמליות בנוירונים של הרשתית.
- שיפור טכניקות קיימות לחקר מבנים נוירונליים קטנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- רשתית חתוכה וטעונה עם סמן neuro biotin.
- אינקובציה בתמיסת ריינגר (ringer's solution) מאפשרת דיפוזיה של הסמן.
- הפלואורסצנציה מנותחת כדי להעריך את עוצמת הצימוד.
- התנאים הניסויים נשלטים כדי למזער השפעות חיצוניות.
תוצאות עיקריות
- עוצמת הפלואורסצנציה מעידה על מידת הצימוד של הסמן.
- התוצאות משתנות בהתאם לתנאי התאורה ולשעה ביום.
- טעינה באמצעות חיתוך (Cut loading) נמצאה יעילה עבור מבנים עצביים קטנים.
- השיטה מאפשרת ביצוע ניתוח השוואתי בין מערכי ניסוי שונים.
מסקנות
- שיטת הטעינה בחיתוך (cut loading method) היא כלי בעל ערך לחקר נוירונים ברשתית.
- תנאי התאורה משפיעים באופן משמעותי על הצימוד במרווחי פער (gap junction coupling).
- טכניקה זו יכולה להעמיק את הבנתנו לגבי תקשורת נוירונלית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכת תקשורת המתווכת על ידי צמתי פער (gap junctions) בנוירונים של הרשתית תומכת בתיקוף של מטרות בתהליכי גילוי תרופות במדעי המוח, על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מכניסטיים של מודולטורים סינפטיים. טכניקת ה-cut-loading מספקת נתונים כמותיים של דיפוזיית סמן ברזולוציה מרחבית תחת תאורה מבוקרת, ובכך משפרת את רמת הוודאות החיזויית במחקרי מעורבות מטרה (target engagement) בשלבים מוקדמים. גישה זו פותרת מחסום טכני מרכזי בחקר מבנים נוירונליים קטנים ברקמה שלמה, ומקלה על פיתוח בדיקות הניתנות לשחזור לצורך הבהרת מסלולים ביולוגיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות הצימוד של סומן בצומירי פער (gap junction tracer coupling) כקריאה תפקודית של עוצמת הסינפסה החשמלית.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדידות סטנדרטיות של דיפוזיית סומנים, המבהירות את המודולציה של המטרה על ידי מוליכים עצביים או תרופות.
- ערך חיזוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי אספקת ערכים כמותיים של קבוע המרחב (space constant) המשקפים את יעילות הצימוד בתנאים ניסיוניים שונים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: יצירת מערכות ביולוגיות מתוקפות (רשתות ראייה שלמות) בעלות חדירות של צמתי פער (gap junctions) המתאימה לסריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- שחזוריות: מאפשרת פרוטוקולים סטנדרטיים של טעינת סמן ודיפוזיה תחת חשיכה קבועה, ובכך מפחיתה שונות הנובעת משינויים במוליכות המושרים על ידי אור.
- פלט כמותי: הפקת פרופילי עוצמת פלואורסצנציה שניתן לנרמל ולהתאים למודלים של דעיכה מעריכית לצורך השוואה בין תנאים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: תומך בחקירה של ויסות צירקדי רטינלי של צומתי פער (gap junctions), מנגנון הרלוונטי להפרעות בעיבוד חזותי.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב תיקוף המטרה (target validation) להמשכיות פרה-קלינית, על ידי מתן אפשרות להערכה עקבית של צימוד סומנים (tracer coupling) בתנאי אור/חושך.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק נתונים על השפעות של מודולטורים (למשל, אנטגוניסטים לקולטן D2) כדי לסייע בקבלת החלטות על המשך התקדמות (go/no-go) בהתבסס על ראיות למעורבות המטרה (target engagement).
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת השערות עבור מודולטורים של צומת פערים (gap junction) לפני זיהוי המולקולה המובילה (lead identification), כאשר התוצאים משפיעים ישירות על רמת הביטחון במטרה ועל ניתוח המסלולים.
- ביולוגיה של הגילוי (Discovery Biology): תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד השפעת ההארה וסוכנים פרמקולוגיים על דיפוזיה של סמנים דרך צמתי פער (gap junctions).
- סריקה (Screening): מספקת תכשירי רקמה מוכנים לבדיקה עם דיפוזיה מדידה של סמנים, ובכך תומכת בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות על צימוד עצבי.
- אנליטיקה (Analytics): מייצרת מדידות מכויילות של עוצמת פלואורסצנציה וקבועי מרחב המאפשרים השוואה סטטיסטית (למשל, T-test) של חוזק הצימוד בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי (Translational Research): מתחברת לעבודות פרה-קליניות על ידי מתן אפשרות להערכת ויסות הצימוד של סמנים על ידי השעון הרשתי ומחזורי אור/חושך, הרלוונטיים למודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני (Enterprise Reuse): מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר לחקר צימוד של צמתי פער בין סוגים שונים של נוירונים רשתיים ובמינים שונים, ובכך מפחיתה פיתוח שיטות כפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בתקשורת סינפטית חשמלית.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות תאורה מבוקרת ונהלי טעינת סמן סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לקבלת החלטות go/no-go מוקדמות יותר, המבוססות על נתונים כמותיים של מעורבות המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון על ידי אספקת נתונים אמפיריים על השפעות של מודולטורים תחת תנאים זמניים ופארמקולוגיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה של הרשתית, טיפול בחומרי סימון (tracers) ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית בתנאי חשיכה מבוקרים.
- תלוי במיכשור לחיתוך מיקרוסקופי, אינקובציה, דימיון קונפוקאלי וכימות פלואורסצנציה (למשל, ImageJ, Origin).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי תאורה, ריכוז חומרי הסימון ועומק החיתוך כדי להבטיח מדידות צימוד הניתנות לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הטכניקה על מערכות נוירונליות אחרות או מינים בעלי עובי רקמה וחדירות צומתי פער (gap junction) משתנים.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בחומרי סימון חדירים כגון neuro biotin ואת חוסר היכולת להעריך באופן ישיר סינפסות חשמליות שאינן מצומדות לחומרי הסימון.
