Name: עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת GFP-אקטין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: חקור דינמיקת ציטוסקלטון האקטין בתאי אנדותל חיים באמצעות GFP-אקטין. שיטת הדמיה בזמן אמת זו מאפשרת ניתוח שינויים בתגובה לגירויים שונים ומספקת הבנה מעמיקה של מנגנוני חדירות אנדותלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

GFP-β-אקטין פלסמיד סופק בנדיבות על ידי ד&quot;ר ווין אור, LSUHSC-S המחלקה לפתולוגיה, והיה מוגבר במעבדה של ד&quot;ר בקי Worthylake, LSUHSC-NO המחלקה לפרמקולוגיה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (P20 RR-018766) ואת איגוד הלב האמריקני (05835386N).

<ol><li>Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GTPases+in+control+of+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Role of GTPases in control of microvascular permeability.</a> Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).</li>
<li>Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+the+regulation+of+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Vascul.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability.</a> Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).</li>
<li>Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+pathways+in+enhanced+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability.</a> Microcirculation. 7, 395-403 (2000).</li>
<li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTPases+in+mechanosensitive+regulation+of+endothelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier.</a> Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).</li>
<li>Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W. Microcirculatory Exchange Function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuran%2C+WN+%22Handbook+of+Physiology%3A+Microcirculation%22">Handbook of Physiology: Microcirculation</a>. Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. , 2nd Edition, Elsevier. San Diego. 81-124 (2008).</li>
<li>Hu, Y. L., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+motion+of+paxillin+on+actin+filaments+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).</li>
<li>Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+ruffles+in+cell+migration%3A+indicators+of+inefficient+lamellipodia+adhesion+and+compartments+of+actin+filament+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization.</a> Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).</li>
<li>Hotulainen, P., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+fibers+are+generated+by+two+distinct+actin+assembly+mechanisms+in+motile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells.</a> J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).</li>
<li>Pellegrin, S., Mellor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+stress+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Actin stress fibres.</a> J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).</li>
<li>Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics in living mammalian cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).</li>
<li>Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+mechanical+strain+of+an+endogenous+cytoskeletal+network+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells.</a> Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).</li>
<li>Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Rho+GTPases+in+thrombin-induced+lung+vascular+endothelial+cells+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction.</a> Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).</li>
<li>van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability%3A+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87, 335-340 (2000).</li>
<li>Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+histamine+and+thrombin+on+endothelial+barrier+function+through+actin-myosin+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).</li>
<li>Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWittman%2C+T+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 184-204 (2005).</li>
<li>Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRabut%2C+G+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הדמיה של ה-GFP-אקטין בתאי אנדותל לחיות מאפשר ניתוח מפורט של הדינמיקה של cytoskeleton אקטין בתגובה לגירויים דלקתיים. שיטה זו עשויה להיות שימושית גם לבנות על ממצאים קודמים מראה שיפוץ cytoskeleton בתגובה כוחות פיזיים כמו מתח גזירה 11. בנוסף, שיטה זו מאפשרת הערכה מפורטת של התרומה של הדינמיקה אקטין cytoskeletal על פעילויות שונות תא האנדותל, כולל הגירה, מיטוזה, היווצרות של צמתים אינטר והתבגרות junctional, תפקוד ותחזוקה של המכשול. ב הנתונים המוצגים, התנהגותם של cytoskeleton אקטין אנדותל ניתן לראות לפני ואחרי הטיפול עם תרומבין. Lamellipodia מקומי כל בשולי לתאי אנדותל נצפו להרכיב רגרסיה לאורך זמן monolayers התא הן nonconfluent ומחוברות. טיפול עם תרומבין בקצרה קטע טופס lamellipodiaation מחזור. טרומבין גם גרמה לתאים להתכווץ מעט, בהסכמה עם דיווחים קודמים כי תרומבין גורמת ללחץ סיבי אקטין היווצרות מתח מוגבר להתפתחות צנטריפטלי בתאי אנדותל 12-14. עם זאת, מן המחקרים תא חי הדמיה כגון זה, מקורם של הסיבים הלחץ כעת ניתן נחוש. ב HUVEC, רוב הסיבים מתח מקורן בשולי התא דומה סיבי קשת רוחבי של תאים נודדים 8, 9. כוח נוסף של שיטה זו על פני שימוש בתאים קבועים שמספר סיבי המתח ניתן לכמת בתאים בודדים לפני ואחרי הטיפול תרומבין, ביטול הטיית בחירה בין קבוצות הניסוי. באמצעות פרוטוקול זה אנו מעריכים תנועה דינמית של קצה תא הלחץ סיבי אקטין. כדי להבין את הדינמיקה מונומר אקטין בתאי אנדותל, טכניקות מתקדמות יותר כגון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) או פלואורסצנטי רבב מיקרועותק (FSM) יכול להיות מיושם 15, 16. בנוסף, בגלל כלי הדם לתאי אנדותל יכול לייצג מודל טוב יותר של תפקוד מחסום כלי הדם, אופטימיזציה של פרוטוקולים transfection לבטא בצורה יעילה GFP-אקטין בתאי אנדותל כלי הדם מייצג הכיוון העתידי הגיוני. לסיכום, הדמיה של בתאי האנדותל לחיות להביע GFP-אקטין מהווה כלי רב עוצמה כדי לקבוע כיצד cytoskeleton אקטין תא האנדותל מגיב סוגים שונים של גירויים. מחקרים באמצעות monolayers אנדותל ומחוברות היטב תסייע לקבוע את התפקידים של מבנים דינמיים כגון אקטין עשיר lamellipodia ו רוחבי מתח קשת סיבים בתפקוד האנדותל מחסום. בנוסף, הדמיה של תא חי לתאי אנדותל להביע GFP-אקטין או חלבונים היתוך אחרים המאפשרים הדמיה של מבנים subcellular אחרים יספק מידע spatiotemporal מפורט כדי להבין את מנגנוני איתות מבניים דetermine שלמות המכשול.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. רינגר 5x במלאי </td></tr><tr><td> כימי </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוג </td><td> כמות </td></tr><tr><td> נתרן כלוריד </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 גרם </td></tr><tr><td> אשלגן כלוריד </td><td> JT בייקר </td><td> 3040 </td><td> 1.75 גר &#39; </td></tr><tr><td> סידן כלוריד </td><td> סיגמא </td><td> C-3881 </td><td> 1.47 גר &#39; </td></tr><tr><td> מגנזיום סולפט </td><td> סיגמא </td><td> M-9397 </td><td> 1.44 גר &#39; </td></tr><tr><td> מים מסוננים ועיקור </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> מביאים L 1 </td></tr><tr><td colspan="4"> סינון סטרילי לתוך בקבוקים חנויות autoclaved ב 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. מגבים חיץ </td></tr><tr><td> כימי </td><td>חברה </td><td> מספר קטלוג </td><td> כמות </td></tr><tr><td> מגבים </td><td> סיגמא </td><td> M3183 </td><td> 125.6 גרם </td></tr><tr><td> מים מסוננים ועיקור </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> מביאים L 1 </td></tr><tr><td colspan="4"> סינון סטרילי לתוך בקבוקים חנויות autoclaved ב 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. הפתרון אלבומין מלח פיזיולוגיים (APSS) </td></tr><tr><td> כימי </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוג </td><td> כמות </td></tr><tr><td> רינגר מניות (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מגבים הצפת </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סודיום פוספט </td><td> סיגמא </td><td> S-9638 </td><td> 0.168 גרם </td></tr><tr><td> Pyruvate נתרן &lt;/ Td&gt; <td> סיגמא </td><td> P5280 </td><td> 0.22 גר &#39; </td></tr><tr><td> מלח נתרן EDTA </td><td> סיגמא </td><td> ED2SS </td><td> 0.0074 גרם </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G7528 </td><td> 0.901 גרם </td></tr><tr><td> אלבומין, שור </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 גרם </td></tr><tr><td> מים מסוננים ועיקור </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> מביאים L 1 </td></tr><tr><td colspan="4"> התאם את ה-pH 7.4 בשעה 37 ° C, ואז לסנן לתוך בקבוקים סטריליים autoclaved ולאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. 0.9% Saline </td></tr><tr><td> כימי </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוג </td><td> כמות </td></tr><tr><td> נתרן כלוריד </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 גרם </td></tr><tr><td> מים מסוננים ועיקור </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> מביאים L 1 </td></tr><tr><td colspan="4"> סינון סטרילי לתוך בקבוקים חנויות autoclaved ב 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. הפתרון לטין 1.5% </td></tr><tr><td> לטין מהעור חזירי </td><td> סיגמא </td><td> G2500 </td><td> 15 גרם </td></tr><tr><td> 0.9% Saline </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> מביאים L 1 </td></tr><tr><td colspan="4"> חם הפתרון 37 ° C כדי להמיס הג&#39;לטין מספיק. אמנם עדיין חמים, לסנן לתוך בקבוקים סטריליים autoclaved ולאחסן ב 4 ° C </td></tr></tbody></table>

עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת gfp-אקטין

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

האנדותל כלי הדם ממלא תפקיד חשוב כמחסום סלקטיבי חדיר נוזלים מומסים. צמתים דבק בין לתאי אנדותל להסדיר החדירות של האנדותל, ומחקרים רבים הראו את תרומתו החשובה של cytoskeleton אקטין לקביעת שלמות junctional 1-5. חגורת אקטין קורטיקלי נחשב חשוב לשמירה על יציבות צמתים 1, 2, 4, 5. לעומת זאת, סיבי אקטין מתח נחשבים ליצור מתיחות בתוך צנטריפטלי ותאי האנדותל כי מחלישה צמתים 2-5. הרבה תיאוריה זו התבססה על מחקרים שבהם לתאי אנדותל מטופלים עם מתווכים דלקתיים ידוע להגדיל חדירות האנדותל, ולאחר מכן תיקנה את התאים תיוג F-אקטין להסתכלות מיקרוסקופית. עם זאת, מחקרים אלו מספקים הבנה מוגבלת מאוד של תפקיד cytoskeleton אקטין כי תמונות של תאים קבוע לספק תמונות בלבדזמן ללא מידע על הדינמיקה של מבנים אקטין 5. Live-תא הדמיה מאפשר שילוב של האופי הדינמי של cytoskeleton אקטין לתוך המחקרים של מנגנוני קביעת שלמות מחסום אנדותל. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי ההשפעה של גירויים דלקתיים שונים על מבנים אקטין בתאי אנדותל ניתן להעריך אותה קבוצה של תאים חיים לפני ואחרי טיפול, הסרת הטיה פוטנציאלית שעלולה להתרחש בעת התבוננות דגימות קבועות. האדם וריד הטבור לתאי אנדותל (HUVEC) הם transfected עם אקטין GFP-β פלסמיד וגדל מפגש על coverslips זכוכית. זמן לשגות תמונות של ה-GFP-אקטין ב HUVEC ומחוברות נלכדים לפני ואחרי תוספת של מתווכים דלקתיים כי לעורר תלוי זמן שינויים שלמות מחסום אנדותל. מחקרים אלה מאפשרים תצפית ויזואלית של רצף נוזל שינויים cytoskeleton אקטין שתורמים endotheliaאני שיבוש מחסום ושיקום. התוצאות שלנו מראים בעקביות המקומי, אקטין עשיר היווצרות lamellipodia מחזור בתאי אנדותל. התהוות ותנועה של סיבי אקטין הלחץ יכול להיות גם ציין. ניתוח תדירות היווצרות מחזור של lamellipodia המקומית, לפני ואחרי הטיפול עם גירוי דלקתי יכול להיות מתועד על ידי מנתח רשם גלים. מחקרים אלו מספקים מידע חשוב על אופייה הדינאמי של cytoskeleton אקטין בתאי אנדותל שניתן להשתמש כדי לגלות המנגנונים המולקולריים מזוהה קודם לכן חשוב לשמירה על שלמות המחסום אנדותל.

הדמיה מיקרוסקופית של תאים אנדותל לחיות להביע GFP-אקטין מאפשר אפיון של שינויים דינמיים מבנים cytoskeletal. שלא כמו טכניקות להשתמש דגימות קבוע, שיטה זו מספקת הערכה מפורטת של השינויים הזמני cytoskeleton אקטין בתאי אותו לפני, במהלך ואחרי גירויים פיזיים, תרופתי, או דלקתיים שונים.

עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת GFP-אקטין

האנדותל המיקרו-וסקולרי ממלא תפקיד חשוב כמחסום בעל חדירות סלקטיבית לנוזלים ולממסים. הצמתים הדבקיים בין תאי האנדותל...

מטרת פרוצדורה זו היא לצפות בשינויים דינמיים בשלד האקטין של תאי אנדותל חיים. ראשית, בצע טרנספקציה של תאי אנדותל מווריד טביליות אנושי (HUVECs) באמצעות פלסמיד A GFP beta actin, וגודל אותם עד להגעה לקונפלואנציה על לבישי זכוכית (cover slips). לאחר מכן, מקם את לבישי הזכוכית בתא דימוי של תאים חיים עם במה מחוממת והזרמה של תמיסה פיזיולוגית המכילה אלבומין.השלב הסופי הוא רכישת נתונים של אזור תאים נבחר באמצעות צילום time-lapse לפני ואחרי טיפול בחומר פרמקולוגי. ניתוח גרפי של התנועה באמצעות תוכנת דימוי כגון Image J יכול לספק תובנות לגבי בליטות podia מקומיות, כגון מרחק, זמן ומהירות של הבליטות, וכן תנועת סיבי אקטין לאורך זמן. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דימוי אימונופלואורסצנציה, הוא שדימוי תאים חיים מאפשר שילוב של הטבע הדינמי של ה-act ושל שלד התא במחקרים על המנגנונים הקובעים את חדירות האנדותל.בעוד שתאים צבועים ומקובעים מייצגים תמונות רגעיות בזמן ומספקים מידע מוגבל על הדינמיקה של ה-act ושל השלד התאי לפני ואחרי טיפול במתווך דלקתי, בתוך מabilis בטיחות ביולוגית. עקרו לוחות כיסוי עם 70% ethanol למשך שתי דקות ולאחר מכן ייבשו באוויר. מקמו כל לוח כיסוי בתוך צלחת תרבית של 10 סנטימטר והוסיפו 300 microliters של תמיסת ג'לטין חמה למרכז, ללא מגע עם קצוות לוח הכיסוי. לאחר חמש דקות, שאבו את הנוזל.כעת קצרו תרבית בצפיפות גבוהה (confluent) של תאי אנדותל מווריד טביליות אנושי, או VE, באמצעות 0.25% tripsin EDTA. ספרו את התאים ורכזו אותם על ידי סבוב במערכת צנטריפוגה. שאבו כמה שיותר מתווך ה-SUP natum לצורך תגובת טרנספקציה עם ערכת ה-VE nuclear effector.יש להשעות מחדש את משקעי התאים בתוך תמיסת nuclear effector בסיסית ולהוסיף 0.2 עד שני מיקרוגרם של פלסמיד וקטור GFP beta actin. העבר 100 microliters של תרחיף תאים לתוך nuclear effector qve. הקיש מספר פעמים על ה-vete המכוסה כדי לוודא שאין בועות בין תחתית ה-Q vet לבין דגימת הטרנספקציה.הכנס את ה-Q VET למכשיר ה-nuclear effector two והפעל את תוכנית A 0 3 4. בעזרת פיפטה להעברה מהערכה של ה-nuclear effector, העבר כמות מחוממת של 500 microliters של מצע EGM two MV אל ה-qve. לאחר מכן, העבר את התערובת בחזרה לשפופרת המיקרו-צנטריפוגה והדגר למשך 15 דקות. ערבב בעדינות את תרחיף ה-VE שעבר טרנספקציה פעם אחת, וטפטף 300 microliters מהתרחיף על לבישת זכוכית מצופה ג'לטין ללא מגע בקצוות.לאחר מכן, דגרו למשך שעה עד ארבע שעות. בדקו את התאים שעברו טרנספקציה כדי לוודא שהם נצמדו לכיסוי הזכוכית (cover slip). לאחר מכן, הוסיפו למנה 10 milliliters של מצע E GM two MV, והמשיכו בדגירה לצורך ביטוי של GFP.ראשית, יש להוסיף תוצר של תמיסת מלח פיזיולוגית עם אלבומין או PSS למערכת הזרימה בכוח הכבידה ולחברה אותה למחמם השורה. כעת, יש לכוונן את וסת הזרימה כדי להשיג קצב זרימה של כ-40 milliliters per hour. לאחר מכן, יש להפסיק את הזרימה על ידי סגירת הברז באמצעות מקלון צמר.מרחו גריז ואקום על הקצה החיצוני של הצד התחתון של אמבט היהלום. כעת הוציאו תרבית שעברה טרנספקציה מהאינקובטור. הרימו בעדינות את כיסוי הזכוכית (cover slip) באמצעות פינצטה.לאחר מכן, בעזרת נייר ניגוב מסוג Kim wipe, ספגו את עודפי מצע ה-EGM two MV מהשקופית התחתונה, כאשר פני התאים פונים כלפי מעלה. הניחו את אמבט היהלום מעל לכיסוי הזכוכית כדי ליצור תא. העבירו במהירות את התא אל מחמם הבמה.הדקו את התפסנים מעל התא והעבירו בפיפטה כ-1 mL של מצע EGM two MV מהפלטה אל תוך התא. כעת חברו את צינור הוואקום למחזיק שלו בצד שמאל של התא ואת קו ה-A PSS מהמחמם המקוון (inline heater) אל התעלה בצד ימין של התא. לאחר מכן, הפעילו את הוואקום ופתחו את קו ה-A PSS כדי לאפשר פרפוזיה של האמבט מעל התאים שעברו טרנספקציה.הפעילו גם את המחמם השורה (inline heater) בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, הניחו את חיישן התרמיסטור של הבמה המחוממת לתוך האמבטית בקו הקצה והפעילו את מחמם הבמה בטמפרטורה של 37 °C. כדי להסיר שאריות של מצע EGM two MV והצטברות של מלחים, נגבו בזהירות את הצד התחתון של לבישת הכיסוי בעזרת נייר Kim wipe ספוג ב-70% ethanol, ולאחר מכן בעזרת נייר Kim wipe יבש. השאירו את תאי ה-HU שעברו טרנספקציה להשגחה (equilibrate) למשך 30 דקות.נעלו את המיקוד. התמקדו באזור הנבחר של תרביות התאים לצורך המחקר. הגדירו את זמן החשיפה של המצלמה לבין 0.5 לשתיים שניות, בהתאם לעוצמת אות ה-GFP Act בתאים.הגדירו גם את זמני המרווח והמשך עבור הניסוי. כעת, כאשר אורות החדר כבויים, צלמו תמונה בודדת כדי להעריך את ההגדרות. צלמו את סדרת צילומי השהיית הזמן (time lapse) תוך ניטור התמונות כפי שנדרש.בפרוטוקול טיפוסי, השג 20 עד 30 דקות של תמונות בקו בסיס לפני הוספת חומר בדיקה, ולאחריהן 0.5 עד ארבע שעות של רכישת תמונות נוספות. לבסוף, כפי שפורט בטקסט הנלווה, העरक את מרחק הבליטה, ההתמדה והמהירות של ה-lamely podia באמצעות ניתוח גרף CH. בניסוי טיפוסי, GFP actin מובע ביותר מ-50% מה-VE שעברו טרנספקציה באופן אקראי.תמונות אלה, שצולמו אחת לדקה, לכדו GFP actin לאורך הציטופלזמה, כמו גם במבנים סיביים וב-e meli podia מקומיים הבולטים לאורך קצה התא. עקביות המרחק והמהירות של בליטות התא מכומתים מתוך סדרות של תמונות time-lapse. באמצעות ניתוח chm graph, ראשית, נמתח קו של פיקסל בודד בניצב גס לקצה התא.אזור זה מופק מכל תמונה בסט ה-time-lapse כדי ליצור מונטאז' של האזור לאורך זמן או גרף chime; כאן, מנקודת מבט משמאל לימין בגרף ה-chime, בליטות מיוצגות כתנועות כלפי מעלה בקצה התא. כאשר קו מונח על קצה אחת מהבליטות הללו, ניתן לאסוף את נתוני הפיקסלים הקשורים לאותו קו כדי לכמת את דינמיקת הבליטות. ניתן להשתמש במספר הכולל של הבליטות בגרף chm כדי להעריך את תדירות הבליטות.ניתוח זה מתאר תנועות של סיבי מאמץ (stress fibers) שנוצרו סמוך להיקף התא ונעים לעבר מרכז התא, שם הם בסופו של דבר מתפרקים. בגרף ה-chio, סיבי המאמץ מופיעים כקווים רציפים באזור הציטופלזמה, לרוב בתנועה כלפי מטה וימינה לעבר מרכז התא. כאשר הסיבים קשים לזיהוי בגרף ה-chio המקורי, מסנן unsharp mask מחדד את התמונה; קווים המסומנים על גבי סיבי המאמץ מקלים על איסוף נתוני פיקסלים באמצעות פונקציית המדידה (measure). לחלופין, קווים הנמתחים מתחילתה ועד סופה של סיב מאמץ מזוהה, מספקים ממוצע נתוני פיקסלים למשך כל הזמן שבו נצפה הסיב.מצגת זו הדגימה כיצד לנתח נתונים מסט תמונות של צילום רצף זמנים (time-lapse) באמצעות ניתוח גרפי עם תוכנות כגון Image J. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לחקור את הדינמיקה של שלד התא מ-actin בתגובה למתווכי דלקת, תוך שימוש בדימוי תאי חיים של תאי אנדותל שעברו טרנספקציה.

study-actin-cytoskeleton-live-endothelial-cells-expressing-gfp

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

, מבחר microinjection, הדמיה של fluorescently שכותרתו F-אקטין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רבב (FSM).

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

מאמר זה נועד להדריך את הקורא בפעולה של כוח אטומי משולב אופטי מיקרוסקופ הדמיה לגירוי מכני של תאים חיים בתרבות. פרוטוקול צעד אחר צעד מוצג. נתונים נציג קבוצה שמראה תא חי בתגובה לגירוי מכני מוצג.

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

שיטה לחזות ולכמת F-אקטין מסתיים דוקרני קונוסים הצמיחה העצבית מתוארת. לאחר נוירונים culturing על coverslips זכוכית, תאים permeabilized עם פתרון saponin המכילים. ואז, דגירה קצר עם למאגר saponin המכיל rhodamine-אקטין משלבת אקטין פלואורסצנטי על קצות אקטין חינם תיל.

סימון ה-F-אקטין מסתיים דוקרני עם אקטין Rhodamine ב Permeabilized קונוסים הצמיחה העצבית

תהליכים תאיים כגון נדידת תאים מסורתי נחקרו על דו מימדי, משטחי פלסטיק נוקשה. דו"ח זה מתאר טכניקה ישירות חזותי לוקליזציה חלבון וניתוח הדינמיקה חלבון בתאי נודדות בתוך מטריצה ​​יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית תלת מימדי,.

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

בשילוב של השתלת תאים, תיוג שלד ציטו וגישות אובדן/רווח תפקוד, פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בצלחת הקדם-כורדלית הפוטנציאלית של דג הזברה הנודד כדי לנתח את תפקודו של גן מועמד בנדידת תאים in vivo.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

פונקציות אנדוזום מוקדם תלויים פלמור אקטין-F. כאן, אנו מתארים מבוסס מיקרוסקופיה במבחנה assay זה reconstitutes את התגרענות ואת פלמור של F-אקטין על ממברנות endosomal מוקדם במבחנות, ובכך הפך את סדרת תגובות מורכבת זו נוטה הביוכימי ותעשיה מניפולציות.

במבחנה פלמור של F-אקטין-Endosomes מוקדם

נתאר כמה מיקרו - photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

אנו מדווחים על בדיקה פשוטה, יעילה בזמן וספקטרוסקופיה מבוססת תפוקה גבוהה לכימות סיבי אקטין בדגימות ביולוגיות אקס ויוו מרקמות המוח של מכרסמים ונבדקים אנושיים.

בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

פרוטוקול זה נועד למדוד את הפרמטרים הדינמיים (בליטות, נסיגה, קפלים) של בליטות בקצה של תאים מתפשטים.

מדידת דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים

אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

חקור דינמיקת ציטוסקלטון האקטין בתאי אנדותל חיים באמצעות GFP-אקטין. שיטת הדמיה בזמן אמת זו מאפשרת ניתוח שינויים בתגובה לגירויים שונים ומספקת הבנה מעמיקה של מנגנוני חדירות אנדותלית.

עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת GFP-אקטין

גלה סרטונים נוספים