Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps ב, עכברים מודעת בלתי מרוסנת

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להעריך את פעולת האינסולין בגוף כולו וברקמות ספציפיות בעכברים בהכרה שאינם תחת סטרס, ללא צורך בטיפול ידני. זאת מושג על ידי השתלה כירורגית של קטטר לווריד הג'גולרי (jugular vein) לצורך עירוי, וקטטר נוסף לעורק הקרוטיד (carotid artery) לצורך דגימות דם. לאחר תקופת התאוששות של חמישה עד שבעה ימים, עכברים שצמו במשך חמש שעות מקבלים עירוי אינסולין כדי להגיע למצב של היפרי-אינסולינמיה פיזיולוגית.

לאחר מכן נמדדים רמות הגלוקוז מהקטטר העורקי, ורמת גלוקוז בדם (U glycemia) נשמרת על ידי התאמת קצב עירוי הגלוקוז. ניסוי זה מאפשר למדוד הבדלים ברגישות לאינסולין של כל הגוף, בהתבסס על הקשר הישיר בין קצב עירוי הגלוקוז הדרוש לשמירה על U glycemia לבין פעולת האינסולין. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות לדגימת דם, כגון חיתוך הזנב, הוא שהקטטר העורקי המושתל בניתוח מספק גישה וסקולרית לעכבר, כך שניתן להוציא דגימות דם ללא צורך בטיפול פיזי בעכבר.

כך אנו יכולים לבצע את הניסויים הללו בעכברים שאינם נתוני סטרס ואינם מוגבלים בתנועתם. הקטטר העורקי מיוצר על ידי השחלה של קטע משופע של צינור PE 10 לתוך קטע של 6 cm של צינור astic, כך שה-PE 10 בולט ב-0.9 cm מה-sel. הקטטר הורידי הוא קטע של 6 cm של צינור SEL עם צווארון.

את המסה בונים על ידי הכנסת חתיכות של 3 cm של PE 20 לתוך כל אחד משני מחברים מפלדת אל-חלד בכיול 25 עם קוטר של 1.3 cm, בנקודות חיבור בעלות זווית של כ-120 מעלות. אלו מוכנסים לתוך טיפה של דבק סיליקון רפואי כפי שמוצג כאן. כדי להתחיל בהשתלת הקתטר, הניחו עכבר המורדם על משטח עבודה נקי תוך שימוש בטכניקה סטרילית. בצעו חתך במרחק של 5 mm מימין לקו האמצע.

בודד את הוריד הג'וגולרי הימני. קשור בזהירות את הקצה הצפלי באמצעות תפר משי, וקשור באופן רפוי קטע תפר נוסף בקצה הזנבי. לאחר מכן, גזור ממש מתחת לקשירה הצפלית בעזרת מספרי קפיץ והחדר את הקטטר עד לחרוז המעכב.

קשרו תפר מאחורי החרוז ואשרו שהקטטר דוגם על ידי חיבורו של הקצה החופשי של הקטטר למזרק דגימה. להחדרת הקטטר העורקי, בצעו חתך קטן, חמישה מילימטרים משמאל לעצם החזה ובמיקום צפלי (cephalic) ביחס לחתך הראשון. בודדו את העורק התרדי השמאלי, ולאחר מכן קשרו את החלק הצפלי.

סיימו בתפירת משי וקשרו קשר רפוי. הצמידו קטע תפירה נוסף לקצה הפרוקסימלי של הכלי החשוף. לאחר מכן, סגרו בעזרת תפסן את הקצה הדיסטלי של הכלי.

חתוך ממש מתחת לקצה הקשור בעזרת מספרי קפיץ. הכנס בזהירות את הקטטר עד לתסביץ. שחרר בזהירות את התסביץ והעבר את הקטטר אל צומת Astic P.

קשרו את הליגטורות היטב לקטטר וודאו כי הקטטר מדגמיס על ידי חיבור הקצה החופשי של הקטטר למזרק דגימה. לאחר מכן, הפכו את בעל החיים ובצעו חתך קטן בין השכמות; העבירו מחט במידה 14 מתחת לעור, מהחתכים הקדמיים אל חתך זה בגב. השחילו את הקטטרים דרך המחט כדי להוציאם אל מחוץ לגוף בגבו של העכבר.

חבר את הקטטרים העורקיים והורידיים למחברים המתאימים באנטנה של העכבר לצורך גישה לדגימה או להחדרה של ה-masa. לאחר מכן, הכנס את ה-masa לתוך החתך שבין השכמות. סגור את שני החתכים באמצעות תפר ניילון.

יש לאשר את פתיחותם של שני הקטטרים. מקמו את העכבר בכלוב חם ונקי לצורך התאוששות, והמתינו לפחות חמישה ימים לפני ביצוע ה-insulin clamp. השלב המאתגר ביותר בביצוע hyperinsulinemic euglycemic clamp בעכברים הוא הניסיון לשמור על euglycemia.

לעכברים יש מטבוליזם מהיר מאוד ורמות הגלוקוז שלהם עשויות להשתנות באופן משמעותי במהלך הניסוי. הדבר דורש תרגול כדי לפתח תחושה לגבי האופן שבו רמות הגלוקוז של העכבר ישתנו לאורך הניסוי, ולאחר מכן כיצד להתאים את קצב עירוי הגלוקוז כדי לשמור על glycemia יציבה. מערך ה-clamp הסטנדרטי מוצג כאן.

שלוש מערכות infuse eight, גלוקוז, אינסולין ואריתרוציטים שטופים מחוברים למחבר ארבע-דרכי המחובר למסובב (swivel) ותלויים מעל העכבר. פתח ההזרקה של המסובב מחובר לקטטר הוורידי. לפני חיבור העכבר, יש למלא את כל קווי ה-infuse eight בתמיסת סליין.

בשלב הבא, מלאו את קו הדגימה בתמיסת סליין עם הפרין. השאירו מזרק עם סליין עם הפרין מחובר לחלקו העליון של המציר (swivel) לצורך ניקוי המזרק. השאירו את העכברים בצום חמש עד שש שעות לפני תחילת הclamp.

שלוש שעות לאחר תחילת הצום, שקלו את העכבר וחברו את הקטטרים הוורידיים והעורקיים לקווי העירוי ודגימות הדם בהתאמה. 15 דקות לפני תחילת התקיעה (clamp), הכניסו טיפה של גלוקוז ריקה למד-סוכר ידני. לאחר מכן, שאבו כ-50 µL של דם למזרק הניקוי כדי להסיר תמיסת סלין מהקו, וניתקו את מזרק הניקוי.

מדוד את רמת הגלוקוז בדם על ידי הגעת רצועת הגלוקוז לטיפת הדם שנוצרת בקצה הצינורית. לאחר מכן, הכנס מזרק עם מחט קהה לקו הדגימה ושבוב 50 µL של דם. העבר את הדם למבחנה מצופה EDTA וסבב את המבחנה בצנטריפוגה כדי לאסוף את הפלסמה למדידות של הורמונים בזאל ומטבוליטים.

בשלב זה, הכניסו מחדש את מזרק הניקוי ומשכו את הבוכנה למעלה. כדי להסיר בועות אוויר, החזירו את 50 µL של הדם שנשאבו בתחילה. רשמו את ערך גלוקוז הדם מהמד גלוקומטר.

לאחר 10 דקות, השתמש במד הסוכר ובמזרק ניקוי כדי לחזור על מדידת הגלוקוז בדם, ולאחר מכן שאב 50 µL נוספים של דם כדי להשיג דגימת פלזמה נוספת. לאחר ביצוע המדידות הבסיסיות השניות, מלא את קווי העירוי עבור גלוקוז, אינסולין ואריתרוציטים שטופים בסליין עד למחבר ארבעי הכיוונים. חבר את המחבר ארבעי הכיוונים לצינור המחובר לפתח העירוי המסתובב.

התחילו בעירוי של תאי כדוריות דם אדומות שטופים בתמיסת סלין. הגדירו את קצב העירוי כך שיחליף את נפח הדם הכולל שנדגם לאורך משך המחקר. ברגע שעירוי כדוריות הדם האדומות מגיע לעכבר, התחילו בעירויי האינסולין והגלוקוז.

זהו זמן שווה ל-0 דקות. אינסולין מוזרק בקצב קבוע שנקבע מראש. קצב ההזרקה הראשוני של גלוקוז נאמד על בסיס רמות הגלוקוז הבסיסיות בדם וניסיון קודם.

במהלך השעתיים הבאות, בצעו מדידות של גלוקוז בדם באמצעות הגלוקומטר והתאימו את קצב עירוי הגלוקוז כדי לשמור על רמת גליקמיה יעד. במרווחי זמן של 10 דקות, רשמו את מדידות הגלוקוז החדשות ואת קצבי עירוי הגלוקוז. בדקות ה-100 וה-120, אספו דם נוסף למדידת אינסולין בפלסמה ושל הורמונים או מטבוליטים אחרים. מוצג כאן מהלך הזמן של רמות הגלוקוז לאורך פרוצדורת ה-clamp, המדגים עד כמה נשמרה הגליקמיה הן בעכברים שהוזנו בתזונה רגילה (chow fed) והן בעכברים שהוזנו בתזונה עשירה בשומן לאורך ה-clamp. מהלך הזמן של קצב עירוי הגלוקוז מראה כי הקצב הדרוש לשמירה על הגליקמיה נמוך משמעותית בקבוצה שהוזנה בתזונה עשירה בשומן, מה שמעיד על פגיעה בפעולת האינסולין בגוף כולו.

גם רמות האינסולין בצום ובמהלך clamp גבוהות יותר בקבוצה שהוזנה בתזונה עשירה בשומן, מה שמחזק את הנוכחות של פנוטיפ העמיד לאינסולין. בעכברים אלו, גלוקוז טריטיומי משמש להערכת קצב הופעת הגלוקוז האנדוגנית. Endo a מהווה מדד לייצור גלוקוז כבדי, בעוד שאינסולין מדכא לחלוטין את endo A בעכברי ביקורת.

הדיכוי פגום בעכברים שהוזנו בתזונה עשירה בשומן. באופן דומה, גלוקוז TRID משמש להערכת קצב היעלמות הגלוקוז מהגוף כולו. Rd היכולת של אינסולין לעורר RD פגועה בעכברים שהוזנו בתזונה עשירה בשומן.

2-deoxy-glucose המכיל פחמן 14 משמש להערכת מדד מטבולי של גלוקוז RG, המהווה מדד לספיגת גלוקוז ספציפית לרקמה. כפי שניתן לראות בדוגמה זו, ספיגת גלוקוז לשריר השלד המעוררת על ידי אינסולין פגומה בעכברים שהוזנו בתזונה עשירה בשומן. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשרו עם המיקרו-כירורגיה הנדרשת להשתלת הקטטרים העורקיים והורידיים.

הניתוח דורש מיומנויות מקצועיות מאוד ודורש תרגול מתמיד לאורך מספר חודשים כדי להגיע למיומנות גבוהה בניתוח עבור clamp להיפראינסולינמיה והגלוקוז; הקושי הוא שוב הניסיון לשמר רמות גלוקוז בדם (euglycemia) במודל בעלי חיים בעל מטבוליזם גבוה מאוד.