אינדוקציה וניטור של רגישות יתר מושהית-Type המאמצת בחולדות

אני כריסטין ביטון. אני עוזרת מחקר במעבדה של ג'ורג' צ'ן במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה באוניברסיטת קליפורניה באירוויין. ובמהלך הימים הקרובים אדגים לכם את התהליך של השראה ומדידה של DTH אדפטיבי בחולדות לואיס.

הליך זה נמשך חמישה ימים, ואני אראה לכם כיצד להפעיל תאי T ספציפיים לאנטיגן, ולאחר יומיים להחדיר אותם ראשונית לחולדות נאיביות. יומיים לאחר מכן, נאתגר את החולדות באוזניים באמצעות האנטיגן שאליו ספציפיים תאי T אלו. יום לאחר מכן, נמדוד את דרגת הדלקת בחולדות אלו.

כדי להשיג סרום עבור תרבית הרקמה שלי, עלי להוציא דם. לשם כך אני מבצע דקירה של הלב. אני מניח את האצבע המורה השמאלית על הפלקסוס הסולארי (מקלעת השמש) ומגיע אל הלב דרך הצלעות, בין הצלעות, באמצעות המחט, ואני שואב כמה שיותר דם.

וממשיכה אחת, תלוי ביום ובנצילות, אנו יכולים להפיק בין 2 ל-10 mils של דם מחולדה נתונה. והסיבה לכך שאנו זקוקים לסרום בתרבית, היא שברצוננו לגדל תאים שהם תאי חולדה מסוג Louis בתוך סרום סינגנאי. לכן, אלו יהיו סרומים של חולדת Louis.

לאחר מכן אני מעביר את הדם למבחנה, אך אני מקפיד להסיר את המחט מהמזרק כדי למנוע המוליזה, כיוון שבכוונתי להשתמש בסרום עבור תרבית הרקמה שלי בשלב מאוחר יותר. כעת אני אסיר את הטימוס, מכיוון שהלב הפסיק להכות והחולדה מתה.

ראשית, אני מרסס ב-70% ethanol כדי לוודא שאין פרווה שעפה ומזהמת את האיבר, מכיוון שאני זקוק לו עבור תרביות רקמה. אני משתמש במכשירים שעברו אוטוקלאב לביצוע הניתוח. ראשית, אני מסיר את העור.

לאחר שהסרתי את העור, אני חותך בזהירות בכל צד של כלוב הצלעות כדי להבטיח שלא אפגע בתימוס שנמצא ממש מעל הלב. ניתן לראות את התימוס כאן כאיבר חיוור, כמעט לבן, השוכן ממש מעל הלב. אני מסיר אותו, תוךما שאני מוודא שאני לוקח את האיבר כולו, אך אני לא מקפיד יותר מדי להוציא אותו בצורה נקייה כיוון שאנקה אותו מאוחר יותר תחת מ𒈌 זרימה (hood).

ואני פשוט מניח זאת במבחנה המכילה PBS שהעשרתי בפניצילין וסטרפטומייסין. כדי למנוע כל צמיחה בקטריאלית, אני עומד כעת להכין תרחיף של תאים בודדים מהסייט (cyte) שלי. לשם כך, אשתמש במסנן תאים של 70 מיקרון.

וכמובן, אשתמש בציוד סטרילי בלבד. אני מעביר את התימוס לצלחת פטרי. וכפי שניתן לראות, הוא אינו נקי במיוחד.

התימוס הוא האיבר הבהיר, וניתן לראות עליו קשרי לימפה וקרישי דם. לכן, אני אסיר אותם. כמו כן, אני אשים כ-10 mils של PBS מועשר באנטיביוטיקה במסננת התאים שלי, כדי שתהיה מוכנה לקבלת התימוס לאחר ניקויו.

כדי לנקות אותו, אני פשוט מסיר את כל המזהמים מהתימוס שלי. כעת התימוס כמעט נקי לחלוטין, לכן ארים אותו עם הפינצטה ואגזור אותו לחתיכות קטנות בעזרת המספריים מעל מסנן התאים, ואניח את כל חתיכות התימוס הקטנות בתוך מסנן התאים. לאחר שאסיים בכך, אשתמש בבוכנה של מזרק של 1 mL, שהיא כמובן סטרילית, כדי ליצור תרחיף של תאים בודדים על ידי דחיסת חתיכות התימוס דרך מסנן התאים.

התאים הבודדים יעברו ויהיו ב-PBS שלי בחלק החיצוני של מסנן התאים. כעת, לאחר שלחצתי את התאים דרך מסנן התאים, ניתן לראות שה-PBS אינו צלול יותר. הוא מלא בתמיסת התאים הבודדים שלי, אותה אעביר לפרוקת של 50 mil שאשמור על קרח.

אחזור על הפרוצדורה מספר פעמים על ידי מילוי מחדש של מסננת התאים ב-PBS, לחיצה נוספת על בוכנת המזרק והעברה לשפור שלי, עד שיהיו לי בין 30 ל-40 ml של PBS בשפור. כך נראית מסננת התאים לאחר סיום הפעולה. כעת, לאחר שאספתי את כל התאים, אסחר אותם למשך כ-10 דקות ב-1200 RPM.

להלן התאים שהוצאתי מהצנטריפוגה; המשקע גדול למדי, כפי שניתן לצפות לאחר סבב אחד שבו אני מסלק כעת את ה-snet. המשקע, כמובן, עדיין נשאר בתחתית המבחנה. כדי להקל על יצירת הסספנסיון, אני אשבור את ה-PT בעודו כמעט יבש.

ולשם כך אני פשוט מקפיש את זה עם האצבע שלי בעוצמה עד שניתן לראות שה-PT התפרק לחלוטין וחזרנו לסuspended תמיסת תאים בודדים. כעת אני עומד לסספנד מחדש את התאים שלי ב-PBS סטרילי, ואני מוסיף 5 mL של PBS לכל timer. ומכיוון שיש לי רק timer אחד, אני מוסיף 5 mL.

וזו התרחף שאביא למכשיר ההשקיה המקורי. את רמת ההשקיה שאני משתמש בה היא 30 מעלות כדי להבטיח שהתאים עדיין חיים אך ימותו תוך מספר שעות. כך הם עדיין יוכלו לעבד את האנטיגן, אך הם לא יזהמו את התרבית שלי.

אם נבחן את תאי ה-T שאנו מעוניינים להפעיל, נראה שהם אינם נראים בריאים כלל. חלקם החלו למות. הם בעלי צורות מוזרות, והם אינם נצפים יותר.

כעת התאים הללו מוכנים להפעלה. לאחר פרק הזמן שחל, הם למעשה נמצאים בצמא לאנטיגן. חשוב מאוד לשטוף אותם במהירות, מכיוון שחלקם ימותו וישחררו תרכובות רעילות לתוך התמיסה.

אם כן, אני משלים את נפח המבחנה עד 50 ml באמצעות תמיסת PBS. ובמקביל, אני מעביר את תאי ה-T הממתינים לגירוי למבחנה נוספת של 50 ml, כדי שאוכל לסבב (centrifuge) את שתי המבחנות בו-זמנית.

הנה הדם שאספתי לפני זמן קצר; השארתי אותו למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות ואז הנחתי אותו על קרח. וכפי שניתן לראות, הוא קריש באופן מלא. כעת אני זקוק לסרום מתוך הדם הזה.

כדי לאסוף אותו בשלב הראשון, אשתמש בפיפט פסטור סטרילי כדי לשחרר את הקריש מדופן המבחנה, ואסוף את כל הנוזל המכיל את הסרום המבוקש, וכן חלק מהתאים שלא נלכדו בקריש. נוזל זה יועבר למבחנה אחרת; במהלך ההעברה, לעיתים עוברים גם חלקי קריש קטנים, אך הדבר אינו מהווה בעיה כיוון שRegardless ממילא יש להסיר את התאים שעדיין נותרו בנוזל זה.

כעת אבצע סבב צנטריפוגה לשפופרת הקטנה המכילה את הנוזל. פעולה זו תסיר את התאים וכל פיסת קריש שייתכן שתימצא שם. אני הולך לסבב את החלק הנוזלי של הדם כדי להפריד את התאים מהסרום. סבב של שתי דקות יספיק.

כעת, לאחר שהסרום עבר סבב צנטריפוגה, אני אסיר את הסרום מהתאים. זו אינה דוגמה מושלמת כיוון שהסרום אמור להיות צהבהב, ובמקרה זה הוא אדמדם, מה שמעיד על כך שהתרחשה המוליזה. לכן הדוגמה אינה מושלמת לחלוטין, אך בכל מקרה אראה לכם כיצד אני מסנן אותו.

אני משתמש במסנן מזרק עם נקבים של 0.2 micron, ואסנן את הסרום שלי כדי לוודא שהוא סטרילי. אך כיוון שחלה המוליזה, לא אשתמש במנת הסרום הזו עבור הגירוי שלי. אשתמש בסרום של חולדה מסוג Louis שהוקפא במהלך ניסוי קודם.

כאן נמצאים ה-PTs של תאי ה-T משמאל ושל התאים המציגים אנטיגן מימין. כעת אני אסיר את ה-snat משתי המבחנות. וכפי שעשיתי קודם, אני אפרק את המשקעים על ידי תיפוף עם האצבע כדי לוודא שהתאים חזרו למצב של תרחיף תאים בודדים.

אעשה זאת עבור שתי קבוצות התאים, תאי ה-T והתאים המציגים אנטיגן. לאחר מכן, אתלה אותם ואספור אותם. לאחר מכן, אערבב 3 מיליון תאי T עם 150 מיליון תאים מציגי אנטיגן, ואעביר אותם לצלחוני פטרי בקוטר 10 סנטימטר.

ובנפח כולל של 10 mils, לפנינו שתי מבחנות של סרום. זו שמימין היא המבחנה שהכנתי היום, והיא בעלת גוון אדמדם בשל המוליזה, בעוד שמשמאל זוהי מבחנה שהכנתי לפני מספר ימים ושמרתי בהקפאה. היא בעלת גוון צהבהב, ללא המוליזה, והיא במצב הרבה יותר טוב.

זהו המצע שבו אשתמש היום לתרבית הרקמה שלי. יש לי מספיק תאים כדי לעורר שש צלחות פטרי, לכן אעביר 30 mils של מצע לתאי הצגת האנטיגן ו-30 mils מאותו המצע לתאי T. לאחר מכן, למבחנה של תאי הצגת האנטיגן, אוסיף את האנטיגן, שהוא albumin.

תמיסת המלאי שלי היא בריכוז של 1 mg/ml ואני מעוניין בריכוז סופי של 10 µg/ml בצלחות הפטרי. ובתאי ה-T אני אוסיף סרום של חולדה מסוג Louis. אוסיף כמות כזו שבסופו של דבר יהיה לי 1% סרום חולדה בצלחות הפטרי.

אני עומד לבצע הומוגניזציה לתמיסת התאים המציגים אנטיגן שלי, ולאחר מכן אעביר 5 mL של תמיסת תאים זו לכל אחת מצלחות הפטרי שלי. כאשר תוציאו את תמיסת התאים המציגים אנטיגן, תבחינו תמיד בנוכחות של גוש קטן של שומן ורקמה סיבית. זהו מצב נורמלי לחלוטין.

זה מופיע בכל זמני הכנת האתר. אין סיבה לדאגה. לכן אני פשוט מסיר זאת אם אני מצליח, או שאיני עושה דבר ומשאיר זאת בכלי הפטרי.

זה לא משפיע כלל על תרבית התאים שלי. לאחר שאעביר את כל ה-APCs לתוך צלחוני הפטרי, אחזור על הפרוצדורה עם תאי ה-T. לכן, אשים 5 mL של תרחיף תאי T בכל אחד מצלחוני הפטרי הללו.

כעת כל התאים שלי נמצאים בצלחות הפטרי, וחשוב מאוד לערבב אותם היטב כדי שכל תאי ה-T יקבלו הזדמנות להיות במגע עם תא מציג אנטיגן. לשם כך, אני מניחה את צלחות הפטרי על המשטח ואערבב אותן על ידי ביצוע תנועות של שמיניות דמיוניות עם הצלחות. אני חוזרת על הפעולה מספר פעמים כדי לוודא שכל התאים מעורבבים היטב.

לאחר שסיימתי את כל פעולות הערבוב, אכניס את הצלחות לאינקובטור באטמוספירה לחה בטמפרטורה של 37 °C ו-5%CO2. הן יישארו באינקובטור למשך 48 שעות. צבע המצע השתנה מעט, הוא כעת כתום יותר והתאים הופעלו היטב.

כעת אני בודק את כל צלחות הפטרי אחת אחת תחת המיקרוסקופ. התאים הגדולים מאוד הם תאי T מופעלים והתאים הקטנים מאוד הם תאי APC (תאים מציגי אנטיגן) מתים. הגירוי טוב מאוד, שכן ניתן לראות שתאי ה-T ענקיים.

ואם אני מזיזה מעט את פטריית הפטרי, אוי, אתם רואים כאן בצד שמאל, עכשיו זה במרכז, ישנו גוש גדול של תאים ואלו הם תאים המתחלקים באופן פעיל. כעת אני עומדת להעביר את כל התאים למבחנות צנטריפוגה כדי שניתן יהיה להשקיע אותם, לספור אותם, ולאחר מכן להזריק 10 מיליון חולדות. הגירוי היה כל כך יעיל, שאינני זקוקה לכל תאי T הללו להזרקה לחולדה אחת.

א therefore מה שאעשה הוא אשתמש בתאים משתי צלחות פטרי בלבד. אני אסבוב אותם במערכת צנטריפוגה כדי להפריד אותם, אזריק 10 מיליון תאים ואאתר את שאר התאים. אני אכניס אותם לתרבית כדי להקפיא אותם בעוד מספר ימים.

ומצע הגידול הוא מצע גידול רגיל לתאי T, אליו מוסיפים גורם גדילה לתאי T וסרום סוסים. מכיוון שתאי ה-T הם תאים שאינם נצמדים, איני צריך לבצע פעולות רבות. אני רק מוודא שמרבית התאים מועברים יחד עם המצע.

ובסוף, אשטוף את כל צלחות הפטרי עם מצע חדש כדי לוודא שאני מוציא את כל התאים. 10 ml של מצע, אותו מצע שבו השתמשתי עבור הגירוי; אני חושב שבכל צלחת פטרי, אך תאי ה-T כבר יצאו בפעם הראשונה שלקחתי את המצע. כך שבאופן רגיל המצע יוצא מכל צלחת; זה לא הכרחי לחלוטין, אך מכיוון שתאים אלו יקריים, אינני רוצה לאבד אף אחד מהם.

לכן אני עומד לסובב אותם בצנטריפוגה. פעולה זו תסיר חלק מהתאים המתים ותאפשר להתחיל בעיקר עם התאים החיים, ואני רוצה להעניק להם מצע טרי.

כעת אסבוב שוב ב-1,500 RPM למשך כשמונה דקות. אני עדיין משאיר את הבלם פעיל מכיוון שאני רק שוקע את התאים. לאחר מכן, נוריד את שתי הפרועות, ובאחת מהן יש לי משקעים קטנים.

זה מגיע משתי צלחות פטרי. וכאן נמצא המשקע מארבע צלחות פטרי. המשקעים גדולים מכיוון שהם אינם מכילים רק את תאי T הפעילים, אלא מכילים גם את התאים המציגים אנטיגנים.

כעת ארוקן את העל-נוזל (supernatant) ואוסיף לתאים שאותם אזריק מילליטר אחד של מצע, שבו אשתמש להזרקה. את שאר התאים אשעה במאה מיליליטר של מצע תרבית עם גורם גדילה לתאי T וסרום סוס. אלו הם התאים שאזריק.

עבור תאים אלו, אעביר אותם לשני בקבוקוני תרבית (flasks) של 50 ml כל אחד. לכל בקבוקון אוסיף 10% מגורמי גדילה לתאי T, המופקים מעצם. כמו כן, אוסיף 10% סרום סוסים שעבר הפעלה תרמית.

כעת אוסיף את רוב המדיום הדרוש. אני לא מעביר את התמיסה הלוך ושוב בפיפטה מכיוון שתאי T אינם עומדים לפיפוט מרובה. לכן, אני מעביר בפיפטה רק את הכמויות המינימליות שהן בהחלט נחוצות, ואז אני משלימה את הכמות והם מוכנים.

הם מוכנים להכנסה לאינקובטור, אני בודקת אותם מדי יום. אני כנראה אצטרך לחלק אותם לאחר 24 שעות, אם לא אחרי 40, ובטוח אחרי 48 שעות. אך אבדוק אותם מדי יום.

הם נוטים לגדול במהירות רבה בנוכחות T-cell growth factor. לכן, יש לבצע להם דילול לפחות מדי 48 שעות, ואולי אף מוקדם יותר. אני אבדוק גם את צבעו של מצע הגידול.

כעת הם הופעלו, כך שהם מופעלים באופן מלא. זהו הזמן הטוב ביותר להזריק אותם לחולדה. ובעוד יומיים נבצע את אתגר החיסון באוזן של החולדה.

אם נחכה מספר ימים עד שהתאים יחזרו למצב מנוחה, הם ירצו לשוב במהירות לאתר הדלקת. לכן, כעת אכניס אותם לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5%CO2, ואשתמש במחט במידה 25 gauge כדי להזריק אותם לחולדה. כעת, לאחר שהתאים הוזרקו בתוך החולדה, אשאיר אותה כאן ואבצע את האתגר באוזניים בעוד 48 שעות.

לפני מספר ימים הזרקתי תאי T ספציפיים לאלבומין המסומנים ב-GFP לחולדה. והיום אני עומד לבצע אתגר לאותה חולדה באוזן. באוזן ימין אני עומד להזריק אלבומין.

ובאוזן השמאלית אני פשוט מזריק PBS. המנה של volin שאני מזריקה היא 20 micrograms ב-20 microliter. והאלבומין שבו אני משתמשת הוא תערובת של אחד לאחד של אלבומין המסומן ב-Texas red ואלבומין לא מסומן.

זהו השירותים שבהם אדגים לכם כיצד אבצע את ההזרקה. מכיוון שאני ימני, השתמשתי ביד שמאל; הסרתי את הכפפה כדי שאוכל להציב אצבע אחת מתחת לאוזן ואת השנייה מעליה כדי למתוח את העור, כך שאוכל לראות בדיוק היכן אני נמצא עם המחט ולהיכנס בין שתי שכבות העור באזור זה, שהוא דק מאוד.

לשם כך, אני משתמש במחטים בקוטר 27 gauge כדי להחדיר רכיב דק מאוד. אם אני הופך את האוזן, ניתן לראות בבירור לאן חדר ה-Texas red ולאן חדר ה-PBS. אנו נמצאים כעת 42 שעות לאחר ההדבקה באוזן, ואני אשתמש במיקרומטר עם קפיץ כדי למדוד את עובי האוזן.

לכן, אני אמדוד את שתי האוזניים: האוזן הימנית שחשפה לאלבומין והאוזן השמאלית שלא נחשפה. ההבדל בעובי האוזן ייתן לנו מושג לגבי עוצמת הדלקת. כך אם כן, הצגתי בפניכם כאן את הפרוצדורה המלאה לביצוע DTH אדפטיבית בחולדות.

הראיתי לכם כיצד להפעיל תאי T ספציפיים לאנטיגן in vitro, כיצד להעביר אותם באופן אדופטיבי לתוך חולדות, ולאחר מכן כיצד לחשוף את החולדות הללו למאתגן ולמדוד את מידת הדלקת. במעבדת Chand אנו משתמשים בהליך זה באופן שגרתי כדי לבחון את ההשפעה של חוסמי תעלות אשלגן על הדלקת בחולדות.