Name: Cut-טעינה: כלי שימושי לבחינת היקף Coupling צומת גאפ נותב בין הנוירונים רשתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: למדו את שיטת Cut-Loading לבחינת Coupling צומת גאפ בנוירונים רשתית באמצעות Neurobiotin. טכניקה זו מאפשרת חקר סינפסות חשמליות בתנאי תאורה מבוקרים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי NIH כדי להעניק EY005102 SCM ו EY018640 כדי החייאה

1. אינטקט הרשתית ההכנות העצבי, עכברים וארנבים דג זהב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל הפעולות הבאות, לרבות אלה שתוארו "טעינת-Cut 2)," תחת תאורה קבועה (רקע) הסביבה. שים לב למטרות פרוטוקול זה, ההליכים המתוארים ביצע כמו בחושך תמידי (כלומר תחת כהה מאוד (כלומר "scotopic") בתנאים ≤ 0.0001 לוקס) באמצעות משקפי אינפרא אדום לראיית לילה, אבל אחר רמות גבוהות יותר של עוצמת תאורה מפוזרת מתמיד ניתן להשתמש במקום כדי לקבוע את ההשפעה של רמות אחרות של תאורה מפוזרת על צימוד צומת הפער נותב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dark-להתאים את הניסוי בבעלי חיים (, דג זהב העכבר או ארנבת) במשך שעה לפחות 1 לפני הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שתואר קודם לכן 7, עמוק להרדים דגי זהב על ידי הצבת אותם tricaine methanesulfonate (MS222: 150 מ"ג / ליטר של מים שנאגרו (סודיום ביקרבונט המכילים) אקווריום), עמוק להרדים עכברים עם קטמין (100 מ"ג/ Kg, ip) ו rompun (10 מ"ג / ק"ג, ip). עמוק להרדים ארנבות עם urethane (טעינת מנה: 2.0 גרם / ק"ג, ip) וגם להשתמש בהרדמה מקומית intraorbital (2% Xylocaine), כפי שתואר לעיל 8. כל הליכי הניסוי לערב את הטיפול והשימוש בבעלי חיים צריכה להתבצע בהתאם להנחיות הפדרלי להיות נבדקה ואושרה על ידי טיפול בבעלי חיים באוניברסיטה המקומית וועדות להשתמש. (הערה:. בניסויים המתוארים כאן, כל הפרוצדורות הכרוכות בטיפול ושימוש דגים, עכברים וארנבים בוצעו בהתאם להנחיות NIH והיו נבדקה ואושרה על ידי אוניברסיטת אוהיו Animal Care מדינת מוסדיים ועדת שימוש) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכן, עכברים דגים וארנבות, בעקבות enucleation, להסיר את החלק הקדמי של גלגל העין לכל. ואז, במקום פיסת נייר פילטר על גבי החלק האחורי של העין להפוך את הנייר עין לסנן, כך נייר מסנן מתחת לחלק האחורי של העין. לאחר מכן, באמצעות קנסמלקחיים לנתח את הרשתית העצבית ללא פגע מן החלק האחורי של העין על ידי בעדינות קילוף האפיתל פיגמנט / דמית העין / בלובן העין, אשר מחוברים זה לזה, מן הרשתית העצבית, המצורף לעיתון הסינון. כפי שזה נעשה, לחתוך את עצב הראייה באמצעות קנס קפיץ מספריים. הרשתית העצבית, את מכוונת photoreceptor בצד, צריך עכשיו להיות מחוברים הנייר לסנן מופרדים משאר העין. </li></ol> 2. Cut-loading <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הרשתיות בתמיסת רינגר של חמצן (טבלה 1) בצלחת 6-באר (~ 5 מ"ל / היטב) למשך 30 דקות תחת קבוע הסביבה (רקע) תאורה (למשל תחת (כלומר "scotopic") בתנאים כהה מאוד) עם או בלי תרופה הבדיקה. שמור על הרשתית דגים מחומצן (5 CO% 2 / 95% O 2) ביקרבונט מבוססי Ringer של ב 22 ° C על ידי איטום צלחת 6-היטב עם parafilm ולשמור הרשתיות עכבר ארנב ב 36 מעלות צלזיוס CO 5% 2 / 95% O <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון נותב (בדרך כלל 100 μL) על ידי המסת neurobiotin (0.5%), מולקולה biotinylated, בתמיסה של Ringer מיד לפני חיתוך דרך הרשתית. שים לב כי 0.5% rhodamine dextran (גבוה (&gt; 10000) MW) ניתן להוסיף את הפתרון. בשל משקל מולקולרי גבוה, rhodamine dextran לא לחצות צמתים הפער רק תוויות תאים שניזוקו על ידי החתך. כפי שמוצג באיור. 3, זו דרך יעילה להבחין בין תאים שהצטברו neurobiotin כי הם נפגעו, מאלו צברו נותב על ידי דיפוזיה דרך צמתים הפער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פתרון neurobiotin על זכוכית (או פלסטיק) צלחת פטרי, הקש על נייר פילטר, שאליו מחוברת הרשתית, על מגבת נייר כדי להסיר עודפי רינגר, לטבול סכין גילוח (או סכין חדה אחרת) בפתרון neurobiotin וn לבצע חתך רדיאלי דרך הרשתית נייר פילטר. אם העדיף, מפרידי ניתן להשתמש כדי לחתוך נעשית דרך הרשתית, אבל לא את נייר הסינון. לחתוך צריכה להיות מכוונת בניצב לפני השטח הרשתית. טובלים את הסכין בפתרון neurobiotin שוב לחתוך את הרשתית בפעם השנייה. חזור על פעולה זו עד 4 חתכים לכל הרשתית (ראה איור. 1). השתמש במיקרוסקופ לנתח בעת ביצוע חתכים גילוח באמצעות העכבר הרשתיות קטנים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שמוצג באיור. 1, להטביע את הרשתית שוב בינוני Ringer של טרי, עם או בלי סמים הבדיקה, באמצעות 6-צלחת היטב (5 מ"ל רינגר / טוב). דגירה הרשתית במשך 15 דקות, כדי לאפשר טעינה דיפוזיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם בינוני Ringer של טרי עם או בלי סמים הבדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הרשתית עם paraformaldehyde 4% ב 0.1 M פוספט חיץ (PBS, pH 7.4) במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 0.1 מ PBS לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להגיב with 2% streptavidin-Alexa 488 (ריכוז סופי 10 מיקרוגרם / מ"ל) ב 0.1M PBS + 0.3% טריטון X-100, ולשמור לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם 0.1M PBS ב RT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב-PBS, ולנתק את הרשתית מנייר מסנן ולאחר מכן, בעזרת מברשת בסדר, המקום הרשתית, מעלה בכיוון photoreceptor בצד, על גבי שקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לעלות עם הרכבה בינונית Vectashield (וקטור מעבדות, Burlingame, CA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות עם לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal (למשל Zeiss 510 META) בשעה אותה רזולוציה הגדלה, והגדרות עבור כל תנאי הניסוי, כך שניתן להשוות את ההשפעות של תנאי הניסוי השונים (למשל תרופות הבדיקה; תנאי תאורה) על היקף הפער צומת נותב צימוד (איור 2A-C ו איור. 4A-C). אמנם תמונה אחת עשויה להכיל כל התאים שכותרתו, מומלץ לך לאסוף ערימה של Z-שטח של עניין ולכווץ אותו יחידהתמונה. </li></li></ol> 3. כימות צימוד נותב באמצעות ImageJ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדפדפן תמונה LSM, לפתוח את התמונה, לחץ על ייצוא ולשמור את התמונה קצת TIF-16 לא דחוס הקובץ. סרגל קנה מידה יש ​​לכלול תמונה TIF זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנה NIH ImageJ, למדוד עוצמת הקרינה של neurobiotin Alexa-488 שכותרתו מן הגדלה נמוכה תמונות של כל הר הרשתיות. פתח את הקובץ TIF באמצעות תוכנת ImageJ ואז לצייר קו ישר המקביל לסרגל סולם. עבור נתח, SET SCALE ולהזין את המרחק ידוע יחידת אורך, ולחץ על אישור. עכשיו תוצאות המדידה יכול להיות מוצג ביחידות מכויל, כגון מילימטרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את אזור עניין באמצעות הכלי בחירה מלבני. השיא של הקרינה צריך להיות מוצב על הגבול השמאלי של הבחירה שלך. ודא כי אין אות הקרינה ליד הגבול הנכון. אם לא, לסובב את התמונה פעיל (תמונה, ולאחר מכן סובב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץנתח ו PLOT פרופיל. אתה צריך לראות את עקומת עם דעיכה מעריכית משמאל לימין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על העתק בחלון הקופץ ולהדביק אותו ב-Excel. עכשיו אתם רואים שתי עמודות המראה את המרחק בין החתך (בעמודה השמאלית) ואת עוצמת הקרינה כפונקציה של המרחק לחתוך את (בעמודה הימנית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים כל ערך הקרינה גלם על ידי ערך הקרינה המרבית כדי להשיג את עוצמת הקרינה יחסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתקת שתי עמודות המתאים המרחק לחתוך את (X) לבין עוצמת הקרינה היחסית (Y), ולאחר מכן להדביק אותם לתוך תוכנת מקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fit עם הדעיכה המעריכית # 1 פונקציה (איור 2 ד ו איור 4D.), אשר היא בצורה: Y = 0 Y + Y מקסימום * exp (-x / λ) היכן Y הוא עוצמת הקרינה היחסית, Y o היא הקרינה רקע, Y מקסימום היא הקרינה היחסית המקסימלית, λ הוא spאס (אורך) קבוע, ו-x הוא המרחק בין החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה החלל קבוע (λ) ערכים על תנאי הניסוי השונים באמצעות מבחן t או ANOVA (2E איור איור ו. 4E). שים לב טכניקות חלופיות כימות תוארו על ידי אחרים 13,14. </li></ol> 4. נציג תוצאות דוגמאות מייצגות של נותב תא photoreceptor צימוד כפי שנקבע על ידי טעינת לחתוך מוצגים איורים 2 ו 3 (דגים) ו איור 4 (ארנבת). התמונות צולמו באמצעות Confocal באותן הגדרות להשוואה (איור 2A-C ו איור. 4A-C) את עוצמת הקרינה היה זממו כפונקציה של המרחק לחתוך את והתאים ידי הפונקציה המעריכית מוצג מס '3.8 לעיל (איור 2 ד ו איור. 4D). שטח ערכים קבועים עבור כל תנאימוצגים נתוני 2E וגם 4E, הממחישות כי היקף צימוד צומת הפער נותב ניתן לכמת באמצעות טכניקה לחתוך הטעינה. בנוסף, התוצאות הן מאוד לשחזור. השתמש בטכניקה לחתוך טעינת כאמצעי לכימות מידת צימוד צומת הפער נותב הוא תוקף גם על ידי הממצא כי עוצמת הקרינה פוחתת אקספוננציאלית כפונקציה של מרחק החתך בכל המקרים שנבדקו 7,8 (ראה גם תאנים. 2D ו 4D כאן), המציין כי neurobiotin נכנס photoreceptors דרך לחתוך את הסכין ולא מאתרים אחרים ברשתית. יתר על כן, דומה איכותית יום / לילה הבדל צימוד נותב photoreceptor תא שנצפתה דג זהב עם זריקות נותב לתוך הקונוסים יחיד עם טעינת לחתוך 7 ממחיש לחתוך טעינת כאמצעי מדויק יחסית למדוד את מידת צימוד photoreceptor. לחתוך-lטכניקה oading יכול לשמש גם כדי לחקור סוגים אחרים של סינפסות חשמל ברשתית. לדוגמה, איור 5 מדגים כי ארנבת מסוג (איור 5 א) ו-B-type (איור 5 ב) תאים אופקיים התערוכה הומולוגיים נותב צימוד הבא לגזור העמסה דיפוזיה של neurobiotin תחת כהה מותאם לתנאי. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תרכובת </td><td> דג </td><td> עכבר </td><td> ארנב </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 120 </td><td> 117 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 20 </td><td> 25 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> לאא 2 PO 4 </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2.5 </td><td> 5 </td><td> 3.1 </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td> - </td><td> 1 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> גלוטמין </td><td> - </td><td> 0.1 </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0.7 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: הרכב פתרונות של Ringer עבור עכבר דג זהב, ואת הרשתיות ארנב. ריכוזים מוצגים מ"מ. הפתרונות של Ringer הם מבעבע עם 5% CO 2 / 95% O 2 ומתוחזק על 22 ° C (דגים) או 36 ° C (יונקים). "-": לא כלול Ringer על מין זה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> איור 1:. תרשים זרימה המציג את ההליך לחתוך הטעינה. לאחר בידוד of הרשתית העצבית שלם, חתכים רדיאליים כמה נעשו על ידי להב כי היה טבול הראשון פתרון neurobiotin 0.5%. הרשתית הודגר לטעינת נותב ודיפוזיה, ורחץ אז לפני קיבוע עם paraformaldehyde 4% (PFA) ב 0.1M פוספט חיץ (PB). נותב צימוד נבדקה באמצעות streptavidin-Alexa מצומדות-488. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> באיור 2. יום ולילה ההבדל צימוד נותב photoreceptor ב דג זהב מתגלה על ידי טכניקה לחתוך הטעינה. הפער photoreceptor תא צומת neurobiotin צימוד נותב היה מקיף בלילה (ב) ו למחרת היישום של spiperone (10 מיקרומטר), קולטן דופמין סלקטיבית 2 D אנטגוניסט (ג), אבל לא היום בתנאים מלאה (A). ד) מנורמל עוצמת פלורסנט יחסית כפונקציה של המרחק מן הקיצוצים (מסומנת בחצים ב AC). ה) שטח קבוע valUES לקבל את הנתונים בניסויים אחרים D (n = 4). *** P &lt;0.001. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 3"> באיור 3. דוגמה מייצגת מראה הקרינה בשכבת התאים קולטי האור ברשתית כהה מותאם דגי זהב בלילה הבא לגזור טעינה עם פתרון של שתי neurobiotin ו rhodamine dextran. Rhodamine dextran (באדום), אשר אינו מפוזר דרך צומת לפתוח ערוצי פער בשל משקל מולקולרי גבוה (&gt; 10000 MW), רק תאים שכותרתו ליד החתך. לעומת זאת, neurobiotin (מוצג ירוק) מתפזרת דרך צמתים הפער ניתן לראות בתאים photoreceptor רחוק החתך. מיקום החתך מסומנת על ידי החץ בלוח אחד. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 4"> איור 4. יום ולילה שוניםence ב photoreceptor נותב צימוד ברשתית ארנב מתגלה על ידי טכניקה לחתוך הטעינה. הפער photoreceptor תא צומת neurobiotin צימוד נותב היה מקיף בלילה (ב) ו למחרת היישום של spiperone (10 מיקרומטר) (ג), אבל לא היום בתנאים מלאה (A). ב-AC, תצוגות בניצב השחזור 3D של photoreceptors ארנב ליד לחתוך מוצגים. ד) מנורמל עוצמת פלורסנט יחסית כפונקציה של המרחק מן הקיצוץ. E) ערכים שטח קבוע שהתקבלו הנתונים בניסויים אחרים D (n = 3). *** P &lt;0.001. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3180/3180fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 5"> איור 5. Cut-loading מגלה כי כהה מותאם תאים ארנב אופקי הם מצמידים נותב. שניהם סוג (A) ו-B-type (ב) בתאים אופקיים כהה מותאם הרשתיות ארנב הציג הומולוגיים צימוד neurobiotin נותב.

<ol><li>Bennett, M. V. L., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+coupling+and+neuronal+synchronization+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Electrical coupling and neuronal synchronization in the mammalian brain.</a> Neuron. 41, 495-511 (2004).</li>
<li>Connors, B. W., Long, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+synapses+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrical synapses in the mammalian brain.</a> Annu. Rev. Neurosci. 27, 393-418 (2004).</li>
<li>Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+diverse+types+of+retinal+neurons+show+tracer+coupling+when+injected+with+biocytin+or+Neurobiotin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Many diverse types of retinal neurons show tracer coupling when injected with biocytin or Neurobiotin.</a> Neurosci. Lett. 125, 187-190 (1991).</li>
<li>Bloomfield, S. A., Völgyi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+functional+roles+and+regulation+of+neuronal+gap+junctions+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The diverse functional roles and regulation of neuronal gap junctions in the retina.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 495-506 (2009).</li>
<li>Weiler, R., Pottek, M., He, S., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+coupling+between+retinal+horizontal+cells+by+retinoic+acid+and+endogenous+dopamine%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Brain.+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Modulation of coupling between retinal horizontal cells by retinoic acid and endogenous dopamine.</a> Brain. Res. Brain. Res. Rev. 32, 121-129 (2000).</li>
<li>Xin, D., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nitric+oxide+on+horizontal+cells+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effects of nitric oxide on horizontal cells in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 17, 799-811 (2000).</li>
<li>Ribelayga, C., Cao, Y., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+in+the+retina+controls+rod-cone+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The circadian clock in the retina controls rod-cone coupling.</a> Neuron. 59, 790-801 (2008).</li>
<li>Ribelayga, C., Mangel, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+circadian+clock-controlled+neural+pathway+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a circadian clock-controlled neural pathway in the rabbit retina.</a> PLoS One. 5, e11020-e11020 (2010).</li>
<li>Ouyang, X., Winbow, V. M., Patel, L. S., Burr, G. S., Mitchell, C. K., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Kinase+A+mediates+regulation+of+gap+junctions+containing+connexin35+through+a+complex+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Mol.+Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Protein Kinase A mediates regulation of gap junctions containing connexin35 through a complex pathway.</a> Brain. Res. Mol. Brain. Res. 135, 1-11 (2005).</li>
<li>Patel, L. S., Mitchell, C. K., Dubinsky, W. P., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gap+junction+coupling+through+the+neuronal+connexin+Cx35+by+nitric+oxide+and+cGMP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Commun.+Adhes%22%5BJournal%5D)">Regulation of gap junction coupling through the neuronal connexin Cx35 by nitric oxide and cGMP.</a> Cell. Commun. Adhes. 13, 41-54 (2006).</li>
<li>Peters, J. L., Cassone, V. M., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+modulates+intercellular+communication+among+cultured+chick+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin modulates intercellular communication among cultured chick astrocytes.</a> Brain. Res. 1031, 10-19 (2005).</li>
<li>Cusato, K., Bosco, A., Rozental, R., Guimarães, C. A., Reese, B. E., Linden, R., Spray, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+mediate+bystander+cell+death+in+developing+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gap junctions mediate bystander cell death in developing retina.</a> J. Neurosci. 23, 6413-6422 (2003).</li>
<li>Li, H., Chuang, A. Z., O'Brien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+coupling+is+controlled+by+connexin+35+phosphorylation+in+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor coupling is controlled by connexin 35 phosphorylation in zebrafish retina.</a> J. Neurosci. 29, 15178-15186 (2009).</li>
<li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+tracer+movement+through+homologous+gap+junctions+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The kinetics of tracer movement through homologous gap junctions in the rabbit retina.</a> Vis. Neurosci. 15, 765-777 (1998).</li>
<li>Mills, S. L., Massey, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+biotinylated+tracers+distinguishes+three+types+of+gap+junction+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A series of biotinylated tracers distinguishes three types of gap junction in retina.</a> J. Neurosci. 20, 8629-8636 (2000).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה לגזור טעינת המתוארת כאן היא טכניקה יעילה וישירה על מנת לקבוע את מידת צימוד צומת נותב הפער בין הנוירונים ברשתית בתנאי תאורה שונים בזמנים שונים של היום והלילה. היתרונות של שיטה זו כוללים את היכולת לכמת את מידת צימוד צומת הפער נותב בין הנוירונים ברקמת הרשתית שלם תחת מגוון רחב של תנאי תאורה במהלך היום והלילה ולעשות זאת עבור נוירונים יחד, כי יש somata בקוטר קטן. מגבלות השיטה בחקר צמתים הפער בסתיו רקמות שלמות לשתי קטגוריות כלליות. ראשית, דיפוזיה נותב דרך צמתים הפער פתוח עלול להיות קשה יחסית להבחין בשל קוטר) קטן או תשלום הקשורים הערוצים פתוחים ב) כרכים היחסי של תאים סלולריים בשילוב 1,14,15. כלומר, דיפוזיה נותב מתא לתא קטן גדול או קבוצת תאים יחד, compared דיפוזיה נותב מתא לתא גדול יותר, עשוי להיות קשה יותר לזהות עקב דילול נותב. שנית, תחת כמה תנאים פיזיולוגיים, היקף דיפוזיה נותב דרך צמתים הפער רקמות שלמות לא יכול לשקף במדויק את עוצמת מוליכות הפער junctional בשל ההבדלים המוליכות של קטן הנוכחי נושאת יונים חשמליים, לעומת חדירות של נותב גדול יחסית מולקולות 1,14,15. ככלל, עדות נותב צימוד מראים נוכחות, תפקוד ערוצי פער פתוח בצומת, אך תחת כמה תנאים פיזיולוגיים, דיפוזיה נותב לא יכול להתרחש או לצפות למרות הקלטות אלקטרו מצביעים על נוכחות של, מתפקד צמתים לפתוח פער. סביר להניח כי הטכניקה לחתוך טעינת יכול לשמש גם כדי לחקור את מידת צימוד צומת הפער נותב בין הנוירונים ברקמות שלמות מאזורים אחרים של sys העצבים המרכזיתTEM.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Tricaine sulfonate מתאן (MS222) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td><td> 150 מ&quot;ג / ליטר של מים שנאגרו אקווריום </td></tr><tr><td> Urethane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U2500 </td><td> 2 גר &#39;/ מנה kgloading </td></tr><tr><td> Tube Dual Night Vision goggle </td><td> לילה אופטיקה ארה&quot;ב </td><td> D-221 </td><td></td></tr><tr><td> נייר סינון, מס &#39;4 כיתה </td><td> Whatman </td><td> 1004-090 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים בסדר, דומון מס &#39;5, Biologie, 11 ס&quot;מ </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11295-10 </td></tr><tr><td> מספריים בסדר, קפיץ, 8 מ&quot;מ להב, ישר </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 15025-10 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Neurobiotin </td><td> וקטור </td><td> SP-1120 </td><td> 0.5% </td></tr><tr><td> Streptavidin-מצומדות אלכסה 488 </td><td> Invitrogen </td><td> S11223 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Dextran rhodamine (גבוה (&gt; 10000) MW) </td><td> Invitrogen </td><td> D1817 </td><td> 0.5% </td></tr><tr><td> Vectashield בינוני הרכבה </td><td> וקטור </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Zeiss 510 META לייזר סריקת מיקרוסקופ Confocal </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM-5 תמונה דפדפן 3,2,0,115 </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ תוכנה </td><td> NIH </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OriginPro 8.0 </td><td> OriginLab קורפ </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cut-טעינה: כלי שימושי לבחינת היקף coupling צומת גאפ נותב בין הנוירונים רשתית

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

בנוסף לשידור כימיים הסינפטי, נוירונים המחוברים על ידי צמתים הפער יכול גם לתקשר במהירות באמצעות העברה סינפטית חשמל. הגדלת הראיות עולה כי הפער לא רק בצמתים היתר זרימת זרם חשמלי ופעילות סינכרונית בין תאים או בשילוב ביניהם, אך כי כוח או היעילות של תקשורת בין תאים חשמליים בשילוב יכול להיות מווסתת על 1,2 במידה רבה. בנוסף, קוטר פנימי גדול (~ 1.2 ננומטר) של ערוצים רבים צומת הפער היתרי לא רק לזרום זרם חשמלי, אלא גם דיפוזיה של מולקולות איתות תאיים ומטבוליטים קטן בין תאים מחוברים, כך צמתים הפער עשוי גם לתווך תקשורת מטבוליים וכימיים . עוצמתה של התקשורת junctional הפער בין נוירונים אפנון על ידי נוירוטרנסמיטורים וגורמים אחרים ניתן ללמוד בו זמנית על ידי חשמלית הקלטה מתאי יחד ועל ידי קביעת tהוא מידת דיפוזיה של מולקולות נותב, שהן צומת הפער חדיר, אבל לא קרום חדיר, בעקבות הזרקת iontophoretic לתוך תאים בודדים. עם זאת, נהלים אלה יכול להיות קשה מאוד לביצוע על נוירונים עם somata קטן רקמה עצבית ללא פגע. מחקרים רבים על הסינפסות חשמל אפנון התקשורת חשמל נערכו ברשתית חוליות, שכן כל אחד מחמשת סוגי נוירונים ברשתית מחובר חשמלית על ידי הפער צמתים 3,4. ראיות הגדלת הראו כי שעון היממה (24 שעות) ברשתית ושינויים גירוי האור להסדיר צומת הפער מצמד 3-8. לדוגמה, העבודה האחרונה הוכיחה כי שעון היממה רשתית פוחתת צומת הפער צימוד בין מוט ותאי קונוס photoreceptor במהלך היום על ידי הפעלת קולטן דופמין הגדלת D2 ו מגדילה באופן דרמטי את מוט חרוט צימוד בלילה על ידי צמצום הפעלת הקולטן D2 <sup&gt; 7,8. עם זאת, לא רק את המחקרים הללו קשה מאוד לבצע על נוירונים עם somata קטן ברקמת הרשתית העצבית שלם, אבל זה יכול להיות קשה לשלוט באופן הולם את תנאי התאורה במהלך המחקר אלקטרו של נוירונים ברשתית יחיד להימנע אור-Induced שינויים צומת הפער המוליכות. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לקבוע את מידת צימוד צומת נותב הפער בין הנוירונים ברשתית בתנאי תאורה שונים, בזמנים שונים של היום והלילה. זו טכניקה לחתוך טוען הוא שינוי של טעינת לגרד 9-12, אשר מבוססת על טעינת דיפוזיה לצבוע בערוצים צומת לפתוח פער. טעינת לגרד עובד היטב בתאים בתרבית, אך לא פרוסות עבות כגון הרשתית ללא פגע. הטכניקה לחתוך טעינה נעשה שימוש כדי ללמוד צימוד photoreceptor בדגים שלמים הרשתיות יונקים 7, 8,13, וניתן להשתמש בו כדי ללמוד צימוד ביןנוירונים אחרים ברשתית, כפי שתואר כאן.

השיטה קלה ונוחה, כדי לקבוע את מידת צימוד צומת הפער נותב בין הנוירונים ברשתית מתואר. טכניקה זו מאפשרת לחקור את הפונקציה של סינפסות חשמליות בין הנוירונים ברשתית שלמים בתנאי תאורה שונים, בזמנים שונים של היום והלילה.

Cut-טעינה: כלי שימושי לבחינת היקף Coupling צומת גאפ נותב בין הנוירונים רשתית

בנוסף להעברה סינפטית כימית, נוירונים המחוברים באמצעות צממתי פער (gap junctions) יכולים לתקשר במהירות גם באמצעות סינפסה חשמלית...

המטרה הכללית של ניסוי טעינת החיתוך הבא היא לבחון את מידת הצימוד של סמן (tracer) דרך צמתי פער (gap junctions) בין נוירונים ברשתית שלמה תחת תנאי תאורה מבוקרים. השלב הראשון משיג זאת על ידי חיתוך רשתית עם להב חד טבול בתמיסת neuro biotin, מולקולת סמן שיכולה להתפשט דרך תעלות פתוחות של צמתי פער, אך לא דרך ממברנות של תאים. בשלב השני, הרשתית עוברת אינקובציה בתמיסת Ringer, המאפשרת דיפוזיה של הסמן דרך תעלות פתוחות של צמתי פער.אם הצימוד דרך צמתי פער (gap junction) הוא חלש, הפלואורסצנציה של ה-neuro biotin תהיה מוגבלת לנוירונים רטינליים הנמצאים בקרבת החתך. לעומת זאת, אם הצימוד דרך צמתי הפער הוא חזק, הפלואורסצנציה תגלה בנוירונים רטינליים הרחוקים מהחתך. היתרון המרכזי של שיטת טעינה באמצעות חתך (cut loading) על פני טכניקות קיימות הוא שקל יותר לבצעה בנוירונים בעלי גוף תא קטן ברקמה רטינלית עצבית שלמה.קל יותר לשלוט בתנאי התאורה במהלך טעינת החתכים מאשר במהלך מחקר אלקטרופיזיולוגי של נוירונים בודדים ברקמת רשתית שלמה. מכיוון שגירויי האור המשמשים במהלך ההקלטה החשמלית יכולים בעצמם להוביל לשינויים בצימוד של צמתי הפער (gap junction coupling), הטכניקה תודגם על ידי ד"ר Chu Choi, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. בהליך זה, דג זהב נשמר בחשיכה מוחלטת במהלך היום למשך שעה אחת לפחות לפני הניתוח, וכל השלבים הבאים עד לקיבוע רקמת הרשתית מבוצעים גם הם במהלך היום בחשיכה מוחלטת; הרדמו את דג הזהב עמוקות על ידי הוספת 150 milligrams per liter של methane sulfonate למי האקווריום.לאחר מכן, יש להקריב את דג הזהב בהתאם להנחיות הפדרליות והאוניברסיטאיות ולהוציא את גלגלי העיניים בזהירות. בשלב הבא, הסירו את החלק הקדמי של כל גלגל עין. לאחר מכן, הניחו פיסת נייר סינון על החלק האחורי של העין והפכו את נייר הסינון ואת העין כך שנייר הסינון יהיה מתחת לחלק האחורי של העין.כעת, הסר בעדינות את החלק האחורי של העין, כולל הסקלרה (קשתית) ואפיתל הפיגמנט, מהדג זהב שהותאם לחושך. גזור את העצב האופטי של הרשתית באמצעות מספרים עדינים. את רשתית דג הזהב העצבית, כאשר צד הפוטורצפטורים פונה כלפי מעלה, יש להצמיד כעת לנייר סינון לפני הוצאת העין, בעוד הדג נמצא תחת הרדמה ב-5 mL של תמיסת רינגר מבוססת פחמות מחומצנת, עם או בלי תרופה לבדיקה, בכל באער של פלטת 6 באערים, לאחר הפרדת הרשתית העצבית השלמה מהחלק האחורי של העין.העבירו את הרשתיות לבארות בתנאי חשיכה קבועה. לאחר מכן, אטמו את הבארות באמצעות פאראפורם והניחו לרקמה להדגירה למשך 30 דקות. הכינו 100 µL של תמיסת סמן על ידי המסת 0.5% neuro biotin בתמיסת רינגר מיד לפני החיתוך של הרשתית.בשלב הבא, העבירו את תמיסת ה-neuro biotin לצלוחית פטרי מזכוכית. לאחר מכן, הקישו בעדינות על נייר הסינון שאליו מחוברת הרשתית על גבי מגבת נייר. כדי להסיר שאריות של תמיסת ringers, טבלו להב תער תמיסת neuro biotin ובצעו חיתוך רדיאלי בניצב דרך הרשתית ונייר הסינון.לאחר מכן, טבול את להב התער בינוביוטין (neuro biotin) שוב וחתור ברשתית פעם שנייה. חזור על פעולה זו עד לארבעה חתכים לכל רשתית. בשלב זה, העבר את הרשתית לתמיסת רינגר (ringers) טרייה, מצע עם או בלי התרופה הנבדקת, למשך 15 דקות כדי לאפשר טעינה ודיפוזיה.שטוף זאת שלוש פעמים בתוכלי רינגר (ringers) רעננים, עם או בלי התרופה הנבדקת, למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, קבע את הרשתית באמצעות 4% para formaldehyde בתמיסת בופר פוספט 0.1 molar בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר מכן, שטוף את הרשתית ב-0.1 molar PBS למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס על ידי הנחתה במקרר עד ליום למחרת.הגבו את הרשתית עם 2% streptavidin Alexa 4 88 ב-0.1 molar PBS ו-0.3% Triton X 100 לריכוז סופי של 10 micrograms per milliliter, והדגרירו למשך לילה בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius. למחרת, שטפו את הרשתית שלוש פעמים עם 0.1 molar PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בכל פעם.הפרידו את הרשתית מנייר הסינון ב-PBS. לאחר מכן, באמצעות מברשת עדינה, העבירו את הרשתית לשקף עם מדיום קיבוע מסוג vector shield, כאשר צד הפוטורצפטורים פונה כלפי מעלה. העבירו את השקף למיקרוסקופ קונפוקלי סורק בלייזר וצלמו תמונות באותה רזולוציית הגדלה והגדרות עבור כל תנאי ניסוי, כדי שניתן יהיה להשוות את השפעותיהם של תנאי ניסוי שונים על מידת הצימוד של הסמן התפקודי במרווחים (gap functional tracer coupling).להלן היקף הצימוד של סמן תאי פוטורצפטורים במהלך היום בחשיכה קבועה, בהשוואה ליום בחשיכה קבועה בנוכחות של מעכב סלקטיבי של קולטן דופמין D2. שימו לב שהחתך של התער בשני התמונות נמצא משמאל. למרות שתמונה אחת עשויה להכיל את כל התאים המסומנים, מומלץ לאסוף Z-stack של האזור הרלוונטי ולמזג אותו לתמונה אחת כפי שמוצגת.כאן מוצג היקף הצימוד של סמן תאי פוטורספטורים בעת תנועה רצופית דרך נתח Zack כזה. שימו לב כי החיתוך של התער בבבדירה זו נמצא מימין. כדי לכמת את היקף צימוד הסמן בדפדפן תמונות ה-LSM, פתחו את התמונה, לחצו על export ושמרו את התמונה כקובץ TIF 16 bit לא דחוס; יש לכלול סרגל קנה מידה בתמונת TIFF זו באמצעות תוכנת NIH image J.מדוד את עוצמת הפלואורסצנציה של neuro biotin המסומן ב-Alexa 488 מתמונות בהגדלה נמוכה של רשתות עיניים המעוגנות כשלמות (hole mount). פתח את קובץ ה-TIFF באמצעות תוכנת Image J ולאחר מכן שרטט קו ישר התואם לסרגל המقياس (scale bar). לאחר מכן, עבור ל-analyze, בחר ב-set scale, והזן את המרחק הידוע ואת יחידת האורך.לאחר מכן לחצו על אישור. כעת ניתן להציג את מדידות הפלואורסצנציה ביחידות מכויילות כגון מילימטרים. לאחר מכן, בחרו את האזור הרלוונטי באמצעות כלי הבחירה המלבני.יש למקם את שיא הפלואורסצנציה בגבול השמאלי של הבחירה. ודאו שאין אות פלואורסצנציה ליד הגבול הימני. לחצו על analyze and plot profile עבור נתוני בקרת היום שהתקבלו בחשיכה קבועה.עקומה בעלת דעיכה מעריכית מוצגת משמאל לימין. לאחר מכן, לחצו על copy בחלון הקופץ והדביקו אותה ב-Excel. כעת מופיעות שתי עמודות, אחת המציגה את המרחק מהחתך והשנייה המציגה את עוצמת הפלואורסצנציה כפונקציה של המרחק מהחתך.לצורך השוואה, השלבים לעיל חוזרים על עצמם עם נתונים שהתקבלו בחשיכה רציפה במהלך היום. בנוכחות spit bro, חלקו כל ערך פלואורסצנציה גולמי בערך הפלואורסצנציה המקסימלי כדי לקבל את עוצמת הפלואורסצנציה היחסית. העתיקו שתי עמודות המתאימות למרחק מהחתך ולעוצמת הפלואורסצנציה היחסית, ולאחר מכן הדביקו אותן בתוכנת origin.שלבים אלו מוצגים הן עבור בקרת היום והן עבור יריקת היום. נתונים שהורצו בנקודה זו מתאימים את התוצאות לפונקציית דעיכה מעריכית מספר אחת, והשוואת ערכי קבוע המרחב בתנאים ניסויים שונים מבוצעת באמצעות T-test או Inova.פונקציות מעריכיות וניתוחים סטטיסטיים של נתוני ביקורת בזמן היום, נתוני pip rone בזמן היום, ונתוני ביקורת בזמן הלילה מוצגים לצורך השוואה. מוצגות כאן דוגמאות להיקף הצימוד של חומר מעקב (tracer) בתאי פוטורספטור ברשתית של דג זהב המותאם לחושך ביום A, בלילה B, ובמהלך היום בנוכחות של one, אנטגוניסט סלקטיבי לקולטן דופמין D two, כפי שנחשף באמצעות טכניקת ה-cut loading. כל תמונות הקונפוקאל צולמו באמצעות אותן הגדרות לצורך השוואה.בגרף זה, עוצמת הפלואורסצנציה עבור שלושה תנאים ניסיוניים מוצגת כפונקציה של המרחק מהחתך ומותאמת באמצעות פונקציה מעריכית. טכניקת טעינת החתך (cut loading) משמשת לכימות מידת הצימוד של סומני צמתי פער (gap junctional tracer coupling) על ידי חישוב ערכי קבוע המרחב, כפי שמוצג כאן עבור שלושה תנאים ניסיוניים. ניתן להשתמש בטכניקת טעינת החתך גם כדי לחקור סינפסות חשמליות בין סוגי תאים אחרים ברשתית ובמינים אחרים.לדוגמה, שתי איורים אלה ממחישים כי תאי אופקיים מסוג A ומסוג B בארנבת מראים צימוד של סמן הומולוגי בעקבות טעינה בחיתוך (cut loading) ודיפוזיה של neuro biotin בתנאי הסתגלות לחושך. השתמשנו בטכניקת הטעינה בחיתוך כדי לבחון את היקף דיפוזיית הסמן דרך צמתי הפער (gap junctions) בין הפוטו-רצפטורים מסוג rods ו-cones ביום ובלילה. בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לקבוע האם הצימוד של סמנים בין נוירונים רטינליים אחרים נשלט על ידי השעון הרטינלי ו/או על ידי תנאי אור וחושך ספציפיים.ניתן להשתמש בו גם כדי לחקור צימוד של סמנים (tracer coupling) בין נוירונים באזורי מוח אחרים.

cut-loading-useful-tool-for-examining-extent-gap-junction-tracer

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

מאמר זה מתאר את ההקלטה של ​​תאים בודדים מאוכלוסיות העצבית מתויג fluorescently ברשתית עכבר ללא פגע. באמצעות שני הפוטונים עירור בתאי אינפרא אדום שכותרתו transgenetically היו מטרה הקלטה תיקון-clamp ללמוד לאור התגובות שלהם, מאפייני שדה פתוח, ומורפולוגיה.

אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

פרוטוקולי אימונוהיסטוכימיה משמשים ללמוד את הלוקליזציה של חלבון מסוים ברשתית. טכניקות הדמיה סידן מועסקות ללמוד דינמיקת סידן בתאי הגנגליון ברשתית והאקסונים שלהם.

שיטות הדמיה אימונוהיסטוכימיים וסידן בWholemount עכברוש הרשתית

מצגת זו מדגימה שיטה לפיה אלקטרופורציה של תאים דבקים ומתורבתים משמשת לחקר תקשורת בין-תאית, צומתית, בעוד התאים גדלים על שקופית המצופה בתחמוצת אינדיום-בדיל מוליכה ושקופה.

Assay פונקציונלי לגאפ junctional בחינה; Electroporation של תאים חסידים על אינדיום הבדיל-אוקסיד

פרוטוקול זה מתאר טכניקה העברה לצבוע אזמל-ניאון טעינת מודד תקשורת בין תאית בערוצי צומת פער. תקשורת בין תאית גאפ junctional היא תהליך הסלולר עיקרי שבאמצעותו הומאוסטזיס רקמות מתוחזק שיבוש איתות התא הזה יש השפעות בריאותיות שליליות.

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע הקלטת תיקון מהדק כל תא על נוירונים ברשתית מן הכנת שטוח הר.

צמד תיקון הקלטה של ​​תאי הקרנות amacrine בתוך הכנת שטוח הר Deafferentated רשתית העכבר

כאן, אנו מתארים שיטה לטעינת צבע סידן רגיש דרך גדם העצב הצפרדע לתוך קצות העצבים. כמו כן, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת וניתוח של טרמינטים סידן מהיר בקצות העצבים ההיקפיים.

טעינת צבע סידן לתוך צפרדע עצב צפרדע דרך גדם עצב: סידן חולף הרשמה צפרדע Neuromuscular צפרדע

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את הארגון של רשתות astrocytic. השיטה המתוארת ממזער הטיה לספק מדדים תיאוריים של רשתות אלה כגון ספירת תאים, גודל, שטח, מיקום בתוך גרעין. . בנוגע למקורו שקובעת עם ניתוח וקטורי.

ניתוח של גודל, צורה, כיוון של רשתות של האסטרוציטים בשילוב

כאן אנו מציגים פרוטוקול סידן התמונה איתות באוכלוסיות של סוגי תאים בודדים באזור צומת עצב-שריר מאתר.

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

כאן, אנו מציגים עבור הרומן הפער צומת תקשורת המערכת assay המיועד להקרנה תפוקה גבוהה של הפער להתכוונן צומת כימיקלים גילוי תרופות רעילות הערכת פרוטוקול.

Assay תקשורת צומת-המערכת יודיד-צהוב הניאון חלבון-Gap

עבודה זו מציגה תכשיר רשתית שטוח חלופי שבו הסרת גופי תאים קולטי אור מאפשרת פיזור נוגדנים מהיר יותר וגישה משופרת של פיפטת טלאי לנוירונים ברשתית הפנימית לצורך אימונוהיסטוכימיה, הכלאה באתרו וניסויים אלקטרופיזיולוגיים.

רשתית מפוצלת כהכנה שטוחה משופרת לחקר נוירונים בשכבה גרעינית פנימית ברשתית בעלי חוליות

למדו את שיטת Cut-Loading לבחינת Coupling צומת גאפ בנוירונים רשתית באמצעות Neurobiotin. טכניקה זו מאפשרת חקר סינפסות חשמליות בתנאי תאורה מבוקרים.

Cut-טעינה: כלי שימושי לבחינת היקף Coupling צומת גאפ נותב בין הנוירונים רשתית

גלה סרטונים נוספים