Name: הרחבת דם היקפיים האדם γδ T תאים באמצעות Zoledronate (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: למד הרחבה בקנה מידה גדולה של תאי T γδ מדם היקפי באמצעות זולדרונט ו-IL-2 לטיפול אימונותרפיה בסרטן. השיטה משתמשת בצנטריפוגה מדירה וזרימה ציטומטריה לאפיון תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. בידוד של PBMC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקיז דם (7.5-8.0 מ"ל) לתוך Tube Vacutainer BD CPT תא הכנה עם הפרין סודיום. הצינור מכיל נתרן קרישה הפרין ו נוזל Ficoll-Hypaque צפיפות, בתוספת ג'ל פוליאסטר המחסום, המפריד בין שני נוזלים. צנטריפוגה שפופרת / דם מדגם בטמפרטורת החדר (18 ° C עד 25 ° C) של הרוטור אופקי (נדנדה-out ראש) במשך 20 דקות ב 1800 x גרם. החלף צנטריפוגות את הבלמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, את רצף השכבות מתרחשת כדלקמן (ראה מלמעלה למטה): א) פלזמה - ב) בתאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMC) וטסיות - ג) פתרון צפיפות - ד) ג'ל פוליאסטר - ה) גרנולוציטים - ו) כדוריות דם אדומות (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף שבריר של שכבת פלזמה, עוזב 5-10 מ"מ של פלזמה מעל שלבי הביניים מבלי להפריע את שכבת התאים. פלזמה יכולה לשמש תרבות (סעיף 2.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר שבר מועשר (PBMC) בשעה שלבי הביניים עם טפטפת והעברת צינור חרוטי 15 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את PBMC עם 10 מ"ל של בופר פוספט (PBS), על ידי צינור היפוך 5 פעמים, ולאחר מכן צנטריפוגות 5 דקות ב 400 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים כביסה פעמיים, ולאחר מכן resuspend גלולה תא 5 מ"ל של PBS. קבע את מספר התא. בדרך כלל 1.3 x10 6 תאים התאושש 1 מ"ל של דם מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את תדירות הפנוטיפ של תאים T γδ ב PBMC ידי cytometry זרימה (סעיף 3) (איור 2). </li></ol> 2. הרחבת γδ ותאי T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השעיות תא 15 צינורות חרוטי מ"ל במשך 5 דק 'ב 400 x g בטמפרטורת החדר, וזורקים supernatants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני תרבות (CM) על ידי הוספת IL-2 האנושי (IL-2) ו zoledronate (Zometa) לריכוזים האחרון של 1000 IU / מ"ל ​​ו - 5 מיקרומטר, בהתאמה. ALyS203 (Cell Science &amp; Technology Institute) או OpTmizer (Invitrogen) תמיכה בתקשורת הרחבה טובה של γδ ותאי T (מידע נוסף הפניות 6 ו - 9). Zometa מסופק בצורת נוזל (4 בקבוקון mg/5-ml). כדי להכין פתרון 5 מיקרומטר, הוסף 50 μl של Zometa עד 30 מ"ל של מדיום תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה במדיום תרבות להסתגל 1x10 6 תאים / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 1 מ"ל של CM המכיל 1x10 6 תאים לתוך הבאר כל צלחת 24 באר. עבור בקנה מידה גדול תרבויות, תאים יכולים להיות seeded ב 0.5 x 10 6 תאים / 2 ס"מ על פי שטח פנים של בארות צלחת, צלחת או בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פלזמה עצמיים (סעיף 1.3), אספו אדם א.ב. סרה, או FCS כך הוא כ 10% מנפח של התרבות (100 μl גם עבור כל צלחת 24 באר). מניחים את הלוחות humidified 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 24-48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על תרבות בצפיפות תא של 0.5-2 x 10 6 תאים / מ"ל. הוסף בינוני טרי המכיל IL-2 אנושי (1000 IU / ml) בלבד (ללא Zometa) כל 2-3 ימים, העברת תאים בתרבית לתוך בארות חדשות או צלוחיות לפי הצורך, בהתאם למידת התפשטות תאים (איור 3). אספקת פלזמה או בסרום עד בינוני, כך ריכוז בסרום יכול להישמר לפחות 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים ביום 12-14 ולקבוע את תדירות, פנוטיפ, פונקציות של תאים T γδ ידי cytometry זרימה (ראה להלן). </li></ol> 3. ניתוח פנוטיפי על ידי זרימת cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 200 דגימות μl המכיל 2 x 10 5 תאים מיון הקרינה המופעל תאים (FACS) צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ"ל PBS קר ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 x גרם. ואז, resuspend את כדורי במאגר FACS 50 μl (PBS + 1% אזיד הנתרן FCS + 0.1%). הוסף 5 μl של נוגדנים לכל דגימות (נוגדנים חד שבטיים מפורטים טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על הקרח בחושך במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ 2 מ"ל FACS לטעום כל, ולאחר מכן מערבולת. צנטריפוגה דגימות דקות ב 400 x 5 גרם ב 4 ° C. בזהירות למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים חיץ 300 FACS מערבולת μl ו. ניתוח דגימות על cytometer זרימה (איור 2). </li></ol> 4. IFN-γ ייצור assay 10 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני assay, להכין ממריץ תאים על ידי 3-5 culturing x10 5 תאים Daudi / מ"ל במדיום 1640 RPMI FCS בתוספת 10% (RPMI-10) לילה עם Zometa (5 מיקרומטר) (להלן המיועד Z-Daudi). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף Z-Daudi ו resuspend ב RPMI-10 ב 2x10 6 תאים / מ"ל. הוסף 100 μl של Z-Daudi (2x10 5) היטב כל צלחת סביב תחתית 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בתאי T γδ ב 2x10 6 תאים / מ"ל RPMI-10 המכיל Brefeldin ב 20 מיקרוגרם / מ"ל. העברת 100 μl של השעיה T γδ תא (2x10 5) זה Z-Daudi התאים היטב המכיל או לשלוט בארות (100 μl של RPMI-10 בלבד, או RPMI-10 עם 20 ng / ml של phorbol 12-13-myristate אצטט[PMA] פלוס 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​של ionomycin). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. דגירה של 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת דקות ב 400 x 5 גרם ב 4 ° C ו resuspend את כדורי ב μl 200 של קר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות צינורות FACS. הוסף 4 מ"ל של קר PBS ו צנטריפוגות צינורות דקות ב 400 x 5 גרם ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורי ב 50 μl של חיץ FACS עם FITC-מצומדות אנטי TCRVγ9 (5 μl) ו PE/Cy5-conjugated אנטי CD3 מב (2.5 μl). דגירה מוגן מפני אור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של מגיב IntraPrep 1 ו דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 4 מ"ל של PBS על צינור כל צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 x g בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant על ידי שאיפה ולהוסיף 100 μl של 2 מגיב IntraPrep. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר בלי לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של PE-מצומדות אנטי IFN-γ מב אל המבחנה. דגירה מוגן מפני אור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ"ל של PBS על צינור כל צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 400 x g בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ידי השאיפה ואת resuspend התא גלולה ב 0.5 מ"ל של חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התאים על ידי זרימה cytometer. שער על CD3 + + TCRVγ9 תאים לבחון את הביטוי של IFN-γ (איור 4). </li></ol> 5. נציג תוצאות: חשוב לקבוע את אחוז בתאי T γδ ב PBMC ב חניכה של התרבות. כפי שמוצג באיור. 2 אחוז CD3 + + TCRVγ9 γδ בתאי T ב PBMC היה 1.6% ביום 0. האוכלוסיות היו דומיננטיים CD27 + + CD45RA נאיבי או CD27 + CD45RA - פנוטיפים הזיכרון המרכזי. כאשר γδ בתאי T היו מגורה בצורה יעילה, הם יצרו צבירים בימים 3-5 (איור 3 A ו-B). כאשר היווצרות אשכול התעכבה, את הצמיחה של תאים מסוגים אחרים, כגון CD4 + או CD8 + αβ בתאי T או תאים NK יכול להשתלט על הצמיחה של γδ ותאי T (איור 3 C ו-D). לאחר 14 ימים של תרבות, תדירות γδ בתאי T עלה ל 93.8% יותר מאשר של תאים בתרבית γδ תרבויות מוצלח תא T (איור 2 E). תאים בתרבית T γδ NKG2D שהוגברו ו CD69 הביטוי (איור 2 G ו-H). הם מוצגים CD27 - CD45RA - פנוטיפ זיכרון מפעיל (איור 2 F). הפונקציות של γδ בתאי T הוערכו לגבי ייצור ציטוקינים ו cytotoxicity. IFN-γ תאיים מכתים הוכיח כי γδ המיוצר בתאי T IFN-γ בתגובה PMA / ionomycin טיפול או Z-Daudi תאים IPP שנצבר לאחר הטיפול zoledronate (איור 4). תוצאות אלו מצביעות כי zoledronate ביעילות לעורר ולהרחיב פונקציונלי בתאי T γδ. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שפופרת </td><td> FITC </td><td> PE </td><td> ECD </td><td> PE/Cy5 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> CD3 </td><td> CD19 </td><td> CD45 </td><td> CD14 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> CD3 </td><td> TCRαβ </td><td> CD4 </td><td> CD8 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> CD3 </td><td></td><td></td><td> CD56 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> TCRαβ </td><td> CD45 </td><td> CD3 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> NKG2D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> CD69 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 7 </td><td> TCR Vγ9 </td><td> עכבר IgG1 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 8 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> CD45RA </td><td> CD27 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> TCR Vγ9 </td><td></td><td> עכבר IgG1 </td><td> עכבר IgG1 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. נוגדנים חד שבטיים משמשים מכתים ססגוניות של תאים T γδ. דוגמה לניתוח פנוטיפי של תאים T γδ שבוצעו במעבדה שלנו מוצג באיור. 2. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ההפרדה של PBMC. דם (7.5-8.0 מ"ל) נשאבים לתוך Tube Vacutainer BD CPT תא הכנה עם הפרין סודיום ו centrifuged ישירות עבור 20 דקות ב 1800 x גרם. לאחר צנטריפוגה, שכבות וכתוצאה מכך כפי שניתן לראות מלמעלה בוttom: א) פלזמה - ב) PBMC וטסיות - ג) פתרון צפיפות - ד) ג'ל פוליאסטר - ה) גרנולוציטים - ו) כדוריות דם אדומות. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. פנוטיפ אופייני משטח של תאים T γδ. PBMC היו מגורה עם zoledronate ו IL-2 למשך 14 יום. תאים הוכתמו FITC שכותרתו אנטי TCR Vγ9 ו PE/Cy5-labeled אנטי CD3 לפקח על התרחבות γδ ותאי T (A ו-E). γδ בתאי T זוהו על ידי הביטוי שלהם TCRVγ9, והבעתם של CD27 ו CD45RA (B ו-F), NKG2D (C ו-G), או CD69 (D ו-H) נבדק. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. נציג γδ תרבויות T התא. PBMC היו מגורה עם IL-2 (1,000 IU / ml) ו zoledronate (5 מיקרומטר). שדות נציג מוצגים (IX71 מיקרוסקופ הפוך [אולימפוס] X 200). אשכולות של אגרגטים γδ בתאי T ניתן לצפות ביום 3 (א) יום 5 (ב), כאשר γδ בתאי T הורחבו בהצלחה. לעומת זאת, לא אשכולות או אגרגטים נצפו כאשר γδ T צמיחת תאים לא היה מספיק (C ו-D). <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. IFN-γ הייצור. γδ בתאי T הודגרו עם RPMI-10 בלבד (A) או PMA / ionomycin (ב) או Z-Daudi (C) עבור 4 שעות. ראשית, הבעת הפנים של TCRVγ9 היה מוכתם ואז IFN-γ הייצור נבדק ע"י IFN γ-תאיים מכתים. <img src="/files/ftp_upload/3182/3182fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. קינטיקה של התרבות T γδ התא. (א) מספר מוחלט של תאים בתרבית, (B) אחוז γδ בתאי T, ו - (ג) המספר המוחלט של תאים T γδ בנקודות הזמן שצוין.

<ol><li>Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3+T+cell+effector+functions%3A+a+blend+of+innate+programming+and+acquired+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).</li>
<li>Hintz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+%28E%29-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl+pyrophosphate+as+a+major+activator+for+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).</li>
<li>Gober, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T+cell+receptor+%CE%B3%CE%B4+cells+recognize+endogenous+mevalonate+metabolites+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells.</a> J Exp Med. 197, 163-168 (2003).</li>
<li>Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+of+gammadelta+T+cells+in+tumor+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology.</a> Cancer Res. 67, 5-8 (2007).</li>
<li>Roelofs, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+monocytes+are+responsible+for+gammadelta+T+cell+activation+induced+by+zoledronic+acid+through+accumulation+of+IPP%2FDMAPP%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP.</a> Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).</li>
<li>Dieli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+%CE%B3%CE%B4+T-lymphocyte+effector+functions+by+bisphosphonate+zoledronic+acid+in+cancer+patients+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo.</a> Blood. 102, 2310-2311 (2003).</li>
<li>Kondo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronate+facilitates+large-scale+ex+vivo+expansion+of+functional+%CE%B3%CE%B4+T+cells+from+cancer+patients+for+use+in+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy.</a> Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).</li>
<li>Espinosa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+and+biological+activity+of+bromohydrin+pyrophosphate%2C+a+potent+stimulator+of+human+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells.</a> J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).</li>
<li>Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+profile+and+anti-tumor+effects+of+adoptive+immunotherapy+using+%CE%B3%CE%B4+T+cells+against+advanced+renal+cell+carcinoma%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study.</a> Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).</li>
<li>Murali-Krishna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+antigen-specific+CD8+T+cells%3A+a+reevaluation+of+bystander+activation+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection.</a> Immunity. 8, 177-187 (1998).</li>
<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+culture+medium+on+the+expansion+of+T+cells+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy.</a> Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).</li>
<li>Abe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+immunological+evaluation+of+zoledronate-activated+V%CE%B39+%CE%B3%CE%B4T-cell-based+immunotherapy+for+patients+with+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma.</a> Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).</li>
<li>Nakajima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+study+of+adoptive+immunotherapy+for+recurrent+non-small-cell+lung+cancer+patients+with+autologous+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המוצגת כאן מאפשרת התפשטות יעילה של תאים T γδ מ PBMC. γδ שתאי T מופעלים והרחיב על ידי zoledronate ו IL-2 לפתח פונקציות מפעיל מלאה, שהתבטאה ייצור ציטוקינים ו cytotoxicity. זה כבר דווח כי pyrophosphate סינתטי phosphoantigens bromohydrin (BrHPP) ו 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP) להרחיב גם בתאי T γδ, אולם הם אינם זמינים מסחרית. לעומת זאת, zoledronate מורשה כבר יישומים קליניים כמו Zometa. לכן, מגיב אמין זמין בקלות. <p class="jove_content" style=";text-align:right;...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> ZOMETA </td><td> נוברטיס פארמה ק K </td><td></td><td> zoledronate </td></tr><tr><td> PROLEUKIN </td><td> נוברטיס פארמה </td><td></td><td> IL-2 רקומביננטי אנושי </td></tr><tr><td> BD Vacutainer הכנה CPT Cell Tube עם הפרין סודיום </td><td> BD </td><td> 362753 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td><td></td></tr><tr><td> ALyS203 בינוני </td><td> Cell מדע וטכנולוגיה מכון </td><td> 0301-7 </td><td></td></tr><tr><td> OpTmizer </td><td> Invitrogen </td><td> 0080022SA </td><td></td></tr><tr><td> brefeldin </td><td> סיגמא </td><td> B5936-200UL </td><td></td></tr><tr><td> phorbol 12-13-myristate אצטט (PMA) </td><td> סיגמא </td><td> P1585-1mg </td><td></td></tr><tr><td> ionomycin </td><td> סיגמא </td><td> 13909-1ML </td><td></td></tr><tr><td> IntraPrep </td><td> Beckman קולטר </td><td> A07803 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD3-FITC או PE/Cy5 </td><td> Beckman קולטר </td><td> A07746 FITC A07749 PE/Cy5 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD4-ECD </td><td> Beckman קולטר </td><td> 6604727 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD8-PE/Cy5 </td><td> Beckman קולטר </td><td> 6607011 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD14-PE/Cy5 </td><td> Beckman קולטר </td><td> A07765 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD19-PE </td><td> Beckman קולטר </td><td> A07769 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD45-ECD </td><td> Beckman קולטר </td><td> A07784 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD56-PE/Cy5 </td><td> Beckman קולטר </td><td> A07789 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי TCRαβ-PE </td><td> Beckman קולטר </td><td> A39499 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי TCR Vγ9-FITC </td><td> Beckman קולטר </td><td> IM1463 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD27-PE/Cy5 </td><td> Beckman קולטר </td><td> 6607107 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD45RA-ECD </td><td> Beckman קולטר </td><td> IM2711 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי CD69-PE </td><td> BD </td><td> 555531 </td><td></td></tr><tr><td> אנטי אנושי NKG2D-PE </td><td> Beckman קולטר </td><td> A08934 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humal IFNγ-PE </td><td> Beckman קולטר </td><td> IM2717U </td><td></td></tr><tr><td> עכבר IgG1 אלוטיפ לשלוט-PE </td><td> Beckman קולטר </td><td> A07796 </td><td></td></tr><tr><td> עכבר IgG1 אלוטיפ שליטה ECD או PE/Cy5 </td><td> Beckman קולטר </td><td> A07797 A07798 </td><td></td></tr></tbody></table>

הרחבת דם היקפיים האדם γδ t תאים באמצעות zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

אדם בתאי T γδ יכול לזהות ולהגיב למגוון רחב של מתח המושרה אנטיגנים, ובכך לפתח מולדת פעילות אנטי סרטניים זיהומיות אנטי רחבה. 1 רוב בתאי T γδ בדם ההיקפי יש קולטן Vγ9Vδ2 T התא. תאים אלה מזהים אנטיגן באופן מרכזי histocompatibility מורכב עצמאית ולפתח פונקציות חזקה מפעיל cytolytic ו-Th1 כמו 1. לכן, γδ ותאי T הם תאים למועמד אטרקטיבי עבור מפעיל חיסוני סרטן. Vγ9Vδ2 שתאי T מגיבים phosphoantigens כגון (E)-4-hydroxy-3-methyl-אבל-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), אשר מסונתז חיידקים דרך ביוסינתזה isoprenoid; 2 ו pyrophosphate isopentenyl (IPP), אשר מופק בתאים אוקריוטים דרך מסלול mevalonate. 3 במצב פיזיולוגי, הדור של IPP בתא nontransformed אינו מספיק להפעלת בתאי T γδ. Dysregulation של מסלול mevalonate בתאי גידול מוביל הצטברות של IPP ו γδ הפעלה T לתאים. 3 מאחר aminobisphosphonates (כגון pamidronate או zoledronate) לעכב synthase pyrophosphate farnesyl (FPPS), האנזים הפועל במורד הזרם של IPP במסלול mevalonate, רמות תאיים של IPP ו sensitibity להכרה תאים γδ T ניתן להגדיל על ידי aminobisphosphonates טיפולית. IPP הצטברות הוא פחות יעיל בתאים nontransfomred מאשר תאים סרטניים עם ריכוז רלוונטי פרמקולוגית של aminobisphosphonates, המאפשרים לנו אימונותרפיה של סרטן על ידי הפעלת בתאי T γδ עם aminobisphosphonates. 4 מעניין, IPP מצטבר מונוציטים כאשר PBMC מטופלים aminobisphosphonates, בגלל יעיל ספיגת התרופה על ידי תאים אלו. 5 מונוציטים שמצטברים להיות IPP-הצגת אנטיגן תאים לעורר Vγ9Vδ2 בתאי T בדם ההיקפי. 6 בהתבסס על מנגנונים אלה, אנו פיתח טכניקה להרחבת בקנה מידה גדול של תרבויות γδ T התא באמצעות zoledronate ו interleukin -2 (IL-2). 7 שיטות אחרות להרחבת γδ בתאי T לנצל את pyrophosphate bromohydrin סינתטי phosphoantigens (BrHPP) 8 או 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP). 9 כל השיטות האלה מאפשרות לשעבר הרחבת vivo, וכתוצאה מכך מספר גדול של תאים T γδ לשימוש חיסוני המאמצת. עם זאת, רק zoledronate הוא מגיב זמינים מסחרית ה-FDA. Zoledronate-מורחבת γδ בתאי T להציג CD27 - CD45RA - פנוטיפ זיכרון מפעיל והתפקוד שלהם ניתן להעריך על ידי IFN-γ assay הייצור 7.

שיטה להרחיב בתאי T γδ מתאי דם היקפיים mononuclear (PBMC) מתואר. PBMC שמקורם בתאי T γδ הם מגורה והרחיב באמצעות zoledronate ו אינטרלויקין -2 (IL-2). הרחבת בקנה מידה גדול של γδ בתאי T יכול להיות מיושם על חיסוני הסלולר עצמיים של סרטן.

הרחבת דם היקפיים האדם γδ T תאים באמצעות Zoledronate

תאי T מסוג $\gamma\delta$ אנושיים יכולים לזהות ולהגיב למגוון רחב של אנטיגנים המושרים על ידי עקה, ובכך לפתח תגובה חיסונית מולדת רחבה נגד גידולים ו...

סרטון זה מדגים הרחבה בקנה מידה גדול של תאי גמא דלתא T מדם פריפרי של בני אדם באמצעות זולדרונאט. ראשית, דם מלא עובר סנטריפוגציה במדרג צפיפות כדי לבודד תאי מונונוקליאריים מדם פריפרי או PBMC. ה-PBMC מעוררים באמצעות זולדרונאט כדי לגרום למונוציטים להפוך לתאים מציגי אנטיגן, וכן באמצעות IL-2 כדי לעורר תאי גמא דלתא T.התאים מדגגרים למשך עד 14 ימים על מנת להגדיל את מספר תאי ה-gamma delta T. ניתוח התרבית באמצעות ציטומטריה של זרימה מראה כי רוב התאים שנאספו מציגים פנוטיפ CD three חיובי ו-V gamma nine חיובי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא כבר בעלת רישוי ליישומים קליניים ב-Zometa.לפיכך, ריאגנט אמין זמין בקלות להכנת תאי T מסוג גמא-דלתה בדרגה קלינית, מה שמוכיח כי הפרוצדורה תבוצע על ידי makoto condo ו-amichi izumi בתרבית תאים. טכנאים מהמעבדה שלי יתחילו את הפרוצדורה על ידי בידוד תאי מונונוקלאריים מדם פריפריאלי (peripheral blood mononuclear cell) מתוך דם מלא שנאסף למסורת BD vacutainer CPT להכנת תאים, המכילה נוגד קרישה מסוג סודיום הפרין, ונוזל בעל צפיפות גבוהה, בתוספת מחסום ג'ל פוליאסטר המפריד בין שני הנוזלים. סבבו את הדגימה בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ברוטור בעל סלים נעים (swinging bucket rotor) למשך 20 דקות ב-1800 $\times$g. עם הפסקת הצנטריפוגה, תכולת המבחנה תופרד לחמישה שכבות.השכבה הצהובה העליונה מורכבת מפלסמה. מתחתיה, שכבה הלבננה מכילה תאי דם לבנים מונונוקלאריים פריפריאליים וטבחיות, הנשענים על תמיסת צפיפות צהובה בהירה יותר. שכבת ג'ל פוליאסטר לבנה מפרידה בין אלו לבין הגרנולוציטים, היוצרים שכבה אפרפרה הנשענת על תאי הדם האדומים בתחתית המבחנה.בעזרת פפית של שני מיליליטר, אספו בזהירות חלק משכבת הפלזמה, תוך השארת 5 עד 10 מילימטרים של פלזמה מעל הממשק, והעבירו אותה למבחנה קונית של 15 מיליליטר. הניחו את המבחנה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לשימוש עבור התרבית. לאחר מכן, השתמשו בפפית של שני מיליליטר כדי לאסוף את הפракציה המועשרת ב-PBMC בממשק והעבירו אותה למבחנה קונית של 15 מיליליטר.כדי לשטוף את ה-PBMC, הוסף 10 milliliters של PBS והפוך את המבחנה חמש פעמים. לאחר מכן, סבב את המבחנה בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-400 times G. חזור על שלבי השטיפה פעמיים. לאחר מכן, לאחר השעייה חוזרת של משקאו התאים ב-5 milliliters של PBS, השתמש ב-hemocytometer כדי לקבוע את מספר התאים.בדרך כלל, 1.3 times 10 to the six תאים מופקים ממיליליטר אחד של דם מלא. חלק של pbmc המכיל one times 10 to the six תאים מופרד ונשמר על קרח, לצורך ניתוח באמצעות פלוו-ציטומטריה.כדי להרחיב את תאי ה-gamma delta T במדגם ה-PBMC, סנטריפוגו את תרחיפי התאים במבחנות קוניות של 15 מיליליטר למשך חמש דקות ב-400 ×g בטמפרטורת החדר. לאחר הסבוב, השליכו את העל-מבנה (supernatants) ושחקו מחדש את התאים במצע גידול תאים, המועשר ב-1000 IU per milliliter IL-2 וב-5 µM zoledronate בצפיפות של 1×10⁶ תאים per milliliter. Zoledronate מעכב את faril pyrophosphate synthase במונוציטים, מה שמוביל להצטברות של isopentenyl pyrophosphate ולהפיכת המונוציטים לתאים מציגי אנטיגן (antigen presenting cells).בשלב הבא, השתמשו בפיפטה. העבירו 1 mL של מצע המכיל 1 × 10⁶ תאים לכל באער בלוח של 24 באערים; ריכוז התאים צריך להיות 0.5 × 10⁶ cm². עבור תרביות גדולות יותר, התאימו את הכמויות בהתאם לכל באער בלוח של 24 באערים.הוסיפו 100 µL של פלסמה אוטולוגית שנאספה קודם לכן, סרום אנושי מסוג AB מאוחד (pooled) או FBS. הניחו את הפלטות באינקובטור לח עם 37 °C ו-5% carbon dioxide מדי יומיים עד שלושה ימים. החליפו את המצע במצע סרום טרי המועשר ב-1000 IU per milliliter של IL two אנושי.כאשר התאים מגיעים לצפיפות של 0.5 עד פעמיים 10⁶ תאים למילליטר, פצלו אותם ביחס של אחת לשתיים לבארות או לבקבוקים חדשים. עקבו אחר התאים לאורך מספר ימים. כאן מוצגים התאים ביום אפס.התאים הקטנים יותר הם לימפוציטים. התאים הגדולים יותר הם מונוציטים. כעבור כ-24 שעות, המונוציטים נצמדים לתחתית הבאר.לאחר יומיים, חלק מהלימפוציטים נצמדים למונוציטים; עד היום השלישי, תאי T גמא-דלתה מתחילים ליצור צברים. ביום החמישי, ניתן להבחין בצברים גדולים של תאים. לעומת זאת, לא ייראו צברים או אגרגטים כאשר צמיחת תאי T גמא-דלתה אינה מספקת. כאשר היווצרות הצברים מתעכבת.כפי שמוצג כאן, צמיחתם של סוגי תאים אחרים, כגון תאי alpha beta T חיוביים ל-CD4 או חיוביים ל-CD8, או תאי NK, דומיננטית לצמיחתם של תאי gamma delta T. ביום 12 עד 14, בצעו פיפטור רחב של התאים באמצעות פיפטה של 10 milliliter ואספו את התאים למבחנות קוניות של 50 milliliter. כעת ניתן לנתח את התאים באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לקבוע את השכיחות, הפנוטיפ והתפקודים של תאי gamma delta T.לביצוע ניתוח פנוטיפי של pbmc או של תאי gamma delta T שהורחבו, התחילו בהעברה של דגימות בנפח 200 µL המכילות 2×10⁵ תאים לכל אחת מתוך תשע מבחנות עבור מיון תאים מופעל פלואורסצנטית (FACS). הוסיפו 2 mL של PBS קר וסבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-400 ×g, ולאחר מכן השעיקו מחדש את המשקעים ב-50 µL של FACS buffer. הוסיפו לדגימות 5 µL מכל אחד מהנוגדנים הנדרשים.דגרו את הדגימות על קרח בחושך במשך 20 דקות. לאחר הדגירה, הוסיפו שתי מיליליטר של fax buffer לכל דגימה, ולאחר מכן סובבו את הדגימות בצנטריפוגה במשך חמש דקות ב-400 ×g בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסבב, שפכו בזהירות את העילאי, השעיקו שוב את התאים ב-300 µL של fax buffer וערבלו במכשיר vortex.לאחר מכן, נתחו את הדגימות במכשיר פלוו-ציטומטר (flow cytometer) כדי להעריך את התפקוד של תאי T גמא-דלתא. יכולתם לייצר אינטרפרון גמא נבדקת באמצעות צביעה תוך-תאית של אינטרפרון גמא. השעו מחדש את תאי T גמא-דלתא בריכוז של 2×10⁶ תאים למילליטר ב-RPMI 1640 המכיל felden A בריכוז של 20 µg/mL.Felden A מעכב את הפרשתו של interferon gamma, מה שמוביל להצטברות של interferon gamma בתא. לאחר מכן, העבירו 100 µL של תרחף תאי gamma delta T לכל באר בלוח 96 בארות המכיל 100 µL של RPMI 10 בלבד, או RPMI 10 עם 20 ng/mL של four. Ball 12 ate 13 acetate בתוספת 2 µg/mL של ion mycin או Z duddy cells.ערבב באמצעות פיפטינג (שאיבה והזרקה) מספר פעמים. דגרי את הדגימה למשך ארבע שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% carbon dioxide. לאחר מכן, צנטריפוג את הפלטה למשך חמש דקות ב-400 ×g בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן השהה את המשקעים (pellets) ב-200 µL של PBS קר.העבירו את הדגימות לנבובות FACS. לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטרים של PBS קר וסבבו את הנבובות בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-400 $\times$g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסבב, השעיקו מחדש את המשקעים ב-50 מיקרוליטר של FACS buffer עם חמישה מיקרוליטרים.דגרו נוגדן מונוקלוונלי anti-CD3 המסומן ב-PE SCI five ונוגדן anti-TCRV gamma nine המסומן ב-FE, בכמות של 2.5 µL, למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, תוך הגנה מאור. לאחר הדגירה, הוסיפו 100 µL של reagent one מתוך intra prep והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הוסיפו 4 mL של PBS לכל מבחנה וצנטריגו למשך חמש דקות ב-400 ×g בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, השעו את המשקע ב-100 µL של reagent two מתוך intra prep והדגירו למשך חמש דקות.בטמפרטורת החדר, הוסיפו חמישה µL של נוגדן מונוקלונלי נגד interferon gamma המשוער ל-PE למבחנה. דגרו בהגנה מאור למשך 15 דקות. בטמפרטורת החדר, הוסיפו ארבעה mL של PBS לכל מבחנה וסובבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-400 ×g. בטמפרטורת החדר, הסירו את הנוזל העליון באמצעות שאיבה ותלו את משקע התאים.ב-0.5 milliliters של fax buffer. יש לנתח את התאים באמצעות flow cytometer, להגדיר gate על תאים CD three positive ו-TCR v gamma nine positive, ולבדוק את הביטוי של interferon gamma. פנוטיפ שטח טיפוסי של תאי gamma delta T מוצג כאן.תאי T גמא-דלתה זוהו על פי ביטוי של CD3 ו-TCRV gamma nine ביום אפס. אחוז תאי T גמא-דלתה חיוביים ל-CD3 וחיוביים ל-TCRV gamma nine ב-PBMC היה 1.6%. האוכלוסיות הדומיננטיות של תאי T גמא-דלתה היו בעלות פנוטיפ נאיבי חיובי ל-CD27 וחיובי ל-CD45RA, או פנוטיפ זיכרון מרכזי חיובי ל-CD27 ושלילי ל-CD45RA. הביטויים של CD27 ו-CD45RA משמשים לקביעת הפנוטיפ הנאיבי או פנוטיפ הזיכרון שלהם.CD 27 חיובי. CD 45. RA חיובי הוא נאיבי.CD 27 חיובי. CD 45 RA שלילי הוא זיכרון מרכזי CD 27 שלילי. CD 45.RA שלילי הוא זיכרון אפקטורי. CD 27 שלילי. CD 45.RA positive הוא פנוטיפ מובחן סופי (terminally differentiated). מצב ההפעלה של התאים נותח באמצעות NK G 2D או CD 69 כפי שמוצג כאן. תאי Gamma delta T מבטאים NK G 2D, אך אינם מבטאים CD 69.לאחר 14 ימי תרבית, התדירות של תאי gamma delta T עלתה ליותר מ-93.8% מהתאים שגודלו. בתרביות מוצלחות של תאי gamma delta T, הם הראו פנוטיפ של תאי זיכרון אפקטורים (effector memory) עם ביטוי שלילי של CD 27 ו-CD 45 RA. בתאי gamma delta T שגודלו נצפתה עלייה בביטוי של nkg 2D ו-CD 69.צביעה תוך-תאית של interferon gamma הראתה כי תאי gamma delta T ייצרו interferon gamma בתגובה לטיפול ב-pma CIN או לתאי Z dwy שהצטבר בהם IPP. לאחר טיפול ב-zoledronate, כ-97% ו-19.6% מתאי gamma delta T ייצרו interferon gamma בתגובה לגירוי על ידי PMA CIN ותאי Z ddy, בהתאמה. תוצאות אלו מעידות כי zoledronate יכול להמריץ ולהרחיב ביעילות תאי gamma delta T פונקציונליים.הקינטיקה של תרבית תאי T מסוג גמא-דלתה שהורחבה באמצעות זולדרונאט ו-IL-2 הראתה עלייה מעריכית במספר המוחלט של התאים המטופחים עד ליום ה-12 עד ה-14. העשרה של תאי T מסוג גמא-דלתה הושגה בשלב מוקדם יחסית. כמעט 80% מהתאים המטופחים היו תאי T מסוג גמא-דלתה עד היום השביעי; מספר מוחלט של תאי T מסוג גמא-דלתה בנקודות הזמן המצוינות מדגים כי ניתן להוציא כ-2.2 × 10⁸ תאי T מסוג גמא-דלתה מ-1 × 10⁶ PPMC המכילים 1.6 × 10⁴ תאי T מסוג גמא-דלתה לאחר פיתוחם.טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום האימונותרפיה של הסרטן לבחון יישומים קליניים בסוגים רבים ושונים של סרטן. שיטת תרבית זו שימשה בניסויים קליניים בשלב הראשון, להערכת הבטיחות וההיתכנות של טיפול בהעברת תאי gamma delta T מורחבים מתרומה בחולים עם סרטן.

expansion-of-human-peripheral-blood-t-cells-using-zoledronate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אקס הרחבה vivo של גידול תאים T-reactive באמצעות 1/Ionomycin Bryostatin ואת גמא נפוצים שרשרת גיבוש ציטוקינים

כאן אנו מתארים שיטה יעילה להרחיב ולטהר מספר גדול של תאים NK האדם להעריך את תפקידם.

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

התמיינות של תאים קודמים לאוסטאוקלסטים מווסתת על ידי ציטוקינים וגורמי גדילה. כאן, מתוארת טכניקה חדשה להעברת גנים להתמיינות של אוסטאוקלסטים in vivo ופרוטוקולי תרבית תאים להתמיינות תאים קודמים לאוסטאוקלסטים במבחנה כשיטה לחקר ההשפעות של ציטוקינים על אוסטאוקלסטוגנזה.

רומן In vivo טכניקה וין העברה במבחנה לחקר אובדן עצם בפרעות השלד והשרירים

פרוטוקול זה מתאר את התפתחות במבחנה האנושי פרה מודל של osteoclastogenesis של דם היקפיים ומונוציטים תרבותי עם שורות תאים של סרטן השד כדי לחקות את האינטראקציה תא-אוסטאוקלסט סרטן. המודל יכול לשמש כדי לקדם את ההבנה שלנו של עצם היווצרות גרורות ולשפר את אפשרויות טיפוליות.

התפתחות מודל פרה האנושית של Osteoclastogenesis של דם היקפיים ומונוציטים תרבותי משותף עם שורות תאים של סרטן השד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום ולצבור מחלות ב-xenogeneic השתל-מול-מארח (Xenogeneic) מודל. xenoGVHD מספק מודל vivo כדי ללמוד דיכוי חיסוני של תאים האדם T. בנוסף, אנו מתארים כיצד לזהות תאים האדם T ברקמות עם PCR דיגיטלי ככלי כדי לכמת את הדיכוי החיסוני.

אינדוקציה והבקיע של מחלת השתל מול מארחים ב מודל Murine מורה Xenoic ו כימות האדם תאים T ברקמות העכבר באמצעות PCR דיגיטלי

אנו מתארים היקפית אנושית תא היקפי (pbmc)-מבוסס הומניזציה מודל העכבר מבע שתלת עבור מחקר translational-אונקולוגיה. פרוטוקול זה יכול לשמש כמנחה כללי להקמת ולאפיון מודלים דומים להערכת הטיפול של I-O.

תא היקפי של דם מונאפרור (PBMC) חרט הומניזציה מודל Xenograft עבור מחקר הטרנסג-אונקולוגיה (I-O)

שתל-מול-מארח מחלה הוא סיבוך גדול לאחר השתלת מח עצם allogeneic. תאים דנדריטים לשחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של השתל-מול-מארח המחלה. המאמר הנוכחי מתאר פלטפורמת השתלת מח עצם רומן כדי לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים בפיתוח של מחלת השתל מול מארח את השתל-נגד לוקמיה אפקט.

עצם השתלת מח פלטפורמת לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים במחלה שתל-מול מארח

מוצג פרוטוקול להרחבת מוצר התרופה תא גמא-דלתא (γδ) T. לימפוציטים מבודדים על ידי ההבהרה ומועשרים בחומצה זולדרונית ואינטרלוקין-2. תאי אלפא-ביתא T מתרוקנים באמצעות התקן הפרדה מגנטי ברמה קלינית. תאי γδ מתורבתים במשותף עם תאים מלאכותיים שמקורם ב- K562 ומורחבים.

הרחבה והעשרה של תאי T של גמא-דלתא (γδ) ממוצר אנושי כדורי

אוסטאוקלסטים הם תאי מפתח סופחי עצם בגוף. פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה להבחנה חוץ גופית של אוסטאוקלסטים ממונוציטים של דם היקפי אנושי. שיטה זו יכולה לשמש ככלי חשוב להבנה נוספת של הביולוגיה של אוסטאוקלסטים בהומאוסטזיס ובמחלות.

הבחנה של אוסטאוקלסטים פונקציונליים ממונוציטים של דם היקפי אנושי CD14+

כאן, הקמנו in vivo אוסטאו-אורגנואידים המופעלים על ידי פיגומי ג'לטין טעונים בחלבון מורפוגנטי-2 עצם כדי לקצור תאי גזע / אב המטופויטיים טיפוליים לשחזור של מערכת המטופויטית וחיסונית פגומה. בסך הכל, גישה זו יכולה לספק מקור תאי מבטיח לטיפולים תאיים.

In Vivo גישת אוסטאו-אורגנואיד לקצירת תאי גזע/אב המטופויטיים טיפוליים

למד הרחבה בקנה מידה גדולה של תאי T γδ מדם היקפי באמצעות זולדרונט ו-IL-2 לטיפול אימונותרפיה בסרטן. השיטה משתמשת בצנטריפוגה מדירה וזרימה ציטומטריה לאפיון תאים.

הרחבת דם היקפיים האדם γδ T תאים באמצעות Zoledronate

גלה סרטונים נוספים