פיתוח מודל חד צדדי, lesioned מאוס 6-OHDA של מחלת פרקינסון

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור מודל עכבר של מחלת הפרקינסון. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת התרופות לניתוח. השלב הבא הוא הגדרת המערך הניתוחי, ולאחר מכן מבוצע ניתוח ליצירת נגע חד-צדדי באמצעות 6-hydroxy dopamine, ואחריו טיפול פוסט-אופרטיבי נאות.

ניתן להשתמש בשש החיות שעברו נשק של hydroxy dopamine בניסויים התנהגותיים. בסופו של דבר, התוצאות מראות דלדול של דופמין הגבוה מ-95% בצורת צרורים מוחיים מדיאליים באופן חד-צדדי. שני ההיבטים החשובים ביותר בפרוצדורה זו שעל המבצעים להקפיד עליהם הם, ראשית, טיפול לאחר ניתוח הולם להבטחת הישרדותן של החיות.

שנית, הקפידו על הכנת הציוד להזרקה של six hydroxy dopamine כדי להבטיח שהגשת הנוירוטוקסין תהיה מלאה. כדי להתחיל בהליך זה, עקרו את הכלים הכירורגיים באוטוקלב. לאחר מכן, נקו את כל המשטחים והציוד באמצעות isopropyl alcohol.

לאחר מכן, הכינו את שלב לאחר הניתוח על ידי הגדרת כלוב התאוששות לעכברים עם מגבונים נייר בבסיסו. הניחו את הכלוב תחת מנורת חימום או על גבי משטח חימום כדי להקים את עגלת ההרדמה. ודאו שזרימת החמצן מחוברת ופתוחה, ושרזרוור ה-isoflurane מלא לחלוטין.

לאחר מכן, הגדירו את זרימת החמסן ל-1% ואת האיסו 플וריין ל-2% עד 4%. השלב הבא הוא הרכבת מכשיר העירוי. השליבו אום מתכת RN אחת על צד אחד של צינור ה-peak, ולאחר מכן את ה-peak cup feral. לאחר מכן, השליבו את ה-canonical PFA feral; כוון את ה-ferals כך שהקונוס ב-canonical PPFA feral יחליק אל תוך החלק התואם של ה-peak cup feral.

לאחר מכן, מקמו את כוס השיא (peak cup) שהוצמדה ואת ה-PFA feral הקנוני בכל אחד מקצות מחבר ה-RN בעל המרכז הכפול הקטן (dual small hub RN coupler), והדקו את אום המתכת של ה-RN בקצה השני של מחבר ה-RN בעל המרכז הכפול הקטן. הכניסו מחט הזרקה בכילייב 33. השהילו את המחט דרך אחד מאומות המתכת של ה-RN והדקו אותה.

ודאו שהמחט בכיל 33 נמצאת בזווית של 180 מעלות ביחס למחבר ה-RN בעל המרכז הכפול הקטן. לאחר מכן, בקצה השני של צינור ה-peak, הברגו את אחד מאזי ה-RN המתכתיים ואחריו טבעת קיבוע (ferrule) של כוס peak. לאחר מכן, הכניסו את טבעת הקיבוע של ה-PFA אל החריץ העמוק יותר של מחבר ה-RN השני בעל המרכז הכפול הקטן, והדקו את אז ה-RN המתכתי כדי להבטיח את החיבור.

בשלב הבא, הרכיבו בקצה השני של מחבר ה-RN הכפול הקטן השני את הפיצחון (lure) אל מתאם ה-RN של המרכז הקטן, והדקו את אום המתכת של ה-RN של הפיצחון כדי להבטיח את החיבור. כעת הושלב הרכבת מכשיר ההזרקה. שלב הכנה נוסף הוא ביצוע ה priming למכשיר ההזרקה.

ראשית, מלאו את מזרקי ההמילטון בנפח 250 µL ו-1 µL במים סטריליים. ודאו שאין בועות אוויר. לאחר מכן, חברו את המזרק בנפח 250 µL למתאם (lure adapter) ולחצו על בוכנת המזרק בנפח 250 µL כך שמים ישתחררו דרך מחט ההזרקה במידה של 33 gauge בקצה השני של הפיתול.

המשיכו לדחוף את המים דרך המערכת תוך כדי הוצאת מזרק ה-250 µL ממתאם הפיתיון. השאירו טיפת מים קטנה בקצה מתאם הפיתיון ולחצו על בוכנת מזרק ה-1 µL עד להזרקת טיפת מים קטנה. לאחר מכן, הכניסו בזהירות את מזרק ה-1 µL אל מתאם הפיתיון.

וודאו שטיפת המים על מזרק ה-one microliter מתחברת לטיפת המים שעל מתאם הפיתיון (lure adapter). לאחר מכן, הכניסו את מזרק ה-one microliter באופן מלא לתוך מתאם הפיתיון ווודאו שאין בועות באוורור ה-small dual RN hub coupler. כעת, חברו את מכשיר הפרפוזיה למסגרת הסטריאוטקסית, ובעזרת תסמיכי משאבת ההזרקה, קבעו את ה-small dual RN hub coupler עם מחט ההזרקה במידה 33 gauge לזרוע המניפולטור של המסגרת הסטריאוטקסית.

לאחר מכן, הדק את מזרק ה-1 µL למשאבת הפרפוזיה. לאחר מכן, תכנן את משאבת ההזרקה כך שתאפשר קצב הזרקה של 0.1 µL לדקה, 30 דקות לפני הפעולה. שקול את בעל החיים ורשום את משקלו.

הזריקו לעכבר, בהזרקה תוך-בטנית, תערובת של 2.5 milligrams per milliliter של dopamine hydrochloride ו-0.5 milligrams per milliliter של parline hydrochloride במינון של 10 milliliters per kilogram. לאחר מכן, הניחו דיסקי חימום חמים מתחת למוטות האוזניים ולמוט החותשי כדי לשמור על טמפרטורת החיה במהלך הניתוח, והשאירו את החיה בגובה אידיאלי להתאמה למוטות האוזניים והחותשי של המסגרת הסטריאוטקסיקה, 15 דקות לאחר ההזרקה של תערובת ה-dopamine hydrochloride וה-parline hydrochloride.

הנח את העכבר בתא סגור המיועד להשראת פרכוסים. הרדם את בעל החיים באמצעות שאיפת isof fluorine. בעל החיים נחשב מורדם מספיק כאשר הוא אינו מגיב ללחץ ברגל האחורית ואין לו רפלקס מצמוץ.

לאחר מכן, גלחו את חלקו העליון של ראש העכבר. בשלב זה, הניחו את העכבר בתוך המסגרת הסטריאוטקסית. מקמו את מוט החותכים בתוך פיו ואת מסכת ההרדמה על פניו.

לאחר מכן, כוון את קצב הזרימה של האיסופלורן. מרח את חומר האלחוש המקומי לידוקאין ישירות על העור באמצעות צמר גפן. כוון את מוט החיתוכים ואת כיסויי האוזניים כדי להביא את חלקו העליון של הגולגולת למצב מאוזן.

לאחר מכן, סטריליזו את העור באמצעות תמיסת Betadine. לאחר מכן, הכניסו את כוסיות האוזן. כוסיות האוזן מוכנסות נכון כאשר הראש שטוח לחלוטין ולא ניתן להזיזו לשני הכיוונים.

לאחר מכן, חתכו לאורך קו האמצע של הראש באמצעות להב סכין מנתחים והסיטו את העור. ייבשו את פני הגולגולת באמצעות פד גזה. לחצו על בוכנת המזרק של 1 µL והכניסו את מחט ההזרקה בכיול 33 לתוך מבחנה של 1 mL המכילה 15 mg/mL.

תמיסת six hydroxy dopamine מכוסה בנייר אלומיניום. משוך את הבוכנה לאחור באיטיות תוך השארת מחט ההזרקה בקוטר 33 gauge טבולה בתמיסת ה-six hydroxy dopamine. לאחר מכן, הנח את קצה מחט ההזרקה לעבר B bgma, והזרק כמות קטנה של תמיסת six hydroxy dopamine כדי ליצור טיפה קטנה.

לאחר מכן, הורידו באיטיות את קצה מחט ההזרקה. כאשר החרוז נוגע ב-bgma, הפסיקו את קידום המחט ורשמו קואורדינטות אלו. החזירו את מחט ההזרקה שני מילימטרים בכיוון הגבי והתקדמו לאורך התפר הסגיטלי בכיוון רוסטרלי לעבר Lambda.

כאשר המחט נמצאת מעל ל-Lambda, שחררו כמות קטנה של תמיסת six hydroxy dopamine מהמחט כדי ליצור טיפה קטנה. לאחר מכן, הורידו לאט את קצה המחט לעבר ה-lambda. כאשר הטיפה נוגעת ב-Lambda, הפסיקו להוריד את המחט ורשמו קואורדינטות אלו.

הקואורדינטות המדיאליות-לטרליות והדורסליות-ונטרליות צריכות להיות זהות עבור BMA ו-Lambda. אם הן אינן זהות, התאימו את מוט החותכים (incisor bar) בהתאם. עבור הקואורדינטות האנטריוריות-פוסטריוריות ומסביב למוטות האוזן עבור הקואורדינטות המדיאליות-לטרליות, הזריזו את המחט לקואורדינטות ההזרקה.

AP מינוס 1.2 מילימטרים ML מינוס 1.1 מילימטרים ביחס ל-bregma. הכניסו כמות קטנה של תמיסה ממחט ההזרקה כדי ליצור טיפה קטנה. הניחו את הטיפה הקטנה על הגולגולת כדי לסמן את המקום שבו יקדח החור. לאחר מכן משכו את המחט חזרה, וקדחו חור בגולגולת באמצעות מחט 25 gauge.

החזירו את מחט ההזרקה לקואורדינטות ההזרקה והחדירו את המחט חמישה מילימטרים במינוס לאורך הכיוון הדורסלי-ונטרלי. לאחר מכן, מזגו 0.2 µL של 6-hydroxy dopamine או של נשאי הביקורת (vehicle) באופן חד-צדדי לתוך ה-median forebrain bundle בקצב של 0.1 µL לדקה. עם השלמת מתן ה-6-hydroxy dopamine או נשאי הביקורת, השאירו את המחט במקומה למשך חמש דקות נוספות כדי לאפשר דיפוזיה מאתר ההזרקה.

לאחר מכן, משוך את המחט לאט, סגור את החתך בקרקפת באמצעות שלוש תפרים, ולאחר מכן מזריק 1 mL של תמיסת Lactated Ringer תת-עורית. לבסוף, הוצא את בעל החיים מהמסגרת הסטריאוטקסית והנחה אותו בכלוב התאוששות עד להחזרת ההכרה. 15 עד 21 ימים לאחר ניתוח הנגע ב-6-hydroxy dopamine.

כאשר כמות מות התאים שנגרמה על ידי הנוירוטוקסין הגיעה להשלמה, ניתן למדוד סיבובים ספונטניים של 360 מעלות כדי להעריך את הצלחת נגע ה-6-hydroxydopamine. בהערכה התנהגותית זו, עכברים עם דלדול דופמין המושרה על ידי 6-hydroxydopamine הגבוה מ-95% מראים באופן משמעותי יותר סיבובים IP סוב-ורסיביים מאשר עכברים עם נגע חלקי של 6-hydroxydopamine או עכברים שעברו ניתוח דמה (sham). על ידי קורלציה בין רמות ה-SAL dopamine לבין אחוז הסיבובים ה-IP סוב-ורסיביים הספונטניים בכל חיה, נמצא כי עכברים שהפגינו 70% או יותר של סיבובים IP סוב-ורסיביים עם נגע 6-hydroxydopamine איבדו יותר מ-95% מה-Sal dopamine.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה על אופן הביצוע היעיל של נגע (lesion) של 6-hydroxy dopamine בעכברים, בשיטה סטריאוטקסיס ובשליטה על קצב ההזרקה (perfusion). פעולה זו תוביל לרמה של מעל 95% של דלטור דופמין. כמו כן, עליכם להבין כיצד לבצע הערכה התנהגותית של מחלת הפרקינסון בעכברים.