הזרקה תת-רשתית של וקטורים נגיפיים לאפיתל פיגמנט הרשתית במודל עכבר

התחל עם עכבר מורדם והחל חומר מרחיב אישונים.

במיקרוסקופ יש לפתוח את העפעף ולהבליט מעט את העין כדי לחשוף את מקום ההזרקה.

מרחו טיפה של תמיסה ויסקו-אלסטית עיניים, ולאחר מכן הניחו כיסוי כדי לדמיין את הרשתית.

בעזרת מחט דקה, צרו חור מאחורי צומת הקרנית-סקלרה, והימנעו מנזק לכלי הדם ולעדשה.

דרך חור מנוקב מראש, הכנס מזרק קהה באופן משיק לחלל התת-רשתית ליד אפיתל הפיגמנט של הרשתית או RPE, התומך בנוירונים ברשתית.

הזרקו את הווקטור הלנטי-ויראלי הנושא את גני המטרה לחלל התת-רשתית.

התבונן בהיווצרות של בלב תת-רשתית עקב הצטברות נוזלים, המאשר העברת וקטור מוצלחת.

סגור בעדינות את העפעף כדי לכסות את מקום ההזרקה ולאפשר לעכבר להתאושש.

ה-lentivirus נכנס ל-RPE באמצעות אנדוציטוזיס, משחרר את החומר הגנטי שלו וממיר אותו ל-DNA המתאים, המשתלב עם הגנום המארח ומאפשר ביטוי גנים.

ראשית, הכינו מזרק מיקרוליטר עם מחט קהה בגודל 33. עקר אותו באמצעות גז תחמוצת אתילן. לאחר מכן, הכינו דילול של הווקטורים הוויראליים ב-PBS בצינור מיקרו-פוגה בכמיליון יחידות טיטר למיקרוליטר. כעת, בעת טעינת המזרק, יש לשטוף אותו מספר פעמים בתמיסה כדי להסיר שטח מת במזרק. קבל 1.5 עד 2 מיקרוליטר מוכנים להזרקה.

עם הזרקת הווקטור הנגיפית מוכנה, יש להרדים עכבר בוגר בהזרקה תוך-צפקית של טילטמין, זולאזפאם וקסילזין. ודא שהחיה הורדמה על ידי היעדר רפלקסים. לאחר אישור ההרדמה, יש להרחיב את האישונים עם ירידה של 0.5% פנילפרין ו-0.5% טרופיקמיד. כעת, תחת מיקרוסקופ ניתוח, פתחו את העפעף והבליטו את העין כדי לחשוף את קו המשווה. החזק את העין במצב זה על ידי הנחת האצבעות מחוץ לשפת המסלול.

לאחר מכן, מרחו תמיסה ויסקו-אלסטית עיניים על משטח הקרנית והניחו שקופית כיסוי עגולה קטנה מעל הקרנית. כך ניתן לראות את הרשתית. כעת, מעט אחורי ללימבוס, ונחות בעין ימין, או בעין שמאל, השתמש בחצי מחט סטרילית בקוטר 30 כדי ליצור חור קטן. חורים הממוקמים באופן זמני או ממוקמים באף אינם בחירה טובה מכיוון שקשה לכסות אותם.

בזמן הניקוב, אל תפגע בכלי הלימבלי או בעדשה, ואל תכניס את כל שיפוע המחט.

עבור ההזרקות התת-רשתית, הכנס את מחט ההזרקה הווקטורית דרך החור בזווית של 45 מעלות למישור הקשתית. דחוף את המחט לאחור לכיוון האזור ההיקפיאלי, בעקבות הנתיב המסומן כדי לחצות את חלל הזגוגית. התקרב למחט לחלל התת-רשתית עד שתורגש התנגדות קלה, מה שמעיד על כך ששכבת ה-RPE הושגה.

אין לחדור לרקמת הסקלר בלחץ מוגזם מכיוון שיש למקם את המחט בחלל התת-רשתית הפוטנציאלי. אם המחט מנקבת את רקמת הגולגולת בעוצמה מופרזת, היא נכנסת לחלל המסלול החוץ-עיני ללא התנגדות.

כעת, הזרקו בעדינות את הווקטור הנגיפי לחלל התת-רשתית. שמור על המחט דוממת מאוד כדי למנוע נזק לרקמות, וזה חשוב ביותר. לאחר מכן, משוך את המחט באותה עדינות. כעת, ניתן לשחרר את גלגל העין. בלבל תת-רשתית המעיד על הצטברות וקטור צריך להיות גלוי. לבסוף, סגור בעדינות את העפעף כדי לכסות את מקום ההזרקה. איטום עצמי של החור יתרחש.