Name: אינדוקציה וניטור של רגישות יתר מושהית-Type המאמצת בחולדות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 6 s
Description: למדו שיטה לאינדוקציה וניטור של רגישות יתר מושהית-Type מאמצת בחולדות Lewis באמצעות הפעלת תאי זיכרון T אפקטורים ספציפיים לאנטיגן ומדידת דלקת באוזניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר אלכסנדר Flugel (Martinsried, גרמניה) למתן לנו את ה-GFP שכותרתו קו, T ovalbumin ספציפי תא בשימוש בפרוטוקול זה.

1. גירוי של ovalbumin ספציפי לימפוציטים מסוג T. מנוחה ovalbumin ספציפי בתאי T הם מגורה עם ovalbumin בנוכחות מוקרן thymocytes לואיס חולדה (30 Gy), כמו תאים הצגת אנטיגן (נגמ&quot;שים), ב בינוני גירוי (הכינו DMEM + פן / סטרפטוקוקוס / L-שפע + + NEAA RPMI ויטמינים + + 2ME עכברוש סרום + Ovalbumin, בכל הריכוזים הסופי לציין ברשימת החומרים.) עכברוש בסרום הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו לוקחים סרום של חולדות להקריב כפי שאנו תורמים התימוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חולדות מורדמים עמוקות שאיפה halothane וכן דם רב ככל האפשר נמשך על ידי זלוף לב (50-10 מ&quot;ל לכל חולדה) באמצעות מזרקים 10 מ&quot;ל ו - 23 ג 1 &quot;מחטים, שלאחריו חולדות הן ערופה מיד על מנת להבטיח מוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדם מותר קריש עבור 10 דקות בשעה 37 ° C ואחריו 10 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריש הוא להסיר את הנוזל הנותר הסתובב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרום נאסף, סטרילי, מסונן ומאוחסן ב -20 ° C. </li></ol> הכנת התאים המציגים אנטיגנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התימוס של חולדה ערופה באמצעות מכשירים סטריליים ולמקם אותו PBS המכיל פניצילין וסטרפטומיצין (PBS-PS), על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התימוס כדי ברדס בתרבית רקמה, לנקות אותו מכל קרישי דם ורקמות אחרות לזהם לחתוך אותו לחתיכות קטנות לתוך מסננת תא (פישר # 08-771-2) להציב צלחת פטרי 10 ס&quot;מ המכיל 10 מ&quot;ל של PBS- PS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל תכשיט הוא לחוץ דרך מסננת התא באמצעות האחורי של הבוכנה סטרילי 1 מ&quot;ל במזרק. אסוף את ההשעיה תא בודד לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את מסננת תא עם עוד 20-40 מ&quot;ל של PBS-PS. צנטריפוגה את ההשעיה על 1250g ו resuspend גלולה PBS ב-PS, 5 מ&quot;ל / התימוס, על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקרינים זה השעיה (30 Gy) ב irradiator גמא מיד לשטוף אותו פעמיים עם 50 מ&quot;ל PBS-PS. הערה: תורמים התימוס הטובים ביותר הם חולדות מבוגרים צעירים, 5-7 שבועות הישן. החולדות עד 10 שבועות, ניתן להשתמש אך את מספר התאים יורדת עם הזמן. מין לא חשוב אם כי כמה אנשים אומרים כי הזכרים הם תורמים התימוס טוב יותר. אנחנו תמיד להשתמש נקבות כי כל בעלי החיים שלנו הם שוכנו בחדר אחד ואנחנו לא רוצים זכרים ונקבות באותו חדר. </li></ol> גירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את לימפוציטים מסוג T אחת לספור אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן אנטיגן הצגת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 3 x 10 6 ovalbumin ספציפי בתאי T עם 150 x 10 6 נגמ&quot;שים בתוך צלחת פטרי 10 ס&quot;מ המכיל 10 מ&quot;ל של גירוי בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 48 שעות ב 37 ° C. </li></ol> 2. העברת המאמצת של ovalbumin ספציפי לימפוציטים מסוג T. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חולדות נשתמש כמקבל הן נקבות 7-10 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת לימפוציטים מסוג T, הם צריכים להיות גדולים ועגולים. הצגת אנטיגן תאים יהיה מת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה לימפוציטים מסוג T ו resuspend אותם 10 x 10 6 תאים / מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 1 intraperitoneally מ&quot;ל באמצעות 3 מזרקים מ&quot;ל ו 23 G 1 &quot;מחטים. </li></ol> 3. האתגר עם אנטיגן באוזן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לאחר העברת המאמצת, להזריק 20 μl של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ovalbumin פתרון (= אנטיגן רלוונטי) באוזן אחת מלוחים (או אנטיגן רלוונטי) באוזן אחרים. האם לא לסנן את הפתרון אנטיגן כפי שאתה עלול לאבד אגרגטים המשפרים את התגובה הדלקתית. הערה: חולדות צריכות להיות בהרדמה כדי למנוע תנועות. אם אתם ימניים, החזיקו את האוזן בין אגודל שמאל האצבע, האצבע המורה להיות בתוך האוזן ואת עכברוש פונה אליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את הפתרון פינה של האוזן באמצעות 27G &quot;מחטים ½. נסו להזריק כל החולדות בדיוק באותו מקום. </li></ol> 4. מדידה של DTH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוזן יתחיל ומאדים להתנפח כסימן של דלקת. מדוד את עובי של כל אוזן עם מיקרומטר קפיץ (עבור מודל לדוגמא PK-0505 מ Mitutoyo). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 5-6 מדידות עבור כל אוזן בנקודת זמן כל לחשב את הממוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפיחות המקסימלי אמור להתרחש בין 24 ל 72 שעות. </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. , 166-936 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+monitoring+of+active+delayed+type+hypersensitivity+%28DTH%29in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats.</a> J Vis Exp. (5), (2007).</li>
</ol>

האתגר antigenic יכול גם להתבצע באתרים אחרים, למשל בעור של הגב (2). עם זאת אנו מוצאים כי מאתגר. באמצעות אפרכסת האוזן, כפי שמוצג בסרטון זה, מאפשר מדידה מדויקת ביותר של תגובת DTH.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, על ידי Life Technologies</td><td>12430-062</td><td>500ml</td></tr><tr><td>סודיום פירובט (Sodium pyruvate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>1 mM סופי, במדיום גירוי</td></tr><tr><td>פניצילין &amp;#8211; סטרפטומייצין &amp;#8211; L-גלוטמין</td><td>Cambrex/BioWhittaker</td><td>17-718R</td><td>100 u/ml - 100 &amp;#x03BC;g/ml - 4 mM בהתאמה, סופי, במדיום גירוי</td></tr><tr><td>חומצות אמינו שאינן חיוניות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td>NEAA, 1% סופי, במדיום גירוי</td></tr><tr><td>ויטמיני RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7256</td><td>1% סופי, במדיום גירוי</td></tr><tr><td>בטא-מרקפט&amp;#8211;נול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>2ME, 50 &amp;#x03BC;M סופי, במדיום גירוי</td></tr><tr><td>סרום חולדה סינגני</td><td></td><td></td><td>1% סופי. ראו הסבר בפרוטוקול.</td></tr><tr><td>אוובלבומין (Ovalbumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml סופי, במדיום גירוי.</td></tr></tbody></table>

אינדוקציה וניטור של רגישות יתר מושהית-type המאמצת בחולדות

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

סוג של רגישות יתר מאוחרת (DTH) היא תגובה דלקתית בתיווך CCR7-T לימפוציטים מפעיל זיכרון לחדור את האתר של הזרקה של אנטיגן נגד שבו המערכת החיסונית כבר דרוך. התגובה הדלקתית מאופיין אדמומיות ונפיחות של האתר של אתגר antigenic. זהו מודל נוח על מנת לקבוע את ביעילות vivo של מערכת החיסון. DTH עורית יכול להיגרם גם על ידי העברת המאמצת של אנטיגן ספציפי לערמונית לימפוציטים מסוג T או על ידי חיסון פעיל עם אנטיגן, והאתגר intradermal הבאים עם האנטיגן לעורר תגובה דלקתית באזור העור נתון. התגובות DTH יכול להיגרם אנטיגנים שונים, ovalbumin למשל, טוברקולין, טטנוס toxoid, או hemocyanin חור המנעול עלוקה. תגובות כאלה יכולות להיגרם גם נגד autoantigen, למשל חלבון המיאלין הבסיסי (MBP) בחולדות עם ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis המושרה עם MBP, מודל חיה עבור טרשת נפוצה (1). כאן אנו מדגימים כיצד לגרום תגובת DTH המאמצת של לואיס חולדות. אנחנו יהיה הראשון לעורר ovalbumin ספציפי בתאי T במבחנה להזריק intraperitoneally תאים אלה מופעלים על חולדות נאיבי. לאחר המאפשר לתאים לאזן in vivo עבור 2 ימים, נוכל לאתגר חולדות עם ovalbumin ב פינה של באוזן אחת, בעוד אחרים מקבלים wil האוזן מלוחים. התגובה הדלקתית יהיה גלוי 3-72 שעות לאחר מכן ועובי האוזן תימדד כאינדיקציה לחומרת DTH.

סוג של רגישות יתר מאוחרת (DTH) היא תגובה דלקתית בתיווך CCR7-מפעיל זיכרון T (TEM) לימפוציטים. כאן אנו מדגימים כיצד להפעיל את אנטיגן ספציפי לערמונית תאים TEM, לגרום DTH המאמצת בחולדות לואיס לפקח על התגובה הדלקתית.

אינדוקציה וניטור של רגישות יתר מושהית-Type המאמצת בחולדות

הסמיסנסיביות מסוג מאחר (DTH) היא תגובה דלקתית המתווכת על ידי לימפוציטים T של זיכרון אפקטורי המבטאים CCR7, המסתננים לאתר ההזרקה של...

אני כריסטין ביטון. אני עוזרת מחקר במעבדה של ג'ורג' צ'ן במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה באוניברסיטת קליפורניה באירוויין. ובמהלך הימים הקרובים אדגים לכם את התהליך של השראה ומדידה של DTH אדפטיבי בחולדות לואיס.הליך זה נמשך חמישה ימים, ואני אראה לכם כיצד להפעיל תאי T ספציפיים לאנטיגן, ולאחר יומיים להחדיר אותם ראשונית לחולדות נאיביות. יומיים לאחר מכן, נאתגר את החולדות באוזניים באמצעות האנטיגן שאליו ספציפיים תאי T אלו. יום לאחר מכן, נמדוד את דרגת הדלקת בחולדות אלו.כדי להשיג סרום עבור תרבית הרקמה שלי, עלי להוציא דם. לשם כך אני מבצע דקירה של הלב. אני מניח את האצבע המורה השמאלית על הפלקסוס הסולארי (מקלעת השמש) ומגיע אל הלב דרך הצלעות, בין הצלעות, באמצעות המחט, ואני שואב כמה שיותר דם.וממשיכה אחת, תלוי ביום ובנצילות, אנו יכולים להפיק בין 2 ל-10 mils של דם מחולדה נתונה. והסיבה לכך שאנו זקוקים לסרום בתרבית, היא שברצוננו לגדל תאים שהם תאי חולדה מסוג Louis בתוך סרום סינגנאי. לכן, אלו יהיו סרומים של חולדת Louis.לאחר מכן אני מעביר את הדם למבחנה, אך אני מקפיד להסיר את המחט מהמזרק כדי למנוע המוליזה, כיוון שבכוונתי להשתמש בסרום עבור תרבית הרקמה שלי בשלב מאוחר יותר. כעת אני אסיר את הטימוס, מכיוון שהלב הפסיק להכות והחולדה מתה.ראשית, אני מרסס ב-70% ethanol כדי לוודא שאין פרווה שעפה ומזהמת את האיבר, מכיוון ש

induction-monitoring-adoptive-delayed-type-hypersensitivity

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים את הניקוד אינדוקציה קליני במודל חיה של טרשת נפוצה: כרוני, relapsing Encephalomyelitis אוטואימונית ניסיונית התובע חולדות. המחלה, הנגרמת על ידי חולדות מחסנת עם תחליב המכיל חוט השדרה שלם חולדה adjuvant פרוינד של שלמה, מציג סימנים קליניים דומים מחלות אנושיות.

אינדוקציה ניקוד קליני כרוני, relapsing Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית

סוג של רגישות יתר מאוחרת (DTH) היא תגובה דלקתית בתיווך CCR7-מפעיל לימפוציטים מסוג T זיכרון. כאן אנו מדגימים כיצד לגרום DTH פעיל חולדות לואיס לפקח על התגובה הדלקתית.

אינדוקציה וניטור של רגישות יתר פעילים סוג מושהית (DTH) בחולדות

כאן אנו להדגים שיטה גרימת הקלטה ההתקדמות של הצתה מאוחרת (DTH) סוג רגישות יתר באוזן חולדה. זה ואחריו הפגנה של הכנת רקמות האוזן עכברוש הדמיה שני הפוטונים של התגובה מפעיל T / תא זיכרון.

הדמיה מפעיל T זיכרון תאים באוזן לאחר אינדוקציה של DTH המאמצת

וידאו זה מראה כיצד לגרום hypophysitis אוטואימוניות בעכברים SJL וכיצד להעריך חומרתה ידי histopathology.

אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימוניות הניסויי עכברים SJL

אנו מתארים assay אבחון יקר שעלולים לשמש כדי להחליט הנסיגה של דיכוי חיסוני לאחר השתלה ללא סיכון מוגבר לדחיית שתל. Assay משתמש בעקרונות של רגישות יתר מושהה סוג ומספק הערכה מדויקת של שתי התגובות רכובים על ידי מקבלי חיסון מפעיל ורגולציה הספציפיות תורמות.

Assay רגישות יתר מושהה סוג חוצה vivo להסדרת אנטיגן ספציפי

נתאר כאן שיטות לטיפול קפסאיצין neonatal לזירוז אטופיק דרמטיטיס חולדות, חשיפה של פורמלדהיד מתאדה לחקור את ההשפעות של פורמלדהיד אינהלציה-אטופיק דרמטיטיס.

ההשפעות של חשיפה של פורמלדהיד מודל עכברוש של אטופיק דרמטיטיס המושרה על ידי קפסאיצין Neonatal טיפול

פרוטוקול זה משתמש G6PI פפטידים מעורבים לבנות מודלים דלקת מפרקים שגרונית כי הם קרובים לזו של דלקת מפרקים שגרונית האדם ב CD4+ T תאים ציטוקינים. טוהר גבוהה קבוע הרוצח טבעי תאים T (בעיקר iNKT2) עם פנוטיפים ספציפיים פונקציות הושגו על-ידי בvivo אינדוקציה וטיהור מבחנה עבור חיסוני המאמצת.

חיסוני המאמצת של תאים iNKT ב גלוקוז-6-פוספט איזומראז (G6PI)-הנגרמת עכברים RA

רגישות יתר למגע (CHS) היא מודל ניסיוני של מורין של דרמטיטיס מגע אלרגי (ACD). CHS מבוסס על רגישות עם hapten תגובתי על ידי צביעת העור המגולח של החזה והבטן, עם אתגר עור אוזן לאחר מכן עם hapten מדולל, הגורם לתגובת נפיחות כי הוא מוערך בדרכים שונות.

צור רגישות יתר כמודל מורין של דרמטיטיס מגע אלרגי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול תמציתי ליצירת מודל של חולדות פגות, המאפשר מחקר על ניהול מוקדם של כאב לאחר לידה. השיטה כוללת ביצוע ניתוח קיסרי שלושה ימים לפני הלידה הצפויה, חילוץ גורי חולדות פגים באמצעות כריתת רחם, ושילובם עם צאצאים ביולוגיים של סכר פונדקאית.

מודל חולדות פגות לחקר כאב

פרוטוקול זה מתאר טכניקה אימונופלואורסצנטית צבעונית להערכת מודל החולדה של נזלת אלרגית.

תיוג אימונופלואורסצנטי בחלקי רקמת רירית האף של חולדות נזלת אלרגיות באמצעות בדיקה חיסונית צבעונית

המחקר מדגים את תפקידו של העור בוויסות התגובות החיסוניות בעכברים באמצעות חיסון אפיעורי (EC). חיסון EC עם אנטיגן חלבון יכול לדכא תגובות חיסוניות ברגישות יתר למגע או להפוך דיכוי המושרה על ידי העור בשילוב עם דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן. חיסון EC מראה הבטחה כגישה יעילה ונטולת מחטים לאימונותרפיה.

מודל עכברי של אימונומודולציה המושרה אפיעורית

למדו שיטה לאינדוקציה וניטור של רגישות יתר מושהית-Type מאמצת בחולדות Lewis באמצעות הפעלת תאי זיכרון T אפקטורים ספציפיים לאנטיגן ומדידת דלקת באוזניים.

אינדוקציה וניטור של רגישות יתר מושהית-Type המאמצת בחולדות

גלה סרטונים נוספים