בידוד וטיהור של גליקופרוטאינים אוליגודנדרוציטים רקומביננטיים של מיאלין

MOGtag הוא גליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים רקומביננטי המשולב עם תגי מסיסות וטיהור למחקרי דלקת מוח אוטואימונית ניסיונית.

כדי לבודד MOGtag, השעו תאי חיידקים המבטאים MOGtag במאגר ליזה ודגרו.

אנזימים וחומרי ניקוי במאגר משבשים את שומני הממברנה ופוגעים בדופן התא.

סוניקט כדי לליז את התאים עוד יותר, ולשחרר גופי הכללה בלתי מסיסים המכילים MOGtag.

צנטריפוגה כדי לגלול את גופי ההכללה. השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הכדור במאגר ודגרו.

מוסיפים גואנידין הידרוכלוריד, ואז מדגרים כדי להמיס את MOGtag.

העבירו את החלבונים המסיסים על שרף ניקל טעון, ערבבו ודגרו בניעור כדי לאפשר ל-MOGtag להיקשר ליוני הניקל.

צנטריפוגה כדי לגלול את ה-MOGtag הקשור. הסר את הסופרנטנט, השהה מחדש את הכדור במאגר פליטה ודגירה עם טלטול.

אימידזול במאגר הפליטה משחרר MOGtag מהשרף.

שוב צנטריפוגה, אסוף את הסופרנטנט המטוהר המכיל MOGtag, ואחסן אותו להמשך ניתוח.

חלקו את התרביות באופן שווה בין בקבוקי 250 מיליליטר התואמים לצנטריפוגה במהירות גבוהה, ושמרו את הבקבוקים על קרח מנקודה זו ואילך. גלולה את תאי החיידקים ב -22,000 * גרם למשך 15 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש ושלבו את כל כדורי החיידקים בסך הכל 30 מיליליטר של מאגר ליזה. העבירו את הנפח הזה לצינור תחתון עגול של 50 מיליליטר המסוגל לצנטריפוגה במהירות גבוהה.

הנח את השפופרת באמבט מים של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במהלך זמן הדגירה, נער את הצינור פעמיים כדי להשעות מחדש את התאים. לאחר הדגירה, העבירו את הצינור לקרח ועשו סוניקציה של התמיסה ב-20 קילו-הרץ ובמשרעת של 70%, פעימה למשך שלוש שניות וכיבוי למשך שלוש שניות למשך 5 פולסים. סוניקציה של התמיסה לשישה סבבים בסך הכל של חמישה פולסים, מה שמאפשר לתמיסה להתקרר על קרח בין הסיבובים.

לאחר מכן, צנטריפוגה את התמיסה ב -24,000 * גרם למשך 15 דקות ב -4 מעלות צלזיוס, ואז השעו מחדש את הגלולה ב -30 מיליליטר מאגר A ודגרו על התמיסה ב -4 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר מכן, הוסיפו לתמיסה 17.2 גרם של גואנידין-HCl. דגרו את הדגימה על קרח למשך שעה כדי להמיס את חלבון תג ה-MOG. כדי לטהר את חלבון תג ה-OG, העבירו את כל נפח החלבון המסיס לצינור הראשון המכיל שרף ניקל. לאחר הערבוב, הניחו את הצינור אופקית על נדנדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר צנטריפוגה של הצינור ב-4,500 * גרם למשך שמונה דקות ב-4 מעלות צלזיוס, העבירו את הסופרנטנט לצינור השני של שרף הניקל ודגרו כמו קודם. בינתיים, השעו מחדש את שרף הניקל בצינור הראשון ב-40 מיליליטר של מאגר פליטה והניחו את הצינור אופקית על נדנדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות לפני הצנטריפוגה כמו קודם. העבירו את הסופרנטנט המכיל את חלבון תג ה-MOG לבקבוק של 250 מיליליטר שכותרתו חלבון תג MOG מטוהר. יש לשמור על בקבוק זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.