שחרור נוירוטרנסמיטר הדמיה באמצעות נוירוטרנסמיטר מבוסס תאים מדווחים מהונדסים פלואורסצנטיים

קחו עכבר עם חלון גולגולת המכיל שכבת גולגולת דקה כדי לאפשר הדמיה של המוח.

תנועת הראש מוגבלת באמצעות מוט ראש מחובר.

קליפת המוח מוזרקת מראש עם מדווחים מהונדסים פלואורסצנטיים מבוססי תאים, או CNiFERs, שהם תאים מדווחים המאפשרים זיהוי בזמן אמת של שחרור נוירוטרנסמיטרים.

ה-CNiFERs מבטאים קולטן נוירוטרנסמיטר מצומד לחלבון G וגלאי סידן ציטופלזמי, המורכב מתחום קושר סידן המאוחה לפלואורופורים תורמים ומקבלים.

באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני, עורר את הגלאי כדי לגרום לפליטת פלואורסצנטיות של תורם, ואפשר הדמיה של CNiFER.

פעילות עצבית המגיעה לקליפת המוח גורמת לשחרור נוירוטרנסמיטרים.

נוירוטרנסמיטורים אלה נקשרים לקולטני CNiFER ומפעילים מסלולי איתות הגורמים לשחרור סידן מהרטיקולום האנדופלזמי.

הסידן הציטופלזמי המוגבר נקשר לגלאי, וגורם לשינוי קונפורמציה שמביא את הפלואורופורים לקרבה.

התורם מעביר אנרגיה למקבל כדי לעורר את פליטת הקרינה של המקבל, מה שמעיד על שחרור נוירוטרנסמיטרים.

הנח את פלטפורמת ההדמיה עם העכבר המרוסן בראש מתחת למטרת טבילה במים פי 10 במיקרוסקופ הדמיה של שני פוטונים. הכנס את קוביית המסנן להדמיית שריג בעלת מראה דיכרואית ב-505 ננומטר ומסנני פס-פס המשתרעים על פני 460 ננומטר עד 500 ננומטר למדידת ECFP ו-520 ננומטר עד 560 ננומטר למדידת אתרוג.

לאחר מכן הוסף ACSF לבאר, המכיל את חלון הגולגולת הדק, והורד את יעד הטבילה במים פי 10 לתוך ה-ACSF. השתמש בעינית, בשילוב עם מנורת כספית וקוביית מסנן GFP כדי לאתר את ה-cNIFERs. כעת, עבור ליעד הטבילה במים פי 40.

לאחר מכן, בחר את נתיב האור המתאים להדמיית שני פוטונים. הפעל את הלייזר הפועם הפמטו-שנייה הקרוב לאינפרא אדום. בחר את אורך הגל של 820 ננומטר והגדרת הספק של 5 עד 15%. הגדר את מתח PMT1 ו-PMT2 לערך תת-מקסימלי, בדרך כלל 500 עד 1000 וולט, בהתאם ל-PMT.

לאחר מכן הגדר את הרווח ל-1 עבור כל ערוץ ו-0 את מיקום Z עבור המטרה. הורד את המטרה כ-100 עד 200 מיקרומטר מפני השטח של קליפת המוח, והתחל את סריקת x, y. התאם את רווח הספק הלייזר ואת מתח ה-PMT עבור כל ערוץ כדי לייעל את יחס האות לרעש של הקרינה של cNIFERs.

לאחר מכן, השתמש בתוכנה כדי להגביל את ההדמיה לאזור המכיל את תאי ה-cNIFERs כמו גם לאזור רקע. בחר את ממוצע קו קלמן לשניים עבור יחס אות לרעש מתאים, והשתמש בקצב סריקה של 0.3 עד 1 הרץ ב-4 מיקרו-שניות לפיקסל. לאחר מכן, צייר החזר ROI סביב תאי ה-cNIFER, המקיף כשלושה עד ארבעה תאים לכל מישור.

הגדר ניתוח בזמן אמת של עוצמות ממוצעות של החזר ROI. לאחר מכן התחל ברכישה כדי לנטר את הקרינה של cNIFER לאורך זמן, והתחל בגירוי חשמלי או ניסוי התנהגותי תוך כדי ניטור השריג