במצע כפולה vivo bioluminescent ההדמיה
11 באוקטובר 2011
להלן נתאר את השיטות לבנייה, לדמיין, ולכמת את התגובות של שניהם bioluminescent גחלילית ואנזימי וציפראז renilla לידי ביטוי בתאי סרטן השד גרורתי בעת הצמיחה וגרורותיהם In vivo.
נוהל זה מאפשר ויזואליזציה וכימות של לוקיפראז של Ran ולוקיפראז של גחליליות. בפיתוח גידולים אורתוטופיים in vivo, התחילו ביצירת שורות תאים יציבות המבטאות לוקיפראז של Ran vanilla, לוקיפראז של גחליליות, או את שניהם. לאחר מכן, בצעו אימות תפקודי של הבקרה in vitro של מבנה הדוח (reporter construct) המבוטא באופן יציב.
השלב הבא הוא השתלת תאים בתוך כרית השומן של בלוטת החלב (mammary fat pad), וקליטה וכימות של קריאות לוסיפראז מסוג ran ו-firefly. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אימונוהיסטוכימיה, הוא שהיא מאפשרת מעקב אורכי ודינמי אחר בקרה גנטית in vivo במהלך התקדמות הגידול והגרורות. התחילו על ידי העברה של ארבעה תרביות של תאי קרצינומה מהסוג T one memory עם וקטור ביטוי המקודד ללוסיפראז vanilla.
בצע טרנספקציה תחת ריכוז אנטיביוטי אופטימלי למשך מספר ימים. לאחר מכן, בחר כ-10 מושבות בודדות המבטאות ran vanilla luciferase כדי לנטר את רמת הביטוי. המשך להרבות את המושבות המבטאות כמויות גבוהות של ran vanilla luciferase לצורך אנליזות פונקציונליות.
בצעו תת-שיבוט (Sub clone) של אזור הפרומוטר הרלוונטי לתוך פלסמיד דוחה (reporter plasmid) מסוג PGL four luciferase, הנושא מרקר לבחירה השונה מזה ששימש לבחירת ביטוי ונילה (vanilla expression) יציב; טרנספקטו את התאים הממאירים ובחרו אוכלוסייה פוליקלונלית יציבה של לוציפראז גחליליות (firefly luciferase) באמצעות בדיקות גן דוחה של לוציפראז מבוססות תאים in vitro מסורתיות בלוחות של 96 בארות. ודאו כי תאי ה-DBR מווסתים את ביטוי הלוציפראז הגחלילי באופן התואם לזה שנצפה בתאים ההוריים שעברו טרנספקציה זמנית. עם וקטורים אלו, הניחו את התאים על מנער אורביטלי למשך 15 דקות כדי ללוס (lyse) את התאים.
כמו כן, יש לוודא כי ביטוי של vanilla המונע על ידי CMV אינו מווסת על ידי גירויים תאיים שונים או תנאי טיפול. יש להרבות את תאי ה-DBR metastatic four one memory carcinoma בעלי פלואורסצנציה נמוכה ביום שלפני המועד המתוכנן. למעבר של הזרקה in vivo, יש להפריד את תאי ה-four one להזרקה באמצעות טריפסין.
שטוף היטב במצע גידול ודלל את התאים ב-PBS באופן מיידי. אחסן על קרח. הרדם עכברות bowel C נקבות בנות ארבעה עד שישה שבועות באמצעות isof fluorine.
באמצעות פינצטה, תפסו בעדינות והרימו את כרית השומן הפנימית (inguinal memory pad) הרביעית. מקמו בזהירות מחט בכיול 27.5 gauge, כאשר צד השבב (bevel) פונה כלפי מעלה, והזריקו לתוך כרית השומן ישירות מתחת לפטמה.
יש להקפיד במיוחד שלא לדחוף את המחט אל תוך חלל הבטן. שחררו את בלוטת הריח והזריקו לאט 50 µL מתליהית התאים לתוך כרית השומן של בלוטת הריח בעוד העכברים עדיין תחת הרדמה. הזריקו 100 µL של red eject cine לווריד הזנב הלטרלי.
העבירו מיד את העכבר למערכת ההדמיה IVUS 200 ורכשו תמונת לומינסנציה למשך דקה אחת. העבירו את העכבר חזרה לכלוב למשך כשעה, כדי להבטיח שכל אות Luciferin שנותר התפוגג. כעת, מזן D-Luciferin potassium salt באמצעות הזרקה IP; לאחר חמש דקות, הרדימו את העכבר באמצעות isoflurane.
העברה ל-IVUS 200 במיקום מקביל לזה שבצילום המקור של RAN vanilla. באמצעות תוכנת ה-IVUS living image שמוגדרת למצב פוטונים (photons mode), קבע ערכים הן עבור רכישות ה-and והן עבור רכישות ה-firefly.
תאי ה-41 האגרסיביים מאוד יוצרים גידולים מורגשים תוך שבוע. לכן, בכל שבוע יש להזריק לעכברים red eject cine כדי לנטר את צמיחת הגידול הכללית ואת הגלישה (metastasis). לאחר מכן, יש להזריק d Lucifer כדי לנטר סיגנלציה ספציפית למסלול במהלך שלבים שונים של התפתחות הגידול.
עקבו אחר גדילת הגידול הראשוני על ידי נרמול רכישות לוקיפראז של RAN למדידות הראשונות בזמן ההחדרה של תאי הגידול. חשוב מכך, חשבו ערכי RLR לאורך זמן כדי לקבוע את הוויסות הזמני של מערכות איתות בודדות ביחס לגדילת הגידול ולהתקדמותו. כעת, השוו את ערכי ה-RLR הריאתיים לעומת אלו שחושבו עבור הגידול הראשוני כדי לקבוע את הוויסות המרחבי של מערכות איתות בודדות ביחס לגדילת הגידול ולגרורות.
תמונות ביולומינצנציה כפולות משמשות להדמיה ומעקב אחר שינויים בהרכב התאי בתוך הגידול הראשוני. ראשית, ערבבו תאי 4T1 המבטאים לוציפראז ונילה עם מקביליהם של תאי 4T07, שהם איזוגניים ולא מטאסטטיים ומבטאים לוציפראז גחליליות, ולאחר מכן הזריקו יחסי ערבוב שונים של אוכלוסיות תאי סרטן השד מעורבות אלו לתוך רפידת השומן של בלוטת החלב כפי שהודגם קודם לכן. רכשו מיד תמונות של לוציפראז גחליליות ולוציפראז ונילה כדי לקבוע RS ראשוני המייצג תערובת תאים מוחדרת נתונה.
המשיכו להשיג תמונות ביולומינסנציה כפולות לאורך זמן כדי לתאר את ההרכב התאי בתוך הגידול הראשוני. כמו כן, העריכו את הגלישה המרחבית-זמנית (spatiotemporal metastasis) של כל נגזרת של סרטן השד ביחס לצמיחת הגידול ולהתקדמותו. מכיוון שכל תמונה עקבית פנימית ומבוקרת, האות המתמיד מהגידול הראשוני מהווה מדד חשוב להערכת הכישלון הכולל של כל רכישת נתונים מסוג vanilla ו-firefly.
המצע לנין רגיש מאוד לחמצון הגורם ללומינצנציה עצמית. כאן, הזרקה ורידית כושלת של לנין מייצרת אות לא ספציפי מהמעי, ולא מהגידול הראשוני המבוסס. ברכישה כלייתית מוצלחת זו של עכבר הנושא גידול ראשוני 41 וגרורות ריאתיות, ניתן להפיק מדידות של אותים ספציפיים למסלול באמצעות הדמיה של לוציפראז גחלילית.
נתונים אלו מאפשרים חישוב של RS הן מהגידול הראשוני והן מהגרורות הריאתיות שלו. לאחר השלמת ניסוי זה, ניתן להשתמש בטכניקות אחרות, כגון אימונוהיסטוכימיה והיברידיזציה in situ, כדי לוודא כי התוצאות ב-mRNA ובחלבון מווסתות באופן דומה למבנה שדיווחת.
סקירה כללית
מחקר זה מתאר שיטה לבנייה, ויזואליזציה וכימות של תגובות ביולומינסנציה של אנזימי לוסיפראז של חרקית ושל renilla בתאי סרטן שד גרורתי. גישה זו מאפשרת מבט דינמי על בקרה גנטית במהלך צמיחת גידול וגרורות in vivo.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אונקולוגיה
- דימות בביולומינסנציה
רקע
- דימות ביו-לומנסנטי מספק תובנות לגבי התקדמות הגומאה.
- אנזימי לוציפראז משמשים כחלבונים מדווחים יעילים לביטוי גנים.
- מחקרים in vivo מאפשרים ניטור בזמן אמת של דינמיקת הגומאה.
- שיטות קיימות, כגון אימונוהיסטוכימיה, חסרות יכולות למעקב אורך.
מטרת המחקר
- להדמיה וכמידה של פעילות לוסיפראז במודלים של סרטן השד.
- למעקב אחר צמיחת הגידול וגרורות לאורך זמן.
- להשוואת מסלולי איתות בגידולים ראשוניים ובגרורות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקמה של תאי שורה יציבים המבטאים אנזימי לוסיפראז.
- השתלה של תאים לרקמת השומן של בלוטת החלב בעכברים.
- שימוש בדימות ביו-לומנסנטי (bioluminescent imaging) למעקב אחר צמיחת הגידול.
- כימות אותי לוסיפראז להערכת בקרה גנטית.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של דינמיקת גידול גידולים באמצעות דימוי לוקיפראז כפול.
- ביסוס של שיטה למעקב אחר בקרה מרחבית של מסלולי איתות.
- הדגמת היתרונות של דימוי ביו-לומינסנטי לעומת שיטות מסורתיות.
- זיהוי שינויים זמניים בביטוי לוקיפראז במהלך התקדמות הגידול.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי רב-עוצמה לחקר ביולוגיה של גידולים.
- דימות ביו-לומינסנטי משפר את ההבנה של תהליכי גרורות.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל טכניקה זו לצורך הערכות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות ביו-לומינסנטי בעל מצע כפול מאפשר ניטור אורך, בזמן אמת, של צמיחת גידולים ודינמיקה של מסלולי איתות in vivo, ובכך נותן מענה לפער קריטי במחקר של סרטן השד גרורתי. על ידי כימות סימולטני של עומס הגידול וביטוי גנים ספציפי למסלול, גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים וביטחון ניבואי בתיקוף יעדים. היא מספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה ושחזור להערכת התערבויות טיפוליות לאורך שלבי הגילוי והשלבים הפרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של בקרה מרחבית-זמנית של מערכות איתות במהלך התפתחות גידולים גרעורתייםים ומטסטזיס.
- ערך תפעולי: מאפשר מעקב אורכי של פעילות מסלולים בגידולים ראשוניים ובגרורות בתוך אותה קבוצת בעלי חיים.
- ערך חיזוי: תומך בביטחון במטרה על ידי הקשר בין פעילות מקדם של Smad Binding Element לבין התקדמות גרורתית בנגעים ריאתיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות לומינצנציה כמותיות עם בקרה פנימית עבור נתיבי לוקספרה של גחליליות ושל רנילה.
- ערך תפעולי: קובע פרוטוקולי דימוג סטנדרטיים לרכישת אותים ונורמליזציה של סובסטרט כפול.
- قابליות הרחבה: מאפשר הערכה אורך של צמיחת גידולים וגרורות באמצעות דימוג ביולומינצנטי סדרתי לאורך שבועות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: מקשרת בין דינמיקת השליחויות in vivo לבין צמיחה מטאסטטית על ידי השוואת ערכי RLR ריאתיים לבסיסי הגידול הראשוני.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מנטרת שליחויות ספציפיות למסלול במהלך שלבים מובחנים של התפתחות הגידול והפצתו.
- מערכת רלוונטית למחלה: משתמשת במודל סרטן השד האורתוטופי 4T1 כדי לבחון שינויים בביטוי גנים הרלוונטיים למטאסטזה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת היפותזות בשלבים מוקדמים של תיקוף מטרות, תומכת במוכנות של בדיקות (assays) בתהליכי סריקה, ומספקת מידע לקבלת החלטות על קידום לשלבים פרה-קליניים באמצעות ניתוח כמותי של מסלולים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה של פעילות פרומוטור של Smad Binding Element בהקשרי גידולים גרורתיים ומטאסטזים.
- סריקה: מספק פלטי bioluminescent הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה, לצורך מעקב אחר ויסות גנים במהלך התקדמות הגידול.
- אנליטיקה: מספק מדידות פוטוניות כמותיות ונורמליזציה של RLR לצורך השוואת דינמיקות של איתות בין אתרי גידולים ונקודות זמן שונות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין קריאות איתות של לוסיפראז לבין עומס מטאסטטי ופיתוח נגעי ריאה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימות לשימוש חוזר עבור מחקרים ארוכי טווח של צמיחת גידולים ומודולציה של מסלולים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי קורלציה בין גדילת הגידול לשינויים באותות ספציפיים למסלול לאורך זמן.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה באמצעות בקרות אות פנימיות ועקביות בדימות לאורכי.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת תובנות כמותיות ודינמיות לגבי מעורבות המטרה ופוטנציאל מטאסטטי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון המבוסס על בקרה זמנית ומרחבית של מסלולים אונקוגניים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בשבטיקה מולקולרית, יצירת קווי תאים יציבים ותיקוף של דגמי דשק לוסיפראז (luciferase reporter).
- תלוי במערכות דימוי ביו-לומינסנטיות המסוגלות לזיהוי פוטונים של סובסטראט כפול ולמתן סובסטראטים באופן סדרתי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור פרוטוקולי דימוי, מינוני סובסטראט ונהלי נורמליזציה של אותות.
- כולל שיקולי התאמה עבור מבני פרומוטר-דשק שונים ומודלים של סרטן מעבר לסרטן שד מסוג 4T1.
- כולל מגבלות מעשיות כגון רגישות הסובסטראט לחמצון והפרעה פוטנציאלית לאות כתוצאה מטכניקות הזרקה שגויות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Stable Expression of CMV-Driven Renilla Luciferase
1:36
Expression, Selection, and Functional Verification of Inducible Promoter-Driven Firefly Luciferase
2:32
Establishing 4T1 Primary Mammary Tumors
3:25
Initial Dual Luminescent Imaging
4:22
Longitudinal Luminescent Imaging
5:17
Dual Bioluminescent Imaging of Two Unique Cell Types in a Single Animal
6:16
In vivo RLRs from Dual Bioluminescent Imaging
7:10
Conclusion
