עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת GFP-אקטין
18 בנובמבר 2011
הדמיה מיקרוסקופית של תאים אנדותל לחיות להביע GFP-אקטין מאפשר אפיון של שינויים דינמיים מבנים cytoskeletal. שלא כמו טכניקות להשתמש דגימות קבוע, שיטה זו מספקת הערכה מפורטת של השינויים הזמני cytoskeleton אקטין בתאי אותו לפני, במהלך ואחרי גירויים פיזיים, תרופתי, או דלקתיים שונים.
מטרת פרוצדורה זו היא לצפות בשינויים דינמיים בשלד האקטין של תאי אנדותל חיים. ראשית, בצע טרנספקציה של תאי אנדותל מווריד טביליות של אדם (human umbilical vein endothelial cells) באמצעות פלסמיד A GFP beta actin, וגדל אותם עד להגעה לקונפלואנס על לבישי זכוכית (cover slips). לאחר מכן, מקם את לבישי הזכוכית בתא דימוי של תאים חיים הכולל במה מחוממת והזרמה של תמיסה פיזיולוגית המכילה אלבומין.
השלב הסופי הוא רכישת נתונים של אזור תאים נבחר באמצעות לכידת תמונות בשיטת time-lapse לפני ואחרי טיפול בחומר פרמקולוגי. ניתוח גרפי של Chime באמצעות תוכנות עיבוד תמונות כגון Image J יכול לספק תובנות לגבי בליטות של רגליים דמויות-עמודים (podia) מקומיות, כגון מרחק, זמן ומהירות של הבליטות, וכן תנועת סיבי אקטין לאורך זמן. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דימוי באימונופלואורסצנציה, הוא שדימוי תאים חיים מאפשר שילוב של הטבע הדינמי של ה-act ושל שלד התא במחקרים על המנגנונים הקובעים את חדירות האנדותל.
בעוד שתאים צבועים ומקובעים מייצגים תצלומיות של רגעים בודדים בזמן ומספקים מידע מוגבל על הדינמיקה של הפעולה והשלד התאי לפני ואחרי טיפול במתווך דלקתי, במטריצת בטיחות ביולוגית. עקרו לוחות כיסוי ב-70%ethanol למשך שתי דקות ולאחר מכן ייבשו באוויר. הניחו כל לוח כיסוי בתוך צלחת תרבית של 10 סנטימטר והוסיפו 300 microliters של תמיסת ג'לטין חמה למרכז, מבלי לגעת בקצוות לוח הכיסוי. לאחר חמש דקות, שאבו את הנוזל.
כעת קצרו תרבית תאים רוויה של תאי אנדותל מווריד טביליות אנושי (VE) באמצעות 0.25% tripsin EDTA. ספרו את התאים ורספו אותם באמצעות סנטריפוגציה. שאבו החוצה כמה שיותר מתווך ה-SUP natum לצורך תגובת טרנספקציה עם ערכת ה-VE nuclear effector.
יש להשעות מחדש את משקעי התאים בתמיסת nuclear effector בסיסית ולהוסיף 0.2 עד שני מיקרוגרם של פלסמיד וקטור GFP beta actin. העבירו 100 microliters של ת сусפנזיית התאים ל-nuclear effector qve. הקישו מספר פעמים על ה-vete המכוסה כדי לוודא שאין בועות אוויר בין תחתית ה-Q vet לבין דגימת הטרנספקציה.
הכנס את ה-Q VET למכשיר ה-nuclear effector two והפעל את תוכנית A 0 3 4; בעזרת פפיטה להעברה מהערכת ה-nuclear effector, העבר 500 microliters של מצע EGM two MV מחומם אל ה-qve. לאחר מכן, העבר את התערובת בחזרה לשפופרת המיקרו-צנטריפוגה והדגר למשך 15 דקות. ערבב בעדינות את תסחיף ה-VE שעבר טרנספקציה פעם אחת, וטפטף 300 microliters מהתסחיף על לבישה מצופה ג'לטין מבלי לגעת בקצוות.
לאחר מכן דגרו למשך שעה אחת עד ארבע שעות. בדקו את התאים שעברו טרנספקציה כדי לוודא היצמדות לכיסוי הזכוכית (cover slip). לאחר מכן, הוסיפו לצלחת 10 milliliters של מצע E GM two MV, והמשיכו בדגירה לצורך ביטוי של GFP.
ראשית, יש להוסיף תמיסת מלח פיזיולוגית עם אלבומין (PSS) למערכת הזרימה בכוח הכבידה ולחברה אותה למחמם השורייני (inline heater). כעת, כווננו את וסת הזרימה כדי להשיג קצב זרימה של כ-40 milliliters per hour. לאחר מכן, הפסיקו את הזרימה על ידי סגירת הברז באמצעות מקלון צמר גפן.
מרחו גריז ואקום על הקצה החיצוני של הצד התחתון של אמבט היהלום. כעת הוציאו תרבית שעברה טרנספקציה מהאינקובטור. הרימו בעדינות את לביבת הזכוכית (cover slip) באמצעות פינצטה.
לאחר מכן, בעזרת נייר סופג מסוג Kim wipe, ספגו את עודפי מצע ה-EGM two MV מהשקופית התחתונה, כאשר פני התאים פונים כלפי מעלה. הניחו את אמבט היהלום מעל לכיסוי הזכוכית כדי ליצור תא. הכניסו במהירות את התא למחמם הבמה.
הדקו את התפסנים מעל התא והעבירו בעזרת פיפט כ-1 mL של מצע EGM two MV מהצלחת אל תוך התא. כעת חברו את צינור הוואקום למחזיק שלו בצדו השמאלי של התא ואת קו ה-A PSS מהמחמם המקוון (inline heater) אל הערוץ בצדו הימני של התא. לאחר מכן הפעילו את הוואקום ופתחו את קו ה-A PSS כדי לאפשר פרפוזיה של האמבט על התאים שעברו טרנספקציה.
הפעילו גם את המחמם המקוון (inline heater) על 37 degrees Celsius. לאחר מכן, הניחו את חיישן התרמיסטור של הבמה המחוממת לתוך האמבטית בקצה והפעילו את מחמם הבמה על 37 degrees Celsius. כדי להסיר שאריות של מצע EGM two MV והצטברות של מלחים, נגבו בזהירות את הצד התחתון של לביש התכסית באמצעות Kim wipe ספוג ב-70% ethanol, ולאחר מכן באמצעות Kim wipe יבש. השאירו את תאי ה-HU שעברו טרנספקציה להשגת שיווי משקל למשך 30 דקות.
נעלו את המהלך. התמקדו באזור הנבחר של תרבית התאים למחקר. הגדירו את זמן החשיפה של המצלמה בין 0.5 לשתי שניות, בהתאם לעוצמת אות ה-GFP Act בתאים.
הגדירו גם את זמני המרווח והמשך עבור הניסוי. כעת, כאשר אורות החדר כבויים, צלמו תמונה בודדת כדי להעריך את ההגדרות. צלמו את סדרת ה-time lapse תוך ניטור התמונות ככל שנדרש.
בפרוטוקול טיפוסי, השג 20 עד 30 דקות של תמונות בסיס (baseline) לפני הוספת חומר הבדיקה, ולאחריהן 0.5 עד ארבע שעות של רכישת תמונות נוספות. לבסוף, כפי שפורט בטקסט הנלווה, העरक את מרחק הבליטה, ההתמדה והמהירות של ה-lamely podia באמצעות ניתוח גרף CH. בניסוי טיפוסי, GFP actin מבוטא ביותר מ-50% מה-VE שעברו טרנספקציה באופן אקראי.
תמונות אלו, שנרכשו פעם בדקה, לכדו GFP actin לאורך הציטופלזמה, כמו גם במבנים סיביים וב-melipodia מקומיים הבולטים לאורך שולי התא. התמדת המרחק והמהירות של בליטות התא מכומתות מתוך סדרות תמונות של צילוםים רצופים (time-lapse). באמצעות ניתוח גרף chm, ראשית, נמתח קו של פיקסל בודד בניצב גס לשולי התא.
אזור זה מופק מכל תמונה בסט ה-time-lapse כדי ליצור מונטאז' של האזור לאורך זמן או גרף chime; כאן, מנקודת מבט משמאל לימין בגרף ה-chime, בליטות מיוצגות כתנועות כלפי מעלה בקצה התא. כאשר קו מונח על קצה אחת מהבליטות הללו, ניתן לאסוף את נתוני הפיקסלים הקשורים לאותו קו כדי לכמת את דינמיקת הבליטות. ניתן להשתמש במספר הכולל של הבליטות בגרף chm כדי להעריך את תדירות הבליטות.
ניתוח זה מתאר תנועות של סיבי מאמץ (stress fibers) שנוצרו סמוך להיקף התא ונעו לעבר מרכז התא, שם הם התפרקו בסופו של דבר. בגרף ה-chio, סיבי המאמץ מופיעים כקווים רציפים באזור הציטופלזמה, ולעתים קרובות נעים כלפי מטה וימינה לעבר מרכז התא. כאשר קשה להבחין בסיבים בגרף ה-chio המקורי, פילטר unsharp mask מחדד את התמונה, וקווים המסומנים על סיבי המאמץ מקלים על איסוף נתוני הפיקסלים באמצעות פונקציית המדידה (measure). לחלופין, קווים שנמתחים מתחילתו ועד סופו של סיב המאמץ שזוהה, מספקים ממוצע נתוני פיקסלים למשך כל הזמן שבו נצפה הסיב.
מצגת זו הדגימה כיצד לנתח נתונים מסט תמונות time-lapse באמצעות ניתוח גרפי עם תוכנות כגון Image J. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לחקור את הדינמיקה של שלד התא מactin בתגובה למתווכי דלקת, באמצעות דימוי של תאים חיים של תאי אנדותל שעברו טרנספקציה.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לצפייה בשינויים דינמיים בשלד התא של אקטין בתאי אנדותל חיים באמצעות דימוי GFP-actin. טכניקה זו מאפשרת הערכה בזמן אמת של הדינמיקה של שלד התא בתגובה לגירויים שונים, ובכך מספקת תובנות לגבי מנגנוני חדירות האנדותל.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- טכניקות דימות
רקע
- תאי אנדותל ממלאים תפקיד מכריע בביולוגיה של כלי הדם.
- שלד האקטין חיוני לצורת התא ולניידותו.
- שיטות דימוי מסורתיות נכשלות לעיתים קרובות בלכידת תהליכים תאיים דינמיים.
- דימוי תאים חיים מספק הבנה מקיפה יותר של הדינמיקה של שלד התא.
מטרת המחקר
- לתצפית על ההתנהגות הדינמית של שלד התא האקטיני בתאי אנדותל חיים.
- להערכת ההשפעות של חומרים פרמקולוגיים על שינויים בשלד התא.
- לשיפור ההבנה של מנגנוני חדירות האנדותל.
שיטות שנ utilização
- טרנספקציה של תאי אנדותל של וריד טבילית אנושי (HUVECs) עם פלסמיד GFP-actin.
- גידול תאים על כיסויי זכוכית (cover slips) לצורך דימות.
- דימות במרווחי זמן (Time-lapse imaging) ללכידת דינמיקת השלד התאי לפני ואחרי טיפול.
- ניתוח של דינמיקת בליטות באמצעות תוכנת דימות.
תוצאות עיקריות
- דימוי בזמן אמת חשף שינויים משמעותיים בדינמיקה של actin בתגובה לגירויים.
- ניתוח כמותי הראה וריאציות במרחק הבליטה, בהתמדה ובמהירות.
- הבעת GFP-actin אושרה ביותר מ-50% מהתאים שעברו טרנספקציה.
- שינויים דינמיים בשלד התא תועדו ונותחו ביעילות.
מסקנות
- דימוי תאים חיים הוא כלי רב עוצמה לחקר דינמיקת השלד התאי.
- שיטה זו משפרת את ההבנה של התנהגות תאי אנדותל תחת תנאים שונים.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל טכניקה זו כדי לחקור תהליכים תאיים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת ההתנהגות הדינמית של שלד התא המבוסס על אקטין בתאי אנדותל היא קריטית להערכת שלמות מחסום כלי הדם בתהליכי גילוי תרופות. דימות תאים חיים של GFP-actin מאפשר תצפית בזמן אמת על תגובות שלד התא למתווכי דלקת, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטית של טיפולים המכוונים לכלי דם. גישה זו מספקת תובנות ניבויות לגבי שינויים בחדירות האנדותל, המנחים החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) בשלב הפיתוח הפרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של דינמיקת actin בתאי אנדותל חיים בתנאי דלקת.
- ערך מדעי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי קישור שינויים בשלד התא לשלמות הצומת (junctional integrity) ולתפקוד המחסום.
- ערך מדעי: תורם לביטחון במיקוד החזוי (predictive confidence) על ידי לכידה של ארגון מחדש תלוי-זמן של actin המתואם עם שינויים בחדירות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מודלים אנדותליאליים עשויים (validated) לסריקת תרכובות בהמשך, על ידי קביעת דינמיקת האקטין הבסיסית.
- ערך מדעי: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות ניתוח קימוגרף כמותי של מרחק הבליטה, ההתמדה והמהירות של הלמליפודיה.
- ערך מדעי: תומך במוכנות לסריקה על ידי אספקת תוצאות ה-time-lapse הניתנות לשחזור של תגובות השלד התאי לסוכנים פרמקולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על הרלוונטיות למחלה על ידי מידול תגובות של תאי אנדותל מווריד טביליות אנושי לגרויים דלקתיים.
- ערך מדעי: מבטיח המשכיות תרגומית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מדדים דינמיים וכמותיים של השלד התאי.
- ערך מדעי: מסייע בקבלת החלטות על התקדמות מותאמת סיכונים באמצעות זיהוי מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס פגיעה ושחזור של מחסום התאים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), באמצעות אספקת קריאות פנוטיפיות דינמיות של תגובות תאי אנדותל.
- ביולוגיית גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור נתיבים על ידי ויזואליזציה של lamellipodia עשירים באקטין ותחלופה של סיבי מאמץ (stress fibers) בתאים חיים.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות דימות time-lapse סטנדרטי וניתוח קיימוגרף של דינמיקת בליטות.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות של מרחק, התמדה ומהירות של בליטות כדי לאפשר הערכה השוואית של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי מידול מנגנוני מחסום אנדותליאלי הרלוונטיים למחלות כלי דם.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימות של תאים חיים לשימוש חוזר לצורך חקר דינמיקה של השלד התאי בסוגי תאים ובגירויים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במנגנוני חדירות אנדותל.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות מדדים כמותיים של השלד התאי הנגזרים מנתוני time-lapse.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי אספקת תובנות מוקדמות מבוססות-מנגנון לגבי רעילות כלי דם או אותות יעילות.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם-סיכון בהתבסס על השפעותיהן על דינמיקת האקטין האנדותליאלית ותפקוד המחסום.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרבית תאי אנדותל, טרנספקציה וטכניקות של דימיון תאים חיים (live-cell imaging).
- תלוי במערכות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית המסוגלות לביצוע רכישת תמונות בשיטת time-lapse ובקרת סביבה (37°C, פרפוזיה פיזיולוגית).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי רכישת תמונות ופרוטוקולים לניתוח קימוגרפים (kymograph) לצורך פרשנות עקבית של הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת המודל לסוגים אחרים של תאי אנדותל או תאים שאינם אנדותליים.
- מוגבל על ידי יעילות הטרנספקציה ושונות בביטוי GFP-actin, אותן יש לכמת כדי להבטיח את אמינות הנתונים.
