Name: Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: למד את טכניקת הסרת העין בעכברים לצורך פיקסציית רקמות ופנוטיפינג במסכים גבוהי תפוקה. שיטה זו מסייעת לחוקרים לזהות ציוני דרך אנטומיים ולשפר תוצאות מחקר בנוירומדע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר כדי למנוע עיוורון; Bartly ג&#39;Mondino MD, מנהל מכון עיני ז&#39;ול שטיין, אוניברסיטת קליפורניה, ורמירו רמירז-סוליס, ג&#39;קי הלבן, וז&#39;אן Estabel במכון סנגר, קמפוס הגנום Wellcome Trust. מחקר זה תואם את הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזותי.

1. Dissection הבוטה: enucleation של עין העכבר בדגימות מבולבלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את העפעפיים כדי לשפר את החשיפה וגישה למשטח הגלובוס האחורי (גלגל עין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מלקחי הלבשה מעוקלים מאחור (תחת) את כדור הארץ במסלולו (שקע עין). Mahajan Sharptip הלבשת המלקחיים הם מכשיר מותאם אישית עם מחודדים כדי לעשות את הצעד הזה קל יותר (ראה טבלת חומרים וריאגנטים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את המלקחיים ותופס את רקמת חיבור מסלולית ועצב אופטי מאחורי העולם בעת היותו זהיר ולהימנע מסחיטת הגלובוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות את המלקחיים כלפי מעלה וקוטף את גלגל העין ממסלולו. הרקמות הלבנות דמויות חוט היא עצב הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העין בPBS. באמצעות מחט 30-מד, לבצע ניקור יחיד לפצוע מייד אחורי לימבוס ידי הוספת 1-2 מ"מ המחט לתוך גלגל העין. זה מאפשר fixatives, כגון glutaraldehyde, שאחרת לא הצליחו לחדור לרקמות העין, לישירות enter העין. יצירה של פצע זה לא יכול להיות הכרחית אם מקבע, כגון paraformaldehyde או אלכוהול, הוא מסוגל לשדר לרקמות עין של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כל העין באופן מיידי למקבע לקיבעון טבילה. </li></ol> 2. Dissection שארפ: enucleation של קיבעון זלוף בא עין העכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש Colibri מלקחיים מעוקלים, כדי להחזיק את העפעף מהעולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים מעוגלים אוריינט Westcott נתיחה מקביל לעולם, תוך חתירה לכיוון חלק האחורי של המסלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את רקמת חיבור הקבועה שמקיפה את הגלובוס מהצדדים הנחותים, המדיאלי, המעולים, ורוחב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המלקחיים המעוקלים מאחורי העולם, אחוז ברקמת החיבור, מבלי ללחוץ על הגלובוס, ולמשוך קדימה כדי enucleate העין. מאז רקמת חיבור מסלולית היא נוקשה מקיבעון זלוף, חיתוך נוסף של רקמות מסלול עשוי להיות נחוץ כדי לשחרר את הגוש לחלוטיןדואר. </li></ol> 3. קיבעון ואריזה משלוח של רקמות קבועות חייב לעקוב אחר הדרישות המוסדיות ודואר שירותך כולל תוויות ואריזה מתאימות. הפרוטוקול הבא הוא דוגמה למשלוח דגימה ביולוגית שאינן מדבקת בטמפרטורת הסביבה. זה דורש 3 שכבות של אריזה אבל לא ברמת חומר ביולוגי / B או תוויות של חנקן נוזליות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העין לתוך בקבוקון זכוכית נצנץ 5-מ"ל עם לפחות מקבע 3-מ"ל, או הבולם לאחר מקבע אם הקיבעון הוא קצר. כתוב את מספר המעקב על מכסה מכל ולאטום אותו עם Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקוני scintillation מקום לדגימה ביולוגית שאושרו מכולה. במכון שלנו, למשל, מכולות שאושרו דורשות שלוש שכבות: מכל אטום שבמדגם ממוקם, שכבה אמצעית סופגת, ושכבה חיצונית ומגנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המכל לתוך חבילת אריזות בועות ולאחר מכן ליישוםמכל שוטט מעבדת משלוח יחד עם תיעוד מתאים. </li></ol> 4. נציג תוצאות בדיקה היסטולוגית של עיניים יכולה להתבצע על ידי מגוון שיטות, כולל Hematoxylin ומכתימים Eosin, זיהוי ביטוי האנזימטית מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים, ואימונוהיסטוכימיה. לאחר טבילה בקיבעון paraformaldehyde 4%, רקמה הייתה מוטבעת בפרפין ונותח על microtome. בphenotyping תפוקה גבוהה, אנו מנתחים את סעיפי עצב אופטי תלמיד שהמדגם כל סוגי הרקמות בעין (איור 1). קטעי הרקמה נבדקו גם לביטוי lacZ (איור 2), מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים של אברונים סלולריים (איור 3), וביטוי של מולקולות ספציפיות עם נוגדנים (איור 4). בשיטת הקרנת הפנוטיפ שלנו, זה לא היה חשוב לשמור על נטייה של העין ביחס לאף (canthus מדיאלי) וזמן (lateraצדדים) l canthus. יש לפחות שתי אפשרויות אם נטיית עין היא הכרחית. לאחר enucleation, יש לנו להחיל כוויית אור לקרנית הזמנית במעמד 03:00 עם מכשיר כוויית כף יד. הנגע ברור על היסטולוגיה ואינו הולכות לאיבוד בעיבוד כמו דיו היסטולוגית. החסרון הוא כי ניזקי כווייה בקרנית, אשר עשוי להיות קריטיות לבדיקת רקמות. האפשרות האחרת דורשת אנטומיה מיומנת שיכול לזהות את הוספות שרירי extraocular. תחת stereomicroscope, זיהוי של הכנסת השרירים האלכסוניות מעולה הנחותה ומסמן את ההיבט הנח ומעולה של הגלובוס. 3 עם אף אחת משיטות ההתמצאות, חשוב לעקוב אחר הדגימה כעינו ימנית או שמאלית. יחד, זה יאפשר התמצאות עולם מדויקת לקראת חתך. <img src="/files/ftp_upload/3184/3184fig1.jpg" alt="מיקרוגרף אנטומיה של העין; מדורים היסטולוגיים; עדשה, רשתית, קרנית; פרטי שכבת הסלולר." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="איור 1"> איור 1. תמונות היסטולוגית עין עכבר afte מרחוק רכישת r. עיניים מאוסות enucleated ידי נתיחה חדה בעקבות קיבעון זלוף עם paraformaldehyde 4%. סעיף א תלמיד אופטי עצבים מוכתמים בHematoxylin וEosin מראה שימור של כל substructures הרקמות. ON, עצב ראייה. (סרגל קנה מידה ירוק = 500 מיקרון) ב 'מבט גבוה יותר גדלה של הרשתית הנורמלית מראה את המבנה שלה מינרית:, תאי הגנגליון ברשתית RGC;, השכבה פנימית plexiform IPL; שכבת INL, פנימית גרעינית;, השכבה חיצונית plexiform OPL; ONL, חיצוני שכבה גרעינית (תא photoreceptor) (חץ); IS, מגזרי photoreceptor פנימיים (ראש חץ); OS, קטעי photoreceptor חיצוניים; RPE, אפיתל הפיגמנט ברשתית; C, דמה עין. (סרגל קנה מידה ירוק = 50 מיקרון) ג בהשוואה לרשתית הנורמלית, העותק הזה הוא דק יותר בשל התנוונות photoreceptor. ONL, IS, ומערכת ההפעלה נעדרת לחלוטין (חץ). (בר סולם ירוק = 50 מיקרון) "Alt =" איור 2 "/&gt; איור 2. ביטוי lacZ בעכברים הטרנסגניים. עיניים היו enucleated ידי נתיחה בוטה ושקוע בפתרון 1 מ"ג / מיליליטר X-גל (5 מ"מ K3Fe (CN) 6, 5 המ"מ K4Fe (CN) 6, 2 מ"מ MgCl2, 0.02% NP40 , ו -0.1% deoxycholate נתרן) לילה בשעת 37 ° C. עיניה היו נעוצות ב2% glutaraldehyde formaldehyde/0.2% במשך 30 דקות ומחולקות בmicrotome. X-Gal מוצרים (כחול) תוויות: א ריסי האפיתל, האפיתל של קרנית ב ', וג גנגליון תא שכבת הרשתית (RGC) ברשתית. INL, שכבה פנימית גרעינית; שכבת ONL, חיצונית גרעינית. <img src="/files/ftp_upload/3184/3184fig3.jpg" alt="מבנה הרשתית; מיקרוגרף אלקטרונים המראה את המקטעים החיצוניים של המוט, תאי RPE, הממברנה של ברוך." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="איור 3"> איור 3. מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים של אפיתל הפיגמנט ברשתית (רשתית). לאחר נתיחה ויצירה בוטות של פצע, עיניים היו טבילה קבועה בParaformaldehyde 2.5% / 2.5% בGlutaraldehyde חיץ פוספט נתרן 0.1M. עיניים היו seconקבוע darily ב1% textroxide אוסמיום, בהדרגה מיובשת, ומוטבע בשרף של Spurr. הרקמה נותחה ב 90 ננומטר והניחה על גבי רשתות הימורי נחושת המכוסית בFormvar וצלמה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים. מיקרוסקופ תערוכות, מגזרי photoreceptor חיצוניים של הרשתית, נוירו melanosomes (M) בתוך אפיתל הפיגמנט ברשתית, וקרומו של ברוך. <img src="/files/ftp_upload/3184/3184fig4.jpg" alt="תמונת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של מבנה ביופילם חיידקי; הגדלה בקנה מידה של 20 מיקרון." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="איור 4"> איור 4. תיוג immunohistochemical של dismutase-3 superoxide (ירוק) בזגוגית העכבר. עיניים היו enucleated ידי נתיחה בוטה ועבר קיבוע טבילה בparaformaldehyde 4%. הם גלומים בנפט, ונותח באמצעות microtome. סעיפי רקמות הודגרו עם ארנב SOD3 antiserum polyclonal דילול 1:50. SOD3 ביטוי אובחן באמצעות עיזים נגד ארנב IgG (H + L)-Alexa פלואוריד 488 נוגדנים משניים מצומדות. תיוג של SOD3 מוצג בGREen.

<ol><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li>
<li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+Mouse+Eye+Phenomics+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Laboratories%2C+Mouse+Genetics+Meeting%22%5BJournal%5D)">A high-throughput Mouse Eye Phenomics System.</a> Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).</li>
<li>Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. In Research Methods For Mutant Mice. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2002).</li>
<li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li>
<li>Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+genes+encoding+melanosomal+proteins+cause+pigmentary+glaucoma+in+DBA%2F2J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice.</a> Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).</li>
<li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+fundus+photography+and+angiography%3A+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).</li>
<li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+resources+for+vision+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).</li>
<li>Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+from+screening+over+9000+mutation-bearing+mice+for+defects+in+the+electroretinogram+and+appearance+of+the+fundus%5BTitle%5D)+AND+%22Vision.+Res%22%5BJournal%5D)">Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus.</a> Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).</li>
<li>Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+mouse+retinal+degenerations.+I.+Correlation+of+indirect+ophthalmoscopy%2C+electroretinograms%2C+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Doc.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology.</a> Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).</li>
<li>Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+degeneration+in+mice+lacking+the+gamma+subunit+of+the+rod+cGMP+phosphodiesterase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase.</a> Science. 272, 1026-1029 (1996).</li>
<li>Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+carrying+the+H258N+mutation+in+the+gene+encoding+the+beta-subunit+of+phosphodiesterase-6+%28PDE6B%29+provide+a+model+for+human+congenital+stationary+night+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness.</a> Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

עכברים הטרנסגניים ביותר קיימים במעבדות שלא לבחון את העיניים. טכניקת הווידאו שלנו ממחישה שיטה פשוטה, סטנדרטית להעברת מיומנות כירורגית מרחוק כדי לייעל את רכישת רקמה ממעבדות עם ניסיון מועט עם העיניים. טכניקה זו עוזרת להתגבר על וידאו מכשלה עיקרית בphenotyping תפוקה גבוהה, שהוא השימוש במספר מצומצם של אתרי מומחים בשל שיטות איסוף וקיבוע רקמות שאינם סטנדרטי, שמונעות מחקרים פנוטיפי ומולקולריים השוואתיים משמעותיים. כדי להקים ולקיים בקרת איכות בכל מעבדה מרחוק חדשה וטכנאי, חשוב לכלול את עיניי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגים </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> מלקחי הלבשה מעוקלים </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> Mahajan Sharptip הלבשת מלקחיים </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1406 (REF SP7-64520) </td><td></td></tr><tr><td> מספריים מעוגלים Westcott </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3321 WH </td><td></td></tr><tr><td> 15 ° BD ביבר המייקר Blade </td><td> קיטון דיקינסון- </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 מלקחי תפירה עדין Castroviejo </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0.12 מלקחי קוליברי </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2/132 </td><td></td></tr><tr><td> מחט 30-מד </td><td> קיטון דיקינסון- </td><td> 305128 </td><td></td></tr><tr><td> Biohazard מיילר </td><td> דיג </td><td> 03-523-4 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> דיג </td><td> 13-374-10 </td><td></td></tr><tr><td> זכוכית בקבוקוני נצנץ </td><td> ויטון </td><td> 4500413033 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 7.4 pH </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyde </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 15700 </td><td></td></tr><tr><td> 2.5% Paraformaldehyde / 2.5% Glutaraldehyde בחיץ פוספט נתרן 0.1M </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 15700 &amp; 16300 </td><td> מעורב במעבדה </td></tr><tr><td> 50% Glutaraldehyde </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 16300 </td><td></td></tr><tr><td> Formvar% 0.25 </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 15810 </td><td></td></tr><tr><td> שוטרלגריד משבץ </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> M2010-CR </td><td></td></tr><tr><td> 4% tetroxide אוסמיום </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 19140 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן אנטי SOD3 </td><td> Abcam </td><td> Ab21974 </td><td></td></tr><tr><td> עיזים נגד ארנב Alexa פלואוריד 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A11070 </td><td></td></tr><tr><td> השרף של Spurr ההטבעה </td><td> מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> 14300 </td><td></td></tr></tbody></table>

enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

עין העכבר היא מודל גנטי חשוב למחקר translational של מחלת עיניים אנושית. מחלות מסנוורות בבני אדם, כגון ניוון מקולרים, ניוון photoreceptor, קטרקט, גלאוקומה, רטינובלסטומה, רטינופתיה סוכרתית וכבר סכם בעכברים מהונדסים. 1-5 עכברים הטרנסגניים ונוקאאוט רוב נוצרו על ידי מעבדות ללמוד מחלות שאינן לרפואת עיניים, אבל שימור גנטי בין מערכות איברים עולה כי רב מאותם הגנים עלולים גם לשחק תפקיד בהתפתחות מחלה ועינית. לפיכך, העכברים האלה מייצגים משאב חשוב לגילוי מתאמים חדשים גנוטיפ-פנוטיפ בעיניים. כי עכברים אלו מפוזרים על פני הגלובוס, קשה לרכוש, לתחזק ופנוטיפ בצורה יעילה וחסכונית. לפיכך, מסכי phenotyping רפואת עיני תפוקה הגבוהה ביותר מוגבלים לכמה מקומות שדורשים באתר, מומחיות העינים לבחון את העיניים בעכברים חיים. 6-9 גישה חלופית שפותחה על ידי המעבדה שלנו היא שיטה לרקמות רכישה מרחוק שניתן להשתמש בו בסקרים גדולים או בקנה מידה הקטן של עיני עכבר מהונדסות. נהלים סטנדרטיים להעברת וידאו מבוסס כירורגית מיומנות, קיבעון רקמות, ומשלוח לאפשר לכל מעבדה כדי לאסוף עיניים שלמות מבעלי חיים מוטנטים ולשלוח אותם לphenotyping מולקולרי ומורפולוגי. במאמר זה וידאו, אנו מציגים טכניקות לenucleate ולהעביר עיני עכבר קבועות גם מבולבלות וזלוף לניתוחי phenotyping מרוחקים.

טכניקת הנתיחה ממחישה enucleation של עין העכבר לקיבוע רקמות כדי לבצע phenotyping במסכי תפוקה גבוהה.

Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

עין העכבר היא מודל גנטי חשוב למחקר תרגומי של מחלות עיניים בבני אדם. מחלות הגורמות לעיוורון בבני אדם, כגון ניוון מקולרי...

סרטון זה ידגים את עין העכבר ואת תהליך הניקלאציה (nucleation), כלומר הוצאת גלגל העין ממסלול העין. גלגל העין מוגבל על ידי שולי העפעף התחתון. כאן נמצאת הזווית הפנימית או הנזית (medial or nasal canthus).מאחור נמצאת הזווית הרקותית או הלטרלית. מעל נמצא שפת העפעף העליונה. כאן מוצג דגימה כירורגית.המחט מצביעה על הקרנייה השקופה. ניתן לראות חלק קטן מהעדשה בולט מעבר לקשתית. הקשתית מופיעה כאן בחום, ומכסה את העדשה.נקודת האסון הכירורגית החשובה ביותר היא הקו הלבן הזה, או הלימבוס (limbus), שבעקבותיו נבצע פצע דקירה ממש מאחוריו. החצי האחורי של גלגל העין נמצא מאחורי הלימבוס, וכאן אנו מצביעים על נקודת השבחה של שריר. ניתן לראות את השריר נשען על גלגל העין כאן, ולאחר מכן את רקמת החיבור הממלאת את מחלול העין וכוללת את בלוטת אריאן (Arian gland).ולבסוף, זהו הפס הלבן והארוך של העצב האופטי שהתקבל מדיסקציה קהה. באמצעות פינצטת חבישה מעוקלת, שהותאמה אישית עם קצה חד, התחילו בהרחקה של העפעפיים. פעולה זו נוטה להוציא את העין ולהרחיקה החוצה.השתמשו בפינצטה בזהירות כדי להיכנס למסלול העין ומאחורי גלגל העין, דחסו אותה בעדינות מאחורי גלגל העין ללא לחיצה עליו ומשכו קדימה. אתם אמורים להצליח לתפוס את רקמת החיבור ולא את גלגל העין. אם תסובבו את גלגל העין הצידה, תוכלו לראות את רקמת המסלול יחד עם העצב האופטי הלבן.זוהי נתיחה שנייה רק כדי להראות שוב שניתן להיכנס דרך הזווית (canthus), לדחוף את הפינצטה מאחורי גלגל העין, לתפוס את רקמת החיבור ולמשוך אותה קדימה מבלי להפעיל לחץ על גלגל העין עצמוו. שוב, ניתן לראות את רקמת החיבור בפס הלבן והארוך של העצב האופטי. כדי ליצור פצע דקירה, אחזו בגלגל העין באמצעות נקודת חיבור של שריר והחדירו מחט מאחורי הלימבוס (limbus), ממש לצד המקום שבו אתם מחזיקים את העין כדי לייצב אותה.פעולה זו תאפשר למקבע לחדור לעין. אם תבצע את הדקירה רחוק מהנקודה שבה אתה מחזיק את העין, גלגל העין יהיה לא יציב מאוד, ויהיה קשה ליצור את הפצע באורך הרצוי מבלי לדחוס את העין או להפעיל לחץ מיותר. ניתן גם לתפוס את כל הרקמה החיבורית שנמצאת מיד מאחורי גלגל העין עצמו.חלק ממקבעים אינם דורשים פצע דקירה. באופן כללי, אנו מניחים את העין בבקבוק סינצילציה של 5 cc עם לפחות 3 cc של מקבע כדי להבטיח שהעין שקועה. עבור בעלי חיים שעברו קיבוע בפרפוזיה, נדרשת נתיחה חדה.אנו משתמשים בפינצטה קליברי (calibri) מעוקלת ובמספרי וסקוט (wescott) מעוקלים. תפסו את העפעף התחתון באמצעות פינצטת הקליברי. הכניסו את המספריים כנגד עצם המ Orbita, והתחילו בחיתוך הרקמה החיבורית.אנו משתמשים בעקמומיות הרחק מגלגל העין ונמנעים משינוי הגודל. כל חלק של העין יעבוד לאורך שולי העפעף התחתון, מקוות אחת לשנייה. בנקודה מסוימת, רוב רקמת החיבור תוסר, ותוכל להחליק את המספריים מאחורי גלגל העין ולמשוך אותו הרחק.הנה דוגמה נוספת, הכנסת המספריים למסלול העין, אך כנגד עצם המסלול ולא כנגד גלגל העין, תוך גזירה של הרקמה החיבורית. פעולה זו תתחיל לשחרר את גלגל העין, שנמצא במצב של כדורסל בתוך סל. השתמשו בפינצטה כדי להסיט את העפעפיים והבצעו חתכים קצרים ועדינים מסביב לגלגל העין.כעת נתפוס את רקמת החיבור או את נקודת חיבור השריר באמצעות ה-Collibra ונסיים לחתוך את גלגל העין מרקמת החיבור של מחלול העין. לאחר שגלגלי העין מקובעים כראוי, ובמידה ויש להוביל אותם, נניח מעט para film סביב מבחנת הקיבוע.האריזה חייבת להיות בהתאם לתקנות האוניברסיטה והממשלה. בדרך כלל אנו מניחים את אלו בתוך מכל עם מעט צמר גפן כדי לספוג נוזלים; מכל זה חייב להיות אטום היטב. מכל השילוח מונח לאחר מכן בתוך שקית פצפצות.יש להניח זאת בתוך מארז משלוח מעבדתי לנוזלים, יחד עם כל התיעוד הרלוונטי.

mouse-eye-enucleation-for-remote-high-throughput-phenotyping

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פרוטוקול זה מתאר דרך פשוטה וזולה לכמת את הפעילות של cis-הרגולציה אלמנטים (כלומר, משפר / היזמים) לחיות הרשתיות העכבר דרך electroporation explant. הכנת ה-DNA, דיסקציה רשתית, electroporation, תרבות explant רשתית, שלאחר קיבוע ניתוח וכימות מתוארים.

כימות של פעילות Cis-Regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation Explant

מקור: Jagodzinska, J., et. al., טומוגרפיה קוהרנטית אופטית: הדמיית תאי גנגליון רשתית של עכבר ב-Vivo. J. Vis. Exp. (2017)  בסרטון זה, אנו מדגימים את השימוש בטומוגרפיה קוהרנטית אופטית בתחום ספקטרלי (SD-OCT) כדי לדמות שכבות רשתית ולהעריך שינויים מבניים במודל עכבר מהונדס גנטית עם נוירופתיה אופטית.

הדמיה in vivo של רשתית העכבר באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית

הסרת עיניים, המכונות גם אנוקלאציה, מספקת אסטרטגיה שימושית ללמוד היבטים של מודלי חוצי חזותיים,, ופלסטיות התפתחותית לאורך מערכת הראייה של יונקים שכן הוא גורם בלתי הפיך חלקית (משקפת) או אובדן ראייה (משקפת) מלא. כאן אנו מתארים גישה לשחזור וברורה מאוד לביצוע באנוקלאציה vivo.

שיטה מאוד לשחזור וישיר לביצוע בVivo Ocular Enucleation בעכבר לאחר פתיחת העיניים

במאמר זה אנו מתארים את העקרונות לתכנון וביצוע ניסוי מעקב שושלת רב-צבעוני באמצעות עכברי R26R-Confetti. אנו מספקים פרוטוקול ספציפי למעקב אחר תאי אפיתל בקרנית שניתן לשנות עבור רקמות אחרות מעניינות.

שיטה לאיתור שושלת של תאי קרנית באמצעות עכברים כתב ניאון רב-צבע

כאן אנחנו מדגימים גישה מוזרה לשימוש טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי ברזולוציה גבוהה (HR-SD-אוקטובר) כדי לסייע משלוח של סוכנים טיפול גנטי לחלל subretinal להעריך את פעולתה אמיתיות, לאפיין את קולט אור חיוניות.

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית העכבר הרזולוציה על קוליים כדי לסייע הזרקה תוך-עיני במחקר ריפוי גנטי ברשתית

מוצג כאן היא פלטפורמה מיקרוסקופית multiphoton עבור הדמיית פני השטח עינית עכבר חי. עכבר טרנסגני פלורסנט מאפשר הדמיה של גרעין התא, קרום התא, סיבי עצב ונימים בתוך פני השטח עינית. אותות לא ליניאריים של הדור ההרמוני השני הנגזרים ממבנים קולגניים מספקים הדמיה ללא תוויות עבור ארכיטקטורות סטרומה.

פלטפורמת מיקרוסקופי מרובה-פוטונים מותאמת אישית להדמיה חיה של קרנית עכבר ולחמית

הדמיית in vivo היא כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה מתאר הדמיה טרנס-אימונית של רשתית העכבר באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי של שני פוטונים. הוא גם מדגים שיטות שונות של הדמיה חיה כדי לתייג פלואורסצנטיות קבוצות תאים מרובות של הרשתית.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

פרוטוקול זה, אשר דווח במקור על ידי פרננדז-Godino ואח '. בשנת 20161, מתאר שיטה לבודד ביעילות ותרבות העכבר RPE תאים, אשר יוצרים מונולייר RPE פונקציונלי מקוטב בתוך שבוע על לוחות Transwell. ההליך לוקח בערך 3 שעות.

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

מאמר זה מציג פרוטוקול למיקרו-דיסקציה עינית במכרסמים. התהליך כולל את האינקולציה של גלגל העין יחד עם הממברנה הניקטיבית (כלומר, העפעף השלישי). לאחר מכן מתבצעת הפרדה של המשקפיים האחוריים והקדמיים.

מיקרודיסקציה של עין המכרסם

הרשתית מציגה ארגון מרחבי מורכב על פני המבנה הלמינרי שלה. טכניקות מודרניות של טרנסקריפטומיקה מרחבית וריצוף דורשות קטעי רקמה בעובי &lt; 20 מיקרומטר, מה שמגביל את תחולת מחקר הרשתית. שיטת הקפאה טרייה זו מייצרת קטעי פנים דקים של רשתית העכבר תוך שמירה על יחסים מרחביים מישוריים, ומאפשרת מיפוי מולקולרי מקיף על פני הלמינות.

פנים פנים הקפאה של רשתית עכבר לניתוח מרחבי מרחבי בממדים גבוהים

מאמר זה מדגים שיטה לדמיון וכימות תנועתיות מיקרוגליה ומגע עם פונקטות פוסט-סינפטיות ברשתית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.

הדמיה חיה ואפיון של דינמיקת מיקרוגליה ואינטראקציות עם סינפסות ברשתית עכברים חולים

למד את טכניקת הסרת העין בעכברים לצורך פיקסציית רקמות ופנוטיפינג במסכים גבוהי תפוקה. שיטה זו מסייעת לחוקרים לזהות ציוני דרך אנטומיים ולשפר תוצאות מחקר בנוירומדע.

Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

גלה סרטונים נוספים