Name: בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: למדו לבודד תאי טרופובלסט ראשוניים משליה עכברית ולבצע מבחן פלישה ב-Matrigel. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לחקר התפתחות השליה והתנהגות תאים פולשניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לצוות השירותים יצירתיים באוניברסיטת מרכז תמיכה האקדמית מיזורי שהפיק בסרטון זה. עבודה זו נתמכה על ידי יוניס קנדי ​​שרייבר המכון הלאומי לבריאות והתפתחות ילד האנושית של המכונים הלאומיים לבריאות, מספר מענק HD055231

1. נתיחה של עכבר השליה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת זוגות הזדווגות של עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל אחד מהימים הבאים, לבדוק את קיומו של תקע הזדווגות. היום שבו תקע מזוהה נחשב 0.5 ימים לאחר זק (DPC) 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שליות ניתן לגבות בשלב הרצוי של הריון, עם נתיחה נקיה של התחילה האפשרית השליה עם ההתפתחות של השליה הבוגרת בד 10.5. הנה, אנחנו מדגימים 14.5 DPC. בכרכים שניתנו, 40-60 שליות על 10.5 DPC, ו10-20 שליות על 14.5 DPC תנבנה שכבת תא trophoblast נראית בבירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר בהריון, ולהוציא את הרחם, חיתוך בצוואר הרחם, ולאורך mesometrium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים חדים, לחתוך בין כל conceptus (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשני זוגות של מלקחיים, לתפוס את דופן הרחם בקצה החתך, ומושך לגזרים, הסרת myometrium (האיור 1B) . זוג אחד משונן, מלקחיים עדינים מתון (מעוגל או ישר) וזוג אחד מלקחיים עדינים מאוד (# 5, לדוגמה) מומלצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפך השליה, פתח decidua עם מלקחיים או מספריים, חושף שליה. אחיזת רקמת רחם עם זוג אחד מלקחיים, עוד שקופית מלקחיים מתחת לשליה להפריד (התרשים 1C). אם עובר צורך נפרד וקרומים עובריים משלייה. לא ניתן להסיר את כל רקמת decidual ידי נתיחה מבלי שאבד אף רקמת שליה, אבל רקמת decidual נוספת (חיוור) ניתן להסיר מפני השטח של השליה על ידי קילוף בעדינות עם מלקחיים. אנו נסתמך על שיפוע Percoll לטיהור נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם כל שליה גזורה בחיץ 25 מיליליטר קרח קר דיסוציאציה בצינור חרוטים 50 מ"ל עד שכל הניתוחים הושלמו. בשלבים מאוחר יותר, גס לרכך רקמת שליה עם מספריים או סכין גילוח ולפני ההעברה לחיץ דיסוציאציה. </li></ol>"&gt; 2. בידוד TLE של תאי trophoblast <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רופף צינור כובע חרוטים ומקום באמבטית 37 ° C עבור 45-60 דקות. מערבב את פתרון דיסוציאציה נמרצות על ידי pipetting בערך כל 10 דקות. זמן העיכול הכולל צריך להיות תחת פיקוח הדוק וכפי הנראה ידרוש קצת ניסוי וטעייה על מנת להשיג התאוששות תא אופטימלית. רקמות אמורות להיות מסוגלות לעבור דרך pipet מ"ל 10, אך חלקים גלויים של רקמה יישארו. Overdigestion יגרום הישרדות תא מסכנת ויעילות ציפוי. הישרדות תא אופטימלית ויעילות ציפוי תתרחשנה כאשר גושים של כמה תאים הם הווה, ולא כאשר הניתוק מוחלט מושג. לעומת זאת, underdigestion יוביל לטוהר מופחת בעקבות פרידת percoll. כאשר נקודת העיכול התקינה כבר הגיעה, צינור מקום בקרח כדי להפסיק את פעילות collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הפתרון דרך מסננת תא כדי להסיר חומרים לא מעוכלים, וחובצה @ 500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף, להסירתאי supernatant ו resuspend בפתרון 10 מ"ל לשטוף. צנטריפוגה @ 500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה, להכין תמיסת percoll ידי ערבוב 9.6 המ"ל percoll, פתרון 13.4 מ"ל לשטוף ובינוני 1.1 מ"ל 10x 199 בצינור מ"ל 50 מתאים לצנטריפוגה במהירות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאי supernatant ו resuspend גלולה בפתרון 2 מ"ל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לתאי percoll פתרון וסרכזת @ 30000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מצינור צנטריפוגה ללא מפריע את השיפוע. כדי להמחיש את השיפוע, צינור המקום מול מקור אור בהיר. אתר להקת trophoblast (איור 2), ולשאוב עם pipet, נזהר שלא להפריע ללהקת תאי הדם האדומה בהמשך. נפח של להקת trophoblast יהיה 5-8 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאי trophoblast לצינור 50 מיליליטר חרוטים. הוסף לשטוף פתרון להיקף כולל של 45ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה @ 500 XG במשך 5 דקות. הסרת supernatant, resuspend ובתרבות Mediאממ (NCTC-135). תאים יכולים להיות מתורבתים בmatrigel שכבה דקה או פלסטיק תרביות רקמה על 37 המעלות צלזיוס ו 5% CO 2. ביום 10.5, כל שליה מניבה כ 50,000 תאים חיים, מתוכם 80-90% הם cytokeratin חיוביים. </li></ol> 3. Assay הפלישה Trophoblast <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיום תרבות מ"ל 1-2 (NCTC-135) לכל תא ולדגור matrigel על 37 מעלות, CO 2% 5 עבור 30-90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני, ומוסיף 1.5 מ"ל x 10 5 תאים מבודדים טרי במדיום 2ml לבית העליון. הוסף 1 מ"ל בינוני לחדר תחתון כדי לכסות את פני שטח קרום תחתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות במוסיפה ל18-24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לגרד וmatrigel מלהוסיף באמצעות קיסם קצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החלק העליון והתחתון של החדר ב2 המ"ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן למשך 5 דקות במ"ל paraformaldehyde 1 4% ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם על ידי מילוי החלל נמוך עם 400 DAPI μl (300nM) ו דגירה למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים לזמן קצר בערוץ המדע. </li><li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפת μl 10 של מדיום הרכבה (גליצרול 50% ב PBS) להחליק. באמצעות מלקחיים, שכב על קרום טיפה. הוסף עוד טיפת μl 10 של מדיום, אז coverslip בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לצלם ולספור. הקפד למקם את הקרום כראוי (עד תא בצד תא או בצד למטה) למיקרוסקופ בשימוש. תמונת J תוכנה (המכונים הלאומיים לבריאות) כוללת תכונת ספירה ידנית שניתן להשתמש בו למטרה זו, כפי שניתן Adobe Photoshop או דלפק ידני. </li></ol> 4. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1. Dissection של שלית העכבר. () הרחם הוסר על ידי חיתוך לאורך oviducts (צהוב), על פני שטח mesometrial, ובצוואר הרחם (למטה). conceptuses בודד אז יכול להיות מופרד על ידי חיתוך במספריים כפי שמוצג. (ב) הרחם הקיר הוסר על ידי צבת שני מלקחיים במשטח רחם החתך, וקרע בצד אנטי mesometrial, סמוך לעובר ומן השליה. (ג) השליה אז בודד על ידי אחיזה עם מלקחיים והחלקה נוספת בין השלייה ורקמות רחם. חבל טבור וקרומי extraembryonic אחרים אז ניתן להפריד את השליה. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. הפרדת Percoll של תאי trophoblast. לאחר צנטריפוגה, שלוש להקות עיקריות תהיינה גלויות כפי שמוצג בסרט מצויר בצד שמאל, ותמונה בצד ימין. הרצועה העליונה מכילה פסולת וfibroblasts סלולרי ויהיה ברור ביותר. רצועה הדוקה (אדום) הקרוב לתחתית המכילה תאי דם אדומים תהיה גלויה ממש מתחת ללהקת trophoblast המפוזרת. אגרגטים סלולריים יהיו סביר ראו בלהקת trophoblast, כמו בשניים שמוצגים רק בצד השמאל של החץ בתמונה. ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. תאי trophoblast פולשים (חץ לבן) יעבור דרך שכבת matrigel ואת הנקבוביות בממברנה, המופיע על פני השטח התחתונים של הקרום. הנקבובי הם גם גלויים (ראש החץ שחור). מספר התאים על פני הקרום או כל אזור מדגם מייצג ניתן לספור. תמונה בגוונים האפורים של צביעה גרעינית ניאון DAPI כבר מתהפך לשיפור הדמיה של תאים. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> תאי Trophoblast איור 4. ניתן לזהות, והטוהר של האוכלוסייה המבודדת העריך, על ידי immunostaining ל7 cytokeratin (מרכז, מגנט). תאי counterstained עם DAPI (למעלה, כחול). תמונה, תחתון ממוזגת.

<ol><li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li>
<li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li>
<li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+characterization%2C+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li>
<li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta%3A+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li>
<li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li>
<li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

אין לנו מה למסור.

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הבידוד של תאים משלית trophoblast העכבר. אז אנחנו מראים assay חוץ גופייה בפלישה לtrophoblast. שימוש בהליך זה, במידה רבה, אבל לא לגמרי, אוכלוסייה טהורה של תאי trophoblast ניתן להשיג. אם טוהר נוסף נדרש, הפרדה מגנטית חרוז או הזרימה cytometry יכול להתבצע, כפי שכבר תאר לתאי trophoblast אנושיים ראשוניים. האורך הנכון של צעד דיסוציאציה collagenase צריך להיקבע בכל ניסוי, ויילמד עם ניסיון. יתר עיכול יהיה קשה להפחית התאוששות תא, בעוד שלפי-עיכול עלול להוביל לטוהר מ...

בידוד של תאים ראשוניים עכבר trophoblast וassay הפלישה trophoblast

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

השליה אחראית להובלה של חומרים מזינים, גזים וגורמי גדילה לעובר, כמו גם החיסול של פסולת. לכן, פגמים בהתפתחות שליה יש לו השלכות רבות על העובר ואמו, והם גורם עיקרי של הקטלניות עובריות. סוג התא העיקרי של החלק העוברי של השליה הוא trophoblast. תאי trophoblast שליה ראשוניים עכבר הם כלי שימושי לחקר התפתחות שליה רגילה ונורמלית, ולא כמו שורות תאים, עשוי להיות מבודדים ומשמשים ללמוד trophoblast בשלבים מסוימים של הריון. בנוסף, תרבויות העיקריות של trophoblast מעכברים מהונדסים עלולות לשמש כדי לחקור את תפקידם של גנים מסוימים בתאי שליה. הפרוטוקול המובא כאן מבוסס על התיאור של Thordarson et al. 1, שבו שיפוע percoll משמש להשגת אוכלוסיית תא trophoblast טהורה יחסית משליות עכבר בודדות. זה דומה לשימוש נרחב יותרשיטות ברה 2-3 בידוד תא trophoblast אנושיים. טוהר יכול להיות מוערך על ידי צביעת immunocytochemical של התאים המבודדים ל7 4 cytokeratin. הנה, התאים הבודדים לאחר מכן, נותחו באמצעות assay פלישה matrigel להעריך הפולשנות trophoblast במבחנת 5-6. התאים פלשו מנותחים immunocytochemistry ומוכתם לספירה.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הנתיחה של placentae מהעכבר על ההריון d10.5, ואחרי הבידוד של תאי trophoblast באמצעות שיפוע Percoll. אז אנחנו מדגימים שימוש בתאים המבודדים בassay פלישת matrigel.

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

השלייה אחראית על הובלת חומרים מזינים, גזים וגורמי גדילה אל העובר, וכן על פינוי פסולת.
לפיכך, פגמים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד תאי טרופובלסט ראשוניים משלייה של עכברים לצורך תרבית תאים. כמו כן, נדגים שימוש אחד בתאים אלו, מבחן פלישה במטרי-ג'ל (matrigel invasion assay). הרחם יוצא מהעכברה ההרה והשלייה תבוצע בדיסקציה.רקמת השלייה תעבור עיכול אנזימטי כדי להשיג תאים בודדים או מקבצים קטנים של תאים, והתאים יופרדו באמצעות פרוטוקול של מדרג צפיפות. הפס המכיל תאי טרופובלסט יישאב, ואת אוכלוסיית התאים שהתקבלה ניתן יהיה לאחר מכן לשטוף ולהביא לזריעה. בשלב הבא נדגים את בדיקת הפלישה (invasion assay), שבה התאים נזרעים על שכבת matrigel המכסה ממברנה דקה.תאים פולשים יעכלו את שכבת המטריג'ל ויעברו דרך נקבוביות של 8 מיקרומטר בממברנה. לאחר מכן, התאים מקובעים במקומם והממברנה מוסרת. את התאים שפשטו ניתן לאחר מכן לצבוע ולספור.שלום, אני קתלין פנינגטון ממעבדת שולץ במחלקה למיילנות, גינקולוגיה ובריאות האישה באוניברסיטת מיזורי בקולומביה, מיזורי. היום נדגים לכם את הפרוצדורה שבה אנו משתמשים כדי לבודד תאי טרופובלסט ראשוניים מעכברים הרות. לאחר מכן, נדגים את בדיקת הפלישה שבה אנו משתמשים לבחינת התאים.אנו משתמשים בנהלים אלה כדי לחקור גורמים המשפיעים על התפתחותם של תאי טרופובלסט של השיליה ועל יכולתם לפלוש למטריצה חוץ-תאית. בואו נתחיל. ראשית, הגדירו זוגות עכברים להרבייה בכל אחד מהימים הבאים.בדקו אם קיים פקק הזדווגות. היום שבו זוהה הפקק נחשב ליום 0.5.ניתן לאסוף שליה לאחר הפסקת הריון בשלב הרצוי של ההריון. כאן נדגים דיסקציה של שליה ביום 14.5 על גבי משטח העבודה. עם זאת, בשלבים מוקדמים יותר עשוי להידרש מיקרוסקופ כדי לדייק בראיית הרקמות; במקרה זה, אתר את הרחם, ולאחר מכן גזור בחיבור שבין הרחם לצינור הביצית.המשך להסיר רקמות שומן וכלי דם על ידי חיתוך בצוואר הרחם ובצומת החלודה השנייה. כדי להוציא את הרחם, העבר את הרחם לצנחת פטרי נקייה באמצעות מספריים חדים. הפרד כל עובר. לאחר ההפרדה, העבר כל עובר לצנחת נקייה.העובר שוכן לכיוון הצד האנטי-מיומטריאלי מהשלייה. השלייה שוכנת לאורך הצד המזוגי (meso side) של הרחם. השתמש בזוג פינצטות כדי לתפוס את הרחם בקרבת פני השטח החתוךים.משכו בזהירות את שני זוגות הפינצטות הרחק זה מזה, תוך קריעת דופן הרחם לאורך הצד האנטי-מיומטריאלי. פעולה זו תגרום בדרך כלל גם לקרע של הקרומים. כתוצאה מכך, העובר יישאר גלוי בבירור בחלק העליון, כאשר השילייה האדומה נמצאת מתחתיו ורקמת הרחם הלבנה מתחתיה.מתחת לכך, השתמשו בפינצטה עדינה כדי להפריד את חבל הטבעת העוברית ואת רקמת השליה (amniotic tissue) מהשלייה. החזיקו את רקמת הרחם עם זוג פינצטות אחד והעבירו את הזוג השני בין השלייה לרקמת הרחם שמתחתיה. בשלב זה, ניתן להסיר רקמת דסידואה (decidua) עודפת מהשלייה.עם זאת, סביר להניח שחלק מתאי הדסידואה יישארו. העבירו כל שליה שבוצעה לה דיסקציה למסלק פירוק קר במקרר עד לסיום כל תהליכי הדיסקציה. עם סיום הדיסקציות, סגרו בצורה רפויה את הפקק של המבחנה הקונוית המכילה את השליה ואת תמיסת הפירוק, והניחו אותה במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 45 עד 60 דקות.לאחר 10 דקות, ערבבו את תמיסת הדיסוציאציה על ידי פיפוט נמרץ מעלה ומטה ועקבו בקפידה אחר התקדמות העיכול. יש לקבוע את משך הזמן המתאים לשלב הדיסוציאציה באמצעות קולגנאז בכל ניסוי, וזאת על בסיס ניסיון. עיכול יתר יפחית משמעותית את התאוששות התאים, בעוד שעיכול חסר עלול להוביל לירידה בדרגת הטוהר וכן למספר תאים מופחת.יש להפסיק את התגובה כאשר נותרים מעט חלקי רקמה שלא עברו עיכול. סננו את התמיסה דרך מסנן תאים כדי להסיר חומרים שלא עובדו, וסבבו בצנטריפוגה ב-500 ×g למשך חמש דקות כדי לשקע את תאי השליה. לאחר מכן, שטפו את התאים.כדי להסיר את תמיסת הדיסוציאציה, יש לשאוב את הנוזל ולשעבד מחדש את התאים ב-10 mls של תמיסת שטיפה, ולאחר מכן לסבב בצנטריפוגה ב-500 times G למשך חמש דקות. במקביל, הכין תמיסת per call על ידי ערבוב של 9.6 mls per call ו-13.4 MLS של תמיסת שטיפה במבחנה המתאימה לסבב בצנטריפוגה במהירות גבוהה.הוסף 1.1 mL של מצע 10x, 1 99 כדי להכין את תמיסת התאים, האיזוטונית. הפוך את המבחנה כדי לערבב. לאחר הצנטריפוגציה ותמיסת השטיפה, הסר את העלייה (supernatant) ונתח שוב את משקע התאים. בשני mL של תמיסת שטיפה, הוסף את התאים לתמיסת הפרוטוקול וערבב כדי ליצור את הגרדיאנט. סבב בצנטריפוגה במהירות של 20,000 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C, והוצא את המבחנה מהצנטריפוגה מבלי להפר את הגרדיאנט.ניתן להמחיש את המדרג בצורה קלה יותר על ידי החזקת המבחנה מול מקור אור. פס לבן המכיל בעיקר שיירי תאים יהיה נראה ליד החלק העליון של המבחנה, ופס של תאי דם אדומים ייראה ככל הנראה ליד החלק התחתון של המבחנה. ממש מעל.זהו פס הטרופובלסט. שאבו את המצע עד לנקודה שמעל פס הטרופובלסט והשליכו אותו. לאחר מכן, העבירו באמצעות פיפט את פס הטרופובלסט למבחנה נקייה לצנטריפוגה המכילה 35 mls של תמיסת שטיפה, וסובבו בצנטריפוגה ב-500 times G למשך חמש דקות.כדי להשקיע את תאי הטרופובלסט, השהו שוב את המשקע במצע גידול של טרופובלסטים. כאן התאים יגודלו בתאי פלישה בתוך פלטה בעלת שישה בארות. תאי ה-matrigel נשטפו מראש בהתאם להוראות היצרן; העבירו בעזרת פיפט 0.5 עד 1 ml של מצע גידול לבאר שמתחת לכל תבנית (insert).לאחר מכן, הוסיפו 1.5 × 10⁵ תאים בכמות אחת של מצע לתא. דגרו בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2. הוציאו את תאי הפלישה מהאינקובטור לאחר 18 עד 24 שעות.הסר את מצע הגידול ושטוף את התאים שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בכל פעם, בעדינות אך ביסודיות. גרד את התאים ואת מרבית הג'ל מהמשטח העליון של המבנה (insert). בעזרת מקלון צמר, קבע את התאים שפלשו למשטח התחתון של הממברנה על ידי מילוי הבאר בתמיסת 4% paraformaldehyde ודגירה למשך חמש דקות.שטפו שלוש פעמים ב-PBS. צבעו את התאים שפלשו על ידי מילוי הבאר בצבע גרעיני כגון dappy. דגרו למשך 20 דקות.שוב, שטפו שלוש פעמים ב-PBS. הוסיפו טיפה של מדיום קיבוע (mounting medium) לזכוכית של למסטיקה באמצעות להב סקלפל, והסירו בזהירות את הממברנה מתא הפלישה (invasion chamber) בעזרת פינצטה. העבירו את הממברנה למסטיקה כאשר התאים פונים כלפי מעלה.הניחו את הממברנה על גבי הטיפה, תוך הקפדה להימנע מבועות אוויר. הוסיפו טיפה נוספת של תוך הרכבה (mounting medium), ולאחר מכן כסו בזכוכית כיסוי.בחן וצלם בזהירות את התאים הפולשים על פני השטח של הממברנה. באיור 1, תאי טרופובלסט פולשים יעברו דרך שכבת המטריג'ל ונקבי הממברנה ויופיעו על פני השטח התחתונים של הממברנה. ייתכן שגם הנקבים יהיו גלויים.ניתן לספור את מספר התאים שפלשו ולהשוות ביניהם בין קבוצות הטיפול באופן ידני או באמצעות תוכנה ממוחשבת. כפי שמוצג באיור שתיים, בנוסף לצביעות גרעין, ניתן להשתמש באימונו-ציטוכימיה כדי לאפיין את התאים שפלשו. במקרה זה השתמשנו בנוגדן ל-cytokeratin seven כדי לאשר שהתאים הם trophoblast.הדגמנו את בידודן של תאי טרופובלסט משיליית עכבר. לאחר מכן הצגנו בדיקה במבחנה (in vitro) לפלישת טרופובלסטים. באמצעות הליך זה, באופן נרחב אך לא מלא, ניתן להשיג אוכלוסייה טהורה של תאי טרופובלסט.אם נדרשת רמת טהרה גבוהה יותר, ניתן לבצע הפרדה באמצעות חרו지를 מגנטיים או ציטומטריית זרימה, כפי שתואר עבור תאי טרופובלסט אנושיים ראשוניים. למרות שהדגמנו שימוש בתאי פלישה של Matrigel המוכנים מסחרית, ניתן להכינם גם על ידי הוספת Matrigel לתאי Transwell ללא ציפוי בעובי הרצוי. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

isolation-primary-mouse-trophoblast-cells-trophoblast-invasion

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את בידודה של blastocysts העכבר ואת הגזירה של בתאי גזע trophoblast מ blastocysts. אנחנו גם לתאר את תנאי תחזוקה של הנכס בתאי גזע, כמו גם גיוס של בידול בתרבות.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה transfecting siRNA ב cytotrophoblasts villous אדם המבודד טרי באמצעות microporation וזיהוי מתחמים-חלבון ה- DNA בתאים אלה. תאי transfected יכולים להיות במעקב על ידי כתם מערבי Emsa מנתח בזמן תרבות 4 ימים.

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

כתב יד זה מציג מודל ייחודי במבחנה של תאי ציטוטרופובלסט אנושיים מטוהרים חיסונית שגודלו תחת היפוקסיה/חמצון מחדש. מודל זה מתאים לחקר ההשפעות המגנות של טיפולים מבטיחים, כגון מלטונין, על סיבוכי הריון הקשורים למתח חמצוני מוגבר ושינוי בתפקוד השליה.

ראשוניים האדם Trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש

כאן אנו מציגים פרוטוקול להמרה ישירה של פיברובלסטים עובריים של עכברים לתאי גזע טרופובלסטים מתפקדים ויציבים לחלוטין על ידי ביטוי יתר של Tfap2c, Gata3, Eomes ו-Ets2.

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

המוצג כאן הוא פרוטוקול עבור דגימה של רקמה אנושית היפרדות villous חלקית ואחריה בידוד של cytotrophoblasts לתרבות התא הראשי. טיפול trophoblasts עם TNFα recapitulates דלקת התוך-רחמית שמנים ומקל על גילוי מטרות מולקולריות מוסדר על ידי דלקת מאחד לשני עם השמנת יתר אימהית.

מודל ראשי Trophoblast האנושי כדי לחקור את ההשפעה של דלקת הקשורות בהשמנת יתר אימהית על ויסות Autophagy את השליה

פרוטוקול זה מדגים שיטת הבידוד של תאים אנושיים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae אשר יכול לשמש למגוון רחב של יישומים (קרי immunocytochemistry, cytometry זרימה, וכו ') מכוון ללמוד את התפקיד של אוכלוסיות תאים שונים בסיבוכים בהריון.

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול ונגישות גבוהה להערכת תנועת התא בתאים trophoblast האנושי באמצעות שלושת מבחני במבחנה: וזמינותו מאפס, וזמינותו הפלישה transwell ואת וזמינותו התפשטות תאים.

במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי

בשנת מבחנה הפלישה תא מתורבת משמש כדי למדוד את הפוטנציאל של גרורות סרטן על ידי כימות הפוטנציאל התאי עבור פלישה והגירה באמצעות התרבות תאים מוסיף חלבון מטריצה. התאים מאותגרים לעבור דרך מטריצת החלבונים וממברנה נקבובי, לכיוון מיקרוסטנט, ולאחר מכן כימות על ידי מיקרוסקופ אור.

השימוש של העכבר בתאי סרטן הגידול בתוך שיטת הפלישה מחוץ למבחנה כמדד של התנהגות התא אונגניים

כאן, אנו מתארים שיטה לחימום בלסטוציטים אנושיים זגוגיים, איסוף אותם דרך תקופת ההשתלה במבחנה, לעכל אותם לתאים בודדים ואיסוף תאי trophoblast מוקדם לחקירה נוספת.

אוסף תאים בודדים של תאי טרופוביסט בעוברים אנושיים שלב השתלה פרי

הפרוטוקול הנוכחי מאפשר התאוששות של מבנים דמויי צינור שנוצרו במבחן היווצרות צינור אנגיוגנזה קלאסי במבחנה שבו תאים, כגון תאי טרופובלסט, מתארגנים במבנים דמויי נימים על גבי שכבה של מטריצת קרום בסיס חוץ-תאית. המבנים המשוחזרים משמשים לבידוד RNA וחלבונים לניתוחים ביוכימיים שונים.

התאוששות תאי טרופובלסט מבדיקת היווצרות צינורות אנגיוגנזה לניתוח ביטוי סמן התמיינות

פרוטוקול זה מאפשר טיהור, אפיון ותרבות של טרופובלסטים ראשוניים מסוג HLA-G+ אקסטרווילוס (EVT) מהדצידואה בזליס ומהקרום הכוריוני של שליות המונחים האנושיים. תרביות EVT ראשוניות שומרות על חיוניות למשך 96 שעות, ומאפשרות קו-קלטור עם תאי חיסון אימהיים תואמים לדגימה וניתוח זרימה ציטומטרי ומולקולרי של האינטראקציות ביניהן.

טיהור של טרופובלסטים HLA-G+ אקסטרווילוס מרקמות שליה במונחים אנושיים לצורך פנוטיפינג וניתוח תפקודי

למדו לבודד תאי טרופובלסט ראשוניים משליה עכברית ולבצע מבחן פלישה ב-Matrigel. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לחקר התפתחות השליה והתנהגות תאים פולשניים.

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

גלה סרטונים נוספים