Name: היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: למדו כיצד לחקור את השפעת מתח הזרימה על הידבקות חיידקית לתאי מארח באמצעות תאי אנדותל וחיידקים פלואורסצנטיים בניסויי זרימה מבוקרת. שיטה זו מאפשרת ניתוח מיקרוסקופי של דינמיקת הידבקות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות אמילי Mairey ועמנואל Donnadieu לקביעת הראשונית מעלה של ההליך.

1. התא המארח האדם תרבית החיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות HUVECs מעבר בין 1 ו - 9 ב 37 מעלות בתוך חממה humidified עם 5% (v / v) CO 2. מעבר התאים כאשר הם גישה מפגש 80% עם טריפסין / EDTA לספק תרבויות תחזוקה על 75 ס"מ 2 צלוחיות תרבות ותרבויות ניסיוני בתאי זרימה חד פעמיות (μ-שקופיות VI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משיכה בינוני מן צלוחיות להיות passaged, לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS, לשלוף ולהחליף אותו עם 1.5 מ"ל של טריפסין / EDTA. אפשר לנתק את התאים בתרבית תאים החממה למשך 5 דקות בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים עם 10 מ"ל של מדיום תרבית תאים לתוך צינור איסוף 15 מ"ל. גלולה התאים עם צנטריפוגה 5 דקות (ב g 200), בטמפרטורת החדר. להשעות את התאים מ"ל 4 של אנדו-SFM בתוספת 10% (v / v) FBS לספור אותם על חדר Malassez, על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו 30 μl של 6 תאים 1x10 HUVEC לכל ההשעיה מ"ל לתוך התעלה (3x10 4 סה"כ) ולאפשר לתאים לדבוק במשך 3 שעות ב 37 מעלות ב חממה humidified עם אווירה של 5% (v / v) CO 2. הוספת נפח נוסף של 120 μl של אנדו-SFM למלא את הבארות. תאים צריכים להקים monolayer subconfluent (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול נ meningitidis להביע GFP (במקרה הזה 8013 זן GFP להביע בשליטת היזם IPTG-ועין מתנהלת), על צלחות אגר GCB המכיל תוספים קלוג'ס 5 מיקרוגרם / מ"ל של chloramphenicol ב 37 ° C באווירה לחות המכיל 5% (v / v) CO 2 למשך 16 שעות. </li></ol> 2. הידבקות ראשונית של חיידקים בודדים לארח תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הריכוז של חיידקים גדל על צלחות אגר GCB כדי OD600 של 0.05 עם טרום חימם Endo-SFM המכיל 10% (v / v) FBS ו דגירה של 120 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה לחות המכיל 5% (v / v) CO 2, תחת רועד עדין (130 סל"ד). להשרות ביטוי של GFP על ידי הוספת 1 IPTG mM לתוך המדיום תרבות לתקופת הדגירה כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפנויה μ-Slide על הבמה של מיקרוסקופ הפוך מצויד פלטפורמה מחומם כדי לשמור על הטמפרטורה מדגם ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים מראש חימם Endo-SFM בתוספת 2% (v / v) FBS לתוך כוס זכוכית סטרילית למלא מזרק 50 מ"ל סטרילי עם המדיום הזה. חבר את צינורות "כניסה" אל המזרק ומלא על ידי החדרת בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את "הכניסה" צינור אל Slide-μ, עם טיפול, כדי למנוע החדרת אוויר לתוך החדר. לאחר מכן, לצרף את "יציאה" הצינור לקצה השני בזהירות למלא את הערוץ עם בינוני עד מרחק של כ 1 ס"מ "יציאה" את החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD600 חיידקים להסתגל 0.15 ב Endo-SFM המכיל 2% (v / v) FBS. כדי להסתכל על חיידקים בודדים, אגרגטים כל חייב להיות מופרת על ידי vortexing נמרץ של המדגם חיידקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 100 μl של אנדו-SFM בתוספת 2% (v / v) FBS בינוני לתוך המאגר ולהוסיף 100 μl של הפתרון חיידקי נלקח מהחלק העליון של הפתרון vortexed להימנע הדגימה כל אגרגטים חיידקי הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להציג את נפח 200 μl אל Slide-μ ידי סיבוב שסתום להזריק את החיידקים אל תוך החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו Endo-SFM המכיל 2% (v / v) FBS, שמרו על 37 מעלות צלזיוס עם פלטפורמת מחוממת, החדרה באמצעות משאבת מזרק עם הלחץ גוזז תואם הידבקות של 0.044 dynes / 2 ס"מ במשך 15 דקות. </li></ol> ראו למשל וידאו או 1 דמות 3. לאחר שלב זה, או לעבור סעיפים 3, 4 או 6. 3. כימות של הידבקות ראשונית של חיידקים בודדים לתאי המארח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הידבקות ראשונית במשך 15 דקות, לרכוש תמונות של עשרה שדות באקראי תוך הנוזל עדיין במחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תמונות שנרכשו באמצעות תוכנת ImageJ 8, על מנת לקבל גישה המספר הממוצע של חיידקים adherant לכל שדה. הדבר נעשה באופן הבא: קודם כל, כל תמונה היא thresholded באמצעות "סף" חלון נמצא בתפריט "תמונה" כדי להדגיש את הפרט חיידקים פלורסנט דבקות, תוך מזעור רקע מהתאים. ואז, כל חיידק בודד נספרת, באמצעות Plug-In "מונה Cell" ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ). הנתונים עבור כל תמונה מדווחים גיליון אלקטרוני של Excel הם ממוצעים לכמת את מספר ממוצע של חיידקים חסיד לכל שדה. </li></ol> 4. מדידת התנגדות לזרימה של חיידקים בודדים חסיד לתאי המארח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית מזרק משאבה הגדרת ליצור מתח גזירה החל 3-100 dynes / 2 ס"מ במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום 5 דקות, לרכוש ten שדות שנבחרו באקראי כמתואר בשלב 3.1, אבל עם הזרם נעצר יחסי ציבורIOR הרכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את התמונות רכשה כמתואר בשלב 3.2 ולכמת את המספר הממוצע של החיידקים הנותרים לכל שדה. </li></ol> 5. מדידת הצמיחה של חיידק חסיד מבודד microcolony <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו Endo-SFM המכיל 10% (v / v) FBS, שמרו על 37 מעלות צלזיוס עם פלטפורמת מחוממת, החדרה באמצעות משאבת מזרק עם הלחץ גזירה נבחר למשך כמה שעות. הקלטת תמונות מיקרוסקופיה וידאו בזמן אמת על מסגרת אחת כל 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מיקרוסקופיה וידאו, להפסיק את הלחץ גזירה ידי כיבוי משאבת מזרק, לרכוש 2-3 תמונות נוספות ולאחר מכן לעצור את רצף רכישת התמונה על התוכנה. דוגמה של שגשוג חיידקים ניתן לראות וידאו 2. </li></ol> 6. מדידת התנגדות לזרימה של microcolonies חיידקי חסיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר היווצרות של microcolonies גדול על פני הסלולר (step5.2) לרכוש 2-3 תמונות של תאים הן (לעומת שלב) חיידקים (על ידי ה-GFP-פלואורסצנטי) לפני יישום תזרים. במשך שארית של הניסוי, פרוטוקול הרכישה תפקח רק את הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת מתח גזירה גבוהה במשך 5 דקות (300-100 dynes / ס"מ 2) ותמונות שיא בכל מסגרת אחת כל 5 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את המתח גזירה ידי כיבוי משאבת מזרק, לרכוש 2-3 תמונות נוספות ולאחר מכן לעצור את רצף רכישת התמונה על התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להסיר את צינור "היציאה" הראשונה ובזהירות, כדי למנוע ריקון ערוץ ולאחר מכן להוסיף מראש חימם בינוני טרי למלא את בארות לפני הסרת צינורות "כניסה". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע כמותית את השפעת הלחץ גזירה על עמידות חיידקים, assay ציפוי יכול להתבצע כדלקמן: לאסוף את הנותרים בינוני לשטוף את μ-Slide פעמיים עם 120 μl של PBS, אשר מסיר את המדיום הנותרים מערוץ (שוטף הן ) נאסף גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים הנגועים עם תוספת של 50 μl של טריפסין / EDTA במשך 5 דקות ב 37 מעלות ו לערבב את זה עם מדגם מנותקת ההשעיה שנאסף בשלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע דילולים סדרתי PBS ואת הצלחת שבריר 10 μl לצלחות GCB אגר, בשלושה עותקים, על מנת לקבוע את מספר יחידות המושבה להרכיב (CFU) ביום שלמחרת, לאחר דגירה של הצלחות ב 37 ° C באינקובטור עם 5% (v / v) CO 2. </li></ol> וידאו 3 ו -4 להשוות את המתח סוג בר עם מוטציה pilV. 7. ניתוק מן חיידקית microcolonies <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק תאים בתא זרימה על ידי חזרה על שלבים 2.1-2.8 ולאפשר הזיהום להמשיך במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חיידקים מאוגד על ידי הגדלת זרימת dynes 10 / 2 ס"מ לתקופה של 2 דקות ולאפשר זיהום להימשך 2h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמצום זרימת 0.15 dynes / 2 ס"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל שעה, לאסוף ירידה של מדיום יוצא של החדר לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע דילולים סדרתי של דגימות צלחת אותם על צלחות אגר GCB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת מספר יחידות המושבה להרכיב (CFU) ביום שלמחרת, לאחר דגירה של הצלחות ב 37 ° C באינקובטור עם 5% (v / v) CO 2. </li></ol> 8. נציג תוצאות <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1: שלבים שונים של monolayer סלולרי שניתן לצפות ומדד בנוכחות זרימה בהליך. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2: monolayer תא האנדותל בחדר זרימה בתחילת הניסוי (היעדר לחץ גזירה). כ -50 לתאי אנדותל מאורגנים monolayer משנה ומחוברות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3: ייצוג גרפי של הידבקות ראשונית של חיידקים על פני השטח הסלולר. ערכים עבור שלושת השדות מסומנים כדי לתת מושג על וריאציה בשדה אל השדה צפוי (0044 dynes / ס"מ 2). וידאו 1. ויזואליזציה של הידבקות ראשונית של חיידקים על monolayer הסלולר כפונקציה של זמן (0044 dynes / ס"מ 2). GFP-להביע את החיידקים הבאים את הכיוון של המדיום זורם. הסרט מואץ פי 60, את משך הזמן האמיתי של הסרט הוא 10 דקות. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">לחץ כאן כדי לראות את הוידאו.</a> וידאו 2. החיידקים לאחר הדבקה ראשונית הורשו להתרבות על פני הסלולר לתקופה של 7 שעות (1000 מואץ פי). <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">לחץ כאן כדי לראות את הוידאו.</a> וידאו 3. לאחר הפצת נשק על פני השטח הסלולר המכונאיהתנגדות של אל microcolonies נבדק על ידי הגדלת רמת הלחץ גזירה dynes עד 10 / 2 ס"מ 5 דקות אבל microcolonies סוג בר עמידים מואץ פי 60. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">לחץ כאן כדי לראות את הוידאו.</a> וידאו 4. Microcolonies שיצרו מוטנט pilV הם שיבשו להגביר את זרימת (10 dynes / ס"מ 2). מוטציה זו אינה מצליחה להשפיע על שיפוץ של קרום פלזמה תחת microcolonies ולכן היא יותר רגישה ללחץ מוגבר גזירה (וידאו מואץ פי 60) 5. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">לחץ כאן כדי לראות את הוידאו.</a>

<ol><li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+Principles+of+Vascular+Beds%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li>
<li>Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+cells+sedimenting+on+a+solid+surface+in+a+laminar+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow.</a> Biophys J. 61, 204-215 (1992).</li>
<li>Mikaty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).</li>
<li>Chamot-Rooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modification+of+pili+upon+cell+contact+triggers+N.+meningitidis+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination.</a> Science. 331, 778-782 (2011).</li>
<li>Soyer, M., Dumínil, G. Bacterial adhesion under shear stress. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSoyer%2C+M+%22Neisseria+meningitidis%3A+Methods+and+Protocols+%28Methods+in+Molecular+Biology%29%22">Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)</a>. Christodoulides, M. , Humana Press Inc. New York. (2011).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li>
<li>Tchesnokova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-enhanced+binding+of+intestinal+colonization+factor+antigen+I+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).</li>
<li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

חשיבותה של מתח גזירה ובדרך כלל היבטים מכניים בביולוגיה הוא יותר ויותר מוכר. למשל המאפיינים דבק המותאמים ביותר של משפחת selectin של חלבונים בתהליך של הידבקות לימפוציטים, מתגלגלים על הקיר וסקולרית הוכר על ידי החדרת מתח גזירה בתהליך. ההליך המתואר לעיל היה להחיל את meningitidis גראם שליליים Neisseria חיידקים אבל צריך לחול על מגוון רחב של פתוגנים. חשיבותה של מתח גזירה הוכח גם ומזיקים ואתרי זיהום אחרים. הדבקה חיידקית מותנה מתח גזירה תוארה על ידי מחקר של adhesin FimH למצוא Escherichia coli uropathogenic (UPEC) 9. בדומה Selectins, את האינטראקציה בין FimH ואת התא המארח שלה קולטן הוצגה להיות מחוזקת על ידי גזירה-Induced כוחות מכניים 9 ו adhesin CfaE של enterotoxigenic E.coli דווחה גם לתווך הידבקות לתאי האפיתל במעי באמצעות גזירה תלויי מנגנון 10. דיווחנו, באמצעות זרימה למינרית assay קאמרית פרוטוקול המתוארת בפרק זה כי סטרפטוקוקוס agalactiae פילי היו חיוניים הדבקות של הפתוגן הזה לתאי האפיתל בתנאים תזרים 11. מחקרים אלה מאשרים כי קאמרית תזרים assay שלנו הוא כלי שימושי לחקר התא הפתוגן אינטראקציות מארח תחת תנאים של לחץ גזירה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> μ-Slide VI 0.4 ערכה תזרים </td><td> IBIDI </td><td> 80606 </td></tr><tr><td> מזרק 50 מ&quot;ל Plastipak Luer-Lock </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tygon R3603 Tubing 3.2 x 4.8mm </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> 3 כיווני שסתום, 2 luer נקבה luer זכר </td><td> Bio-Rad </td><td> 7328103 </td></tr><tr><td> משאבת מזרק </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ הפוך, ניקון </td><td> ניקון </td><td> Eclipse T i </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA 285 CCD או ORCA 3-CCD </td></tr><tr><td> ImageJ תוכנה </td><td> NIH </td><td> Freeware ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

במהלך זיהומים חיידקיים רצף של אינטראקציות מתרחשות בין פתוגן לבין המארח שלו. הידבקות חיידקים על פני השטח התא המארח היא לעתים קרובות הצעד הראשוני של קביעת בפתוגנזה. למרות ניסויי הדבקה נלמדת בעיקר בתנאים סטטיים הידבקות למעשה מתקיים בנוכחות זורם נוזל. המפגשים הראשונים בין חיידקים המארח שלהם לעתים קרובות להתרחש ברמת הרירית, הפה, הריאות, המעיים, עיניים, וכו &#39;שבו הריר זורם על פני השטח של תאים אפיתל. מאוחר יותר זיהום, פתוגנים מדי פעם הגישה את זרימת הדם ולגרום למחלות מסכנות חיים כגון אלח דם, דלקת קרום המוח septicemia ו. המאפיין של זיהומים אלה הוא היכולת של פתוגנים אלה לתקשר עם לתאי אנדותל בנוכחות של מחזורי הדם. הנוכחות של הזורם, הריר נוזל או דם, למשל, קובע הדבקה כי זה יוצר כוח מכני על הפתוגן. כדי לאפיין את ההשפעה של זורמים זה נוזל בדרך כלל מתייחס המושג גזירה של מתח, שהוא הכוח המופעל משיק ליחידת שטח על ידי נוזל מרגש ליד קיר נייח, שבאה לידי ביטוי dynes / 2 ס&quot;מ. עוצמות הלחץ גזירה להשתנות במידה רבה בהתאם לסוג כלי שונה, גודל, איבר, מיקום וכו &#39;(000-100 dynes / ס&quot;מ 2). השאלה של נימי דם יכול להגיע נמוכה מאוד להדגיש ערכים גזירה ואף להפסיק באופן זמני במשך תקופות שנעו בין כמה שניות עד מספר דקות 1. בצד השני של הספקטרום הלחץ גזירה arterioles יכול להגיע 100 dynes / 2 2 ס&quot;מ. ההשפעה של הלחץ גזירה על תהליכים ביולוגיים שונים הודגמה בבירור במהלך האינטראקציה של לויקוציטים עם 3 האנדותל כמו למשל. כדי לקחת בחשבון פרמטר זה מכני בתהליך של הידבקות חיידקים לקחנו את היתרון של הליך ניסיונית המבוססת על שימוש של זרימה חד פעמיות קאמרית 4. התאים גדלים מארח בחדר זרימה וחיידקים פלורסנט מוצגים בזרימת נשלט על ידי משאבת מזרק. אנחנו בתחילה התמקדה החקירה שלנו על פתוגן חיידקי Neisseria meningitidis, חיידק גראם שליליים אחראי על זיהום ודלקת קרום המוח. ההליך המתואר כאן מאפשר לנו לחקור את ההשפעה של הלחץ גזירה על היכולת של החיידקים: לדבוק 1 תאים, להתרבות על פני התא 5 ו לנתק ליישב אתרים חדשים 6 (איור 1). מידע טכני משלימה ניתן למצוא התייחסות 7. ערכי הלחץ שאר המוצגים כאן נבחרו בהתבסס על הניסיון הקודם שלנו 1 ו לייצג ערכים בספרות. הפרוטוקול אמור לחול על מגוון רחב של פתוגנים עם התאמות מסוימות בהתאם למטרות המחקר.

בתהליך ההדבקה, צעד מפתח הוא הדבקה של פתוגנים עם תאים המארח. ברוב המקרים שלב זה הידבקות מתרחשת בנוכחות הלחץ המכני שנוצר על ידי זרימת נוזל. אנו מתארים טכניקה מציגה הלחץ גזירה כפרמטר חשוב במחקר של הידבקות חיידקים.

במהלך זיהומים חיידקיים מתרחשת סדרה של אינטראקציות בין הפתוגן לבין המארח שלו. היצמדות חיידקית לפני השטח של תא המארח היא לעיתים קרובות ה...

סרטון זה מדגים פרוצדורה לבחינת ההשפעות של מאמץ גזירה (shear stress) על הידבקות חיידקים. במהלך זיהום חמור על ידי פתוגן חיידקי כגון *Neisseria meningitidis*, הפתוגן מגיע לזרם הדם, ושם הוא נצמד לתאי המאחסן ומאכלס אותם תוך כדי חשיפה למאמץ מכני הנובע מזרימת הדם. לאחר השגשוג, חלק מהחיידקים נפרדים ומאכלסים אתרים חדשים, והמחזור מתחיל מחדש. כדי לחקור גורמים המשפיעים על הידבקות חיידקים לתאי מאחסן, תאי אנדותל מוכנסים לתאי זרימה חד-פעמיים ומגודלים עד שהתאים מגיעים למצב של התלכדות (confluence).מוסיפים חיידקים פלואורסצנטיים ומבקרים באופן ניסיוני את מאמץ הגזירה. באמצעות משאבת מזרק, עוקבים מיקרוסקופית אחר ההיצמדות של החיידקים לתאי המארח ואחר השגשוגם. הסרטונים המתקבלים מנותחים כדי לקבוע את השפעת מאמץ הגזירה על תהליך הקולוניזציה של האנדותל.פרוצדורה זו עשויה להיות שימושית מאוד לחקר הפתוגנזה של דלקת קרומי המוח (meningitis), אך ניתן להשתמש בה גם עבור חיידקים אחרים החשופים למאמץ גזירה (shear stress) במהלך תהליך הפתוגנזה. טכניקה זו עשויה להיות מעט מורכבת לביצוע, במיוחד בכל הנוגע להחדרת בועות למערכת, דבר שעלול להוות בעיה. לכן, היום ידגים את הפרוצדורה מגה, סטודנט לדוקטורט העובד במעבדה שלי.הניסויים המתוארים בסרטון זה מבוצעים באמצעות תאים שגודלו ב-IDI micro slide six 0.4, המורכב משקופית פלסטיק סטרילית חד-פעמית הכוללת שישה תעלים באורך 17 מילימטר וברוחב 3.8 מילימטר, ובעומק של 0.4 מילימטר. לכל תעלה יש שני פתחי גישה עם מתאמי lure, אחד בכל קצה, להחדרת תאי uve; העבירו באמצעות פיפטה 30 µL של סספנסיות תאים בריכוז 1×10⁶ לכל אחת מהתעלות שבשקופית. המתינו שלוש שעות להיצמדות התאים בתוך אינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C ובאטמוספירה של 5% CO2.לאחר הדגירה, הוסיפו 120 µL נוספים של endo SFM. למילוי הבארים, התאים צריכים להוות שכבה חד-שכבתית תת-מסמילה (sub confluent monolayer) לאחר כ-20 שעות. בינתיים, זרעו *Neisseria meningitidis* המבטאת GFP על APLs; החיידק הוא פתוגן אנושי.לפיכך, כל מניפולציה של מיקרואורגניזם זה צריכה להתבצע במתקן בטחון ברמה 2 עם צוות מיומן הלובש חלוק וכפפות; מומלץ לחסן את אנשי הצוות נגד קבוצת הסרו (sero group) שבה נעשה שימוש. כאן מוצג זן 8 0 1 3. ביטוי של GFP מבוצע תחת בקרה של פרומוטור אינדוציבי מסוג IPDG בשיטת מריחה.מדגסו את החיידקים על מצעי GC BPL המכילים תוספי Kellogg ו-5 µg/mL של chloramphenicol באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 למשך 16 שעות. לאחר ביסוס תרביות תאי היונקים, מוסיפים את החיידקים לתאי המארח בתעלה. כהכנה למערך הזרימה, אספו בעזרת לולאת תazolid (inoculating loop) את החיידקים מתוך פטריאת הפטרי, והעבירו אותם למבחנה קונית בנפח 50 mL המכילה תרבית תאי אנדותל מתוספת שחוממה מראש.מצע Endo SFM. התאימו את הצפיפות האופטית ל-OD 600 של 0.05 על ידי דילול הדגימה באותו מצע לנפח סופי של חמישה מיליליטרים. כדי להשרות ביטוי של GFP, הוסיפו IPTG לריכוז סופי של one millimolar והדגירו את התרבית למשך 120 דקות.באינקובטור עם לחות, בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%CO2, עם ניעור עדין. מקמו את המיקרו-שקופית עם תאי אנדותל מתרבית שהוכנה קודם לכן על השולחן של מיקרוסקופ הפוך המצויד בפלטפורמה מחוממת, כדי לשמור על טמפרטורת הדגימה ב-37 degrees Celsius. שפכו endo SFM שחומם מראש ותומכן ב-2%FBS לתוך כלי זכוכית סטרילי ומלאו מזרק של 50 milliliter על ידי משיכה של הבוכנה.צינור הכניסה מחובר לברזים בעל שלושה כיוונים (three-way stop cock). לאחר מכן, חברו את צינור הכניסה למזרק ולחצו על הבוכנה כדי למלא את הצינור במצע. חברו בזהירות את הקצה השני של צינור הכניסה לשקופית המיקרו (micro slide) באמצעות מחברי הזווית הישירה המסופקים.הימנעו מהחדרת אוויר לתא. הניחו את המזרק על המשאבה, ולאחר מכן הניחו מזרק של 1 mL חתוך בחריץ הפנוי של הברז (stop cock) שישמש כמאגר. לאחר מכן, חברו את צינור היציאה לקצה השני של התעלה ומלאו בזהירות את התעלה במצע, על ידי לחיצה על בוכנת המזרק עד למרחק של כ-1 ס"מ מיציאת התא.מדוד את ה-OD 600 של החיידקים והתאם אותו ל-0.15 בתוך endo SFM המכיל 2%FBS כפי שנעשה קודם לכן; ערבב את הדגימה במערבל (vortex) בעוצמה כדי לפרק צברי חיידקים. לאחר מכן, באמצעות פיפט פסטור פלסטי חד-פעמי, העבר 100 microliters של תווך endos fm, המועשר ב-2%FBS, אל תוך המאגר. לאחר מכן, שאב 100 microliters מהתמיסה החיידקית מהחלק העליון של התמיסה שעובדה במערבל והוסף אותם למאגר.סובב בזהירות את הברז, והזרק את החיידקים לתא של המיקרו-סלייד כדי לאפשר להיצמדות להתבצע בנוכחות רמה מבוקרת של מאמץ גזירה (shear stress). הכנס endo SFM המכיל 2%FBS לתא באמצעות משאבת מזרק בקצב של 3.5 milliliters per hour למשך 15 דקות. סרטון זה מואץ פי 60.משך הזמן בפועל הוא 10 דקות. לאחר שלב זה, ניתן להעריך ולתאר את ההיצמדות וההיפרדות של חיידקים מתאי מאכסן תחת תנאים שונים, כפי שיוסבר בסעיפים הבאים של הסרטון. כדי לכמת את ההיצמדות הראשונית של חיידקים בודדים לתאי מאכסן, התחילו ברכישת תמונות לאחר 15 דקות של זרימה בעוד הנוזל עדיין במחזור, ורכשו תמונות של 10 שדות אקראיים כדי לקבוע את מספר החיידקים הנצמדים הממוצע לכל שדה שצולם.התחילו בפתיחת תוכנת ImageJ ופתחו את התמונה המיועדת לניתוח. התחילו בלחיצה על תפריט Image ובחירה ב-Adjust brightness contrast.בצעו אופטימיזציה להדמיה של חיידקים פלואורסצנטיים בודדים הנצמדים לרקע על ידי התאמת רמות העוצמה באמצעות הזזת הסמן. לאחר מכן, בתפריט הפלאגין, ניתוח ספירת תאים (analyze cell counter). פתחו את כלי ספירת התאים, אתחלו את התמונה, בחרו את סוג האובייקט ולחצו על כל אחד מהחיידקים הבודדים.מספר החיידקים הכולל מופיע בחלון. לבסוף, ייצא את הנתונים עבור כל תמונה ל-excel ובצע ממוצע כדי לכמת את המספר הממוצע של חיידקים דבקים לשדה, על מנת למדוד את העמידות של חיידקים דבקים בודדים לזרימה. לאחר 15 הדקות הראשונות של תוכנית הזרימה, הגדר את מערכת משאבת המזרק ליצירת מאמץ גזירה בטווח של שלושה עד 100 dynes לסנטימטר רבוע למשך חמש דקות.בסיום חמש הדקות, הפסיקו את הזרימה, רכשו ונתחו 10 שדות אקראיים כפי שנעשה קודם לכן, כדי לקבוע את מספר החיידקים הממוצע שנותרו לכל שדה. לאחר 15 הדקות הראשונות של הזרימה,כווננו את משאבת המזרק למאמץ הגזירה הנבחר. אפשרו לזרימה להימשך במשך מספר שעות, ותעדו תמונות בקצב של פריים אחד בכל חמש דקות.באופן אידיאלי, ניתן לעקוב אחר מספר מיקומים אם המיקרוסקופ מצויד בפלטפורמת XY ממוטרת. לאחר צילום הווידאו המיקרוסקופי, הפסיקו את מאמץ הגזירה על ידי כיבוי משאבת המזרק. רכשו שתי עד שלוש תמונות נוספות באופן מיידי, ולאחר מכן הפסיקו את רצף רכישת התמונות בתוכנה.ניתן לראות כאן דוגמה לשגשוג בקטריאלי. לבסוף, כדי לנתח תמונות, השתמשו בתפריט image adjust threshold של ImageJ כדי להמיר את התמונות לבינאריות. לאחר מכן, בתפריט analyze תחת set measurement, בחרו במדידת השטח (area measurement).לאחר מכן, השתמש בכלי ניתוח החלקיקים (analyze particle) כדי לקבוע באופן אוטומטי את גודל המושבות. מיקרו-מושבות גדולות נוצרות על פני השטח התאי לאחר חמש עד שבע שעות, ללא קשר לשאלה אם נשמרת זרימה בשלב זה. כדי למדוד את עמידות המיקרו-מושבות לזרימה, רכוש תחילה שתיים עד שלוש תמונות של שני התאים באמצעות ניגודיות פאזה (phase contrast) והבקטריות באמצעות פלואורסצנציית GFP.הפעיל מאמץ גזירה גבוה למשך חמש דקות ודגום תמונות פלואורסצנציה בקצב של פריים אחד מדי חמש שניות. הפסק את מאמץ הגזירה על ידי כיבוי משאבת המזרקים. רכוש שתי עד שלוש תמונות נוספות ולאחר מכן הפסק את רצף רכישת התמונות בתוכנה כדי לאסוף את המצע עבור בדיקת זריעה (plating assay).ראשית, הסר את צינור היציאה תוך הקפדה להימנע מריקון התעלה. הוסף מצע טרי שחומם מראש כדי למלא את הבארות. לאחר מכן, הסר את צינור הכניסה, אסוף את המצע שנותר באמצעות מיקרו-פיפט והעבר אותו לתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה. כדי להסיר שאריות מצע מהתעלה, שטוף את המיקרו-סלייד פעמיים על ידי הוספה של 120 µL של PBS לתעלה.הטיית הזריקה פעמיים ושפיכת המצע. כדי לאסוף את התאים המודבקים, יש להוסיף 50 µL של tripsin EDTA למיקרו-זריקה ולהדגיר למשך חמש דקות ב-37 °C כדי להפרידם מהתעלה, ולאחר מכן לערבב דגימה מופרדת זו עם תרחיף שנאסף בשלב הקודם. לאחר ביצוע דילול סדרתי ב-PBS, יש להעביר מנות של 10 µL לצלחות GCB agri ובשלוש חזרות להדגיר ב-37 °C ו-5% CO2 למשך לילה.ביום למחרת, קבעו את מספר היחידות יוצרות המושבות (colony forming units) כדי להעריך את התנתקות החיידקים מהמושבות המיקרוסקופיות. הדביקו את התאים בתא הזרימה (flow chamber) כפי שנעשה קודם לכן בזרימה נמוכה של 3.5 milliliters per hour; לאחר 30 דקות, הסירו חיידקים שאינם קשורים על ידי הגדלת הזרימה לחמישה milliliters per minute למשך שתי דקות, ולאחר מכן חזרו לזרימה נמוכה של 3.5 milliliters per hour ואפשרו להדבקה להימשך במשך שעתיים. לאחר מכן, בכל שעה, אספו טיפת מצע היוצאת מתא הזרימה אל תוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה למשך ארבע שעות.לאחר איסוף כל הדגימות, קבעו את מספר היחידות יוצרות המושבות (CFU) כפי שנעשה קודם לכן. זהו ייצוג גרפי של ההיצמדות הראשונית של חיידקים לפני השטח התאיים. כל קו בגרף מייצג את המספר המצטבר של חיידקים שנקשרו בשדה נתון כפונקציה של הזמן.ערכים עבור שלושה שדות צוינו כדי לתת מושג לגבי השונות הצפויה בין שדה לשדה לאחר התרבות על פני השטח התאי. העמידות המכנית של מיקרו-מושבות נבדקה על ידי העלאת רמת מאמץ הגזירה ל-10 dines לסנטימטר רבוע, אך בעוד שמיקרו-מושבות מסוג הטיפוס עמידות, מיקרו-מושבות שנוצרו על ידי המוטציה pill v מתפרקות בעקבות עלייה בזרימה. מוטציה זו נכשלת בהשראת עיצוב מחדש (remodeling) של ממברנה הפלזמה מתחת למיקרו-מושבות, ולכן היא רגישה יותר למאמץ גזירה מוגבר לאחר התפתחותה.טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים אחרים בתחום המחלות הזיהומיות לבחון את ההשפעה של מאמץ גזירה על האינטראקציה של פתוגנים שונים עם סוגי תאים שונים. זכרו כי עבודה עם פתוגנים אנושיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ובהתאם לכך יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון נקיטת אמצעי בטיחות ברמה 2 או 3, בעת ביצוע פרוצדורה זו.

introducing-shear-stress-in-the-study-of-bacterial-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: דיטקובסקי, ב. ואחרים. מודל Invitro של מערכת פרפוזיה מקבילה לחקר היצמדות חיידקית לרקמות השתלות. J. Vis. Exp. (2019).סרטון זה מדגים את השיטה לשימוש בתא זרימה מקביל לפרפיוז חיידקים מסומנים פלואורסצנטי מעל רקמות השתל הוסקולרי, ומאפשר ניתוח מבוקר של הידבקות חיידקית ופתוגנזה מוקדמת בתנאי זרימה גזירה.

מודל זרימת הלוחה המקבילה במבחנה לחקר הידבקות חיידקית בביופסיית רקמה

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

כדי לחקור את האינטראקציה של חיידקים עם כלי הדם תחת לחץ גזירה, מתוארים תא זרימה ומודל מיקרוסקופיה תוך-חיונית מזנטרית in vivo המאפשרים לנתח את גורמי החיידקים והמארח התורמים להידבקות כלי הדם.

במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת

התקשרות חיידקית לתאי מארח היא שלב מפתח במהלך קולוניזציה וזיהום של המארח. פרוטוקול זה מתאר את הייצור של הידבקויות רקומביננטיות מצומדות פולימר כחומרים ביומימטיים המאפשרים ניתוח של תרומתם של הידבקויות בודדות לתהליכים אלה, ללא תלות בגורמים חיידקיים אחרים.

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

assay הידבקות זרימה זו מספק מודל השפעה פשוט, גבוה של אינטראקציות תא אפיתל T. משאבת מזרק משמש להפקת מאמץ הגזירה, וכן במיקרוסקופ confocal לוכדת תמונות כימות. מטרת המחקרים אלה היא לכמת הידבקות תא T ביעילות באמצעות תנאי זרימה.

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

הידבקויות פני התא הם מרכזי mechanotransduction, כפי שהם לשדר מתח מכני ליזום את מסלולי איתות מעורבים הומאוסטזיס ופיתוח רקמות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח את התהליכים הביוכימיים אשר מופעלים בתגובה מתח, באמצעות microbeads מגנטי מצופה ליגנד ויישום כוח לקולטנים הידבקות.

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

פיתחנו assay מבוססי לזיהוי של עיצוב רב טוב עבור בודק את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד. Assay הזה הוא תואם cytometry זרימה immunostaining, מיקרוסקופ כוח המתיחה, המאפשרות מדידות כמותיים של אינטראקציות biomechanical בין תאים, מטריצה חוץ-תאית, לבין חיידקים פתוגניים.

Assay מבוססי לזיהוי עיצוב רב טוב ללמוד את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד

כאן, אנו מתארים את השימוש תפוקה גבוהה יותר microfluidic מגיב ביולוגי בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי לניתוח של גזירה השפעות על biofilms Pseudomonas aeruginosa המבטאים חלבונים ניאון ירוק, כולל כלי להגדיר, הקביעה של כיסוי biofilm, שיעור הצמיחה ומאפיינים מורפולוגי.

חיים תא ניתוח של גזירה על Pseudomonas aeruginosa באמצעות מערכת אוטומטית Microfluidic תפוקה גבוהה

שיטה זו שימושית לכמת את הדינמיקה המוקדמת של הדבקה תאית והפצת תאים התלויים באנקורג ' בתוך הפיברוטין. יתר על כן, שינוי זה ניתן להשתמש כדי לחקור את ההשפעות של שינוי הומאוסטזיס מחדש על התפשטות התא ו/או הדבקה תא הקשורות מסלולים תאיים איתות.

בחינת הדינמיקה של הדבקה תאית והפצת תאים אפיתל על Fibronectin במהלך לחץ חמצוני

פרוטוקול זה מציג את ההליכים הניסיוניים לביצוע טביעת הרגל של הידבקות כדי לדמיין את אירועי ההדבקה במהלך הידבקות מהירה של תאים.

הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי

למדו כיצד לחקור את השפעת מתח הזרימה על הידבקות חיידקית לתאי מארח באמצעות תאי אנדותל וחיידקים פלואורסצנטיים בניסויי זרימה מבוקרת. שיטה זו מאפשרת ניתוח מיקרוסקופי של דינמיקת הידבקות.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

גלה סרטונים נוספים