Name: והעשרה של תאים NK מ דם אדם עם קיט RosetteSep מ StemCell טכנולוגיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: למד שיטת בידוד תאי NK מדם אדם באמצעות ערכת RosetteSep של StemCell Technologies. שיטת הבחירה השלילית מבטיחה טוהר גבוה ושמירה על חיוניות התאים למחקר אימונולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרוטוקול מפורט נכלל עם כל קוקטייל בידוד רוזט ספטמבר זמינה באופן מקוון באתר StemCell טכנולוגיות 1.

<ol><li>Procedures and instruction manuals. , 
	
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx">http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx</a> Forthcoming.</li>
</ol>

תאים בודדים באמצעות טכניקה זו ניתן להפריד נוספת לתוך אוכלוסיות שונות באמצעות אחרים הפרדה ערכות התא.

PBS בתוספת FCS 2% ופתרונות Histopaque יש להביא לטמפרטורת החדר לפני תחילת ההליך.

והעשרה של תאים nk מ דם אדם עם קיט rosettesep מ stemcell טכנולוגיות

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

טבעיים (NK) תאים הרוצח גדולים לימפוציטים ציטוטוקסיים פרטנית ששייכים למערכת החיסון המולדת לשחק תפקידים מרכזיים בלחימה נגד סרטן וזיהומים, אך גם הם מעורבים בשלבים המוקדמים של ההריון דחייה. תאים אלה נמצאים דם היקפיים, שממנו הם יכולים להיות מבודדים. תאים יכולים להיות מבודדים באמצעות מבחר חיובי או שלילי. עבור סלקציה חיובית אנו משתמשים נוגדנים להפנות סמן משטח הנוכחית רק על תאים של עניין ואילו סלקציה שלילית אנו משתמשים קוקטיילים של נוגדנים ממוקד סמנים על פני ההווה כל התאים אך בתאים של עניין. טכניקה זו האחרונה מציגה את היתרון של השארת תאים הריבית ללא נוגדנים, ובכך להפחית את הסיכון של הפעלת התא differenciation לא רצויות או. בפרוטוקול-video זה אנו מדגימים כיצד להפריד תאים NK מהדם האנושי על ידי סלקציה שלילית, באמצעות ערכת RosetteSep מ StemCell טכנולוגיות. ההליך כרוך בהשגת דם היקפיים האנושי (בבדיקה מוסדי לוח אושר פרוטוקול להגן על בבני אדם) ואת לערבב אותו עם קוקטייל של נוגדנים אשר נקלטות על ידי סמנים נעדר על תאים NK, אבל ההווה על כל התאים האחרים mononuclear נוכח היקפי הדם (למשל, לימפוציטים מסוג T, מונוציטים ...). נוגדנים הנמצאים קוקטייל הם מצומדות כדי נוגדנים להפנות glycophorin אריתרוציטים על. כל התאים הלא רצויים כדוריות דם אדומות ולכן יהיה להיות לכוד בתוך מתחמי. תערובת של קוקטייל דם נוגדן הוא מדולל אז, overlayed על שיפוע Histopaque ו centrifuged. בתאי NK (&gt; 80% טהור) ניתן לאסוף בממשק שבין Histopaque לבין פלזמה מדולל. קוקטיילים דומים זמינים העשרה של אוכלוסיות תאים אחרים, כמו האדם לימפוציטים מסוג T.

תאים הרוצח טבעי הם אוכלוסייה קטנה של לימפוציטים. כאן אנו מראים כיצד לבודד תאים אלה מהדם האנושי על ידי סלקציה שלילית, באמצעות ערכת מן StemCell טכנולוגיות. התאים המתקבלים הם קיימא ללא פגע על ידי נוגדנים, ולכן מוכן לשמש במשך מספר הליכים.

והעשרה של תאים NK מ דם אדם עם קיט RosetteSep מ StemCell טכנולוגיות

תאי הורג טבעי (NK) הם לימפוציטים ציטוטוקסיים גרנולריים גדולים השייכים למערכת החיסון המולדת וממלאים תפקידים מרכזיים במלחמה נגד סרטן ...

שלום, אני כריסטין ביטון. אני עוזרת מחקר במעבדה של ג'ורג' ץ'ן במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה באוניברסיטת קליפורניה באירוויין. והיום אראה לכם כיצד לבצע ברירה שלילית של תאי NK (natural killer cells) מדם אנושי באמצעות ערכות הקוקטייל של Stem Cell Technologies.הסיבה שבגינה אנו משתמשים בערכה זו של stem cell technologies היא שהיא מעניקה לנו רמת טוהר גבוהה מאוד של תאים, והסלקציה השלילית מאפשרת לנו לקבל תאים שלא נקשרו לנוגדן. כך ניתן למנוע התרחשויות בלתי צפויות בתאים אלו. אופן הפעולה של ערכת ה-tsep הוא שקיימים נוגדים אשר נקשרים לכל התאים בדם שאינם מעניינינו.במקרה שלי, ישנם תאי T, תאי B, מונוציטים, ואז ישנם נוגדנים שייקשרו לגליקופורין A בתאי דם אדומים; מה שהם עשו זה לקשר נוגדן אחד נגד תא דם לבן לנוגדן נגד תא דם אדום. לכן, מה שיקרה הוא שייווצר קומפלקס המורכב מתא דם לבן אחד לא רצוי עם מספר תאי דם אדומים, ומכיוון שתאי דם אדומים הם בעלי צפיפות גבוהה יותר מתאי דם לבנים, ברגע שתניחו את התערובת המעורבבת המכילה דם ואת הנוגדנים שלכם על גראדיאנט ותסובבו אותה (ספינטציה), תאי הדם האדומים ישקעו לתחתית המבחנה ויגררו איתם את כל תאי הדם הלבנים שאינכם רוצים. כך, בחלק העליון של הגראדיאנט, אתם תאספו את תאי NK (תאי קטלנים טבעיים) טהורים או כמעט טהורים, שלא נקשרו כלל לנוגדן.נתחיל כעת בבידוד תאי NK מתוך מבחנה של דם אנושי. זהו דם שנגב זה עתה למבחנה עם נתרק-הפרין (sodium heparin). אשתמש בתערובת העשרה לתאי NK אנושיים (RosetteSep human NK Cell enrichment cocktail) כמעבר גרדיאנט.בהמשך הניסוי אשתמש ב-10 77 histo pack, שצפיפותו היא 1.077, כמו כן הכנתי בקבוק של PBS מועשר ב-2% fetal calf seven. אני מוודא שרכיבים אלו מגיעים לטמפרטורת החדר לפני השימוש, מכיוון שאני מאחסן אותם במקרר. כעת אקח את כל שפופרת הדם ואעביר אותה לשפופרת fcan של 50 mil.מכיוון שמדובר במכל ואקום, ישנו ואקום בפנים כדי שניתן יהיה לפתוח אותו ללא התזה; אני מאתר את החריץ הקטן במכסה ומסיר אותו בזהירות כדי לאפשר לאוויר להיכנס למבחנה. ברגע שהוואקום במבחנה נשבר, אני יכול להוציא את המכסה בקלות רבה יותר, ואז, באמצעות פיפט של 10 ml, אשאב את כל תוכן מבחנת הדם. אני מצפה שיהיו שם כ-10 ml של דם.כאן יש לי 9.5 µL של דם, ואני עומד להעביר את כל 9.5 µL הללו לפרועת פלקון של 50 mL. לאחר מכן, את הפלסטיקה (pipette) עם הדם מעבירים ישירות לשקית הפסולת הביולוגית; למבחנה אני תמיד מוסיף מעט תמיסת הלבנה, סוגר אותה ואז שם אותה בשקית הפסולת הביולוגית. כך נראה הדם לפני הוספת תערובת הנוגדנים.כעת אוסיף את תמיסת הנוגדנים (antibody cocktail) לדם. מכיוון שיש לי כ-9.5 mil של דם ועלי להוסיף 50 µL של התמיסה לכל mil של דם, אוסיף 450 µL של התמיסה לדם. לאחר מכן אערבב בעדינות, וכמעט באופן מיידי תראו את תגובת הצביעה (ting) קורית. כפי שניתן לראות כעת, רואים את ה-ting.כעת מתרחשת הדליפה ההדדית (cross leaking) בין תאי הדם הלבנים הבלתי רצויים לבין תאי הדם האדומים. אני אכוון טיימר ל-20 דקות ואשאיר את המבחנה כך בתוך המנדף למשך 20 דקות. הדם דגר כעת במשך 20 דקות עם תערובת ה-rosette sub cocktail.אדלל זאת ביחס של אחד לאחד עם PBS בתוספת סרום מעגל עגל. את התערובת הזו אעביר מעל שתי מבחנות של 15 מ"ל מסוג histo pack 10 77. לאחר מכן, אסובב את המבחנה בצנטריפוגה למשך 20 דקות.יש לי כ-10 µL של דם בתוספת תערובת נוגדנים. לכן, אני אוסיף 10 µL של PBS המכיל 2% fetal cal serum. זוהי דילול של אחד לאחד.אערבב בעדינות מכיוון שכפי שניתן לראות, כאשר אני מוסיף את ה-PBS לדם, הם אינם מתערבבים באופן מיידי. לכן, אני פשוט מערבב בעדינות. כעת יש לי תערובת ביחס של אחד ለአחד של PBS עם דם, וזה מה שאוסיף ל-15 mils של histo pack.אני עומד להוסיף את השכבה בזהירות כדי למנוע ערבוב של הדם עם ה-histo pack. לכן, במקום להשתמש בפיפט של 25 µL שיישאב את כל הדם, אשתמש בפיפט של 10 µL ואבצע זאת במספר שלבים. כדי להוסיף את השכבה בקלות, אני מחזיק את מבחנת ה-histo pack כמעט במצב אופקי.אני עומד להטיל מעט דם על הפיה ולהוריד אותה אל ה-histo pack. לאחר מכן, אשכבה את הדם באיטיות רבה על ה-histo pack. ברגע שתיווצר שכבה טובה של דם, אוכל להתחיל להטיל את הנוזל במהירות גבוהה יותר ולהחזיר לאט את הפיה למצב אנכי.כעת כיסיתי את כל 20 mils של תערובת הדם עם קוקטייל הנוגדנים ו-PBS מעל 15 mils של histo pack. ואם ניתן לראות בחיבור של המבחנה, מתחילים להופיע לאט אגרגטים קטנים של תאי דם אדומים השוקעים באיטיות אל תוך הגרדיאנט, ואנו נבצע סנטריפוגה פשוט כדי להאיץ את התהליך. כך, תוך 20 דקות, כל תאי הדם האדומים יהיו בתחתית המבחנה.ישנה נקודה אחת חשובה מאוד בעת ביצוע סבב צנטריפוגה (gt), יש לכבות את הבלם מכיוון שבלימה מהירה מדי עלולה להפריע למרכיבים שלכם. לכן, אנו תמיד מכבים את הבלם, ולאחר מכן אשלח את ה-son RI ל-20 דקות ואניתן לו לבצע את עבודתו. המרכיב עבר כעת סבב של 20 דקות.כעת יש לנו את שכבות התאים השונות. נתחיל כאן בתחתית המבחנה. כאן נמצאים כל כדוריות הדם האדומות והתאים שאינם מעניינים אותנו.מעליה ישנה שכבה ברורה של גרדיאנט, ומעליה שכבה צהבהבה של פלסמה. והתאים שמעניינים אותנו, תאי ה-NK, הם השכבה הלבנה והדקה של תאים הנמצאת בין שכבת הגרדיאנט לשכבת הפלסמה.כמובן ששכבה זו דקה מאוד, מכיוון שתאי NK מהווים רק מיעוט מתאי הדם. כעת אסיר את שכבת תאי ה-NK באמצעות פיפט פסטור סטרילית. שכבה זו אעביר למבחנת Falcon ריקה חדשה בנפח 50 mil.אני ניגש לשכבה ושואב אותה החוצה. כמובן, ישנם תאים מעטים מאוד. כאשר יש הרבה תאים, ניתן להוציא את השכבה בצורה נקייה מאוד, בעוד שכשיש תאים מעטים כל כך זה פחות פשוט.וכפי שמומלץ בהנחיות היצרן, הם ממליצים לשאוב חלק מהגרדיאנט יחד עם התאים כדי למנוע את אובדנם. לכן, אני שואב כל עוד אני רואה תאים שם. לאחר ששבתם את כל התאים, אתם אמורים לראות ניגוד חד בין הרכיב השקוף לבין הפלזמה הצהבהבה.אני מאמין שהוצאתי כעת את כל התאים שלי. אם תסתכלו על המדרג, לא ניתן לראות דבר לבן ומטושטש בממשק שבין ה-histo pack לפלזמה. כעת הסרתי את כל תאי ה-NK שראיתי במדרג, העברתי אותם לשפרוור Falcon של 50 mil חדש, והוספתי מיד לשפרוור PBS בתוספת 2% fetal calf serum.לכן מלאתי עד לנפח של 50 mil ואני עומד לצנטריפוג את התאים כדי לשקיע אותם. זה יהיה השטיפה הראשונה. ואני אחזור על הפרוצדורה פעם שנייה כדי לשטוף את התאים, לסך הכל פעמיים.לאחר מכן, התאים יהיו מוכנים לכל פרוצדורה שתבחרו לבצע, בין אם מדובר בהעברה לתרבית או בשימוש לצביעה עבור flow cytometry. אתם אמורים לקבל טוהר של לפחות 80% של תאי NK, ואולי אף יותר. השגתי טוהר של עד 98% באמצעות פרוצדורה זו.כך שהצגתי בפניכם היום טכניקה מהירה ואמינה מאוד לבדיקת תאי NK (Natural Killer) מדם אנושי באמצעות ערכות ה-TS של Stem Cell Technologies. וכמובן, אם ברצונכם לבודד סוגי תאים אחרים מבני אדם, חולדות או עכברים, תוכלו להשתמש בכל אחת מערכות בידוד התאים של החברה. קיימות ערכות עבור תאי T, תאי B, ואפילו עבור תתי-סוגים של תאי T, למשל.

enrichment-nk-cells-from-human-blood-with-rosettesep-kit-from

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים שיטה יעילה להרחיב ולטהר מספר גדול של תאים NK האדם להעריך את תפקידם.

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

סרטון זה מדגים את השיטה לניתוח מטבוליזם אנרגיה בתאי NK אנושיים פעילים באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי. מעכבים שונים של מכלולי שרשרת הובלת האלקטרונים משפיעים על סינתזת ATP, הנמדדת באמצעות קצב צריכת החמצן או OCR, ומספקים תובנות לגבי חילוף החומרים התאי והביו-אנרגטיקה.

ניטור בזמן אמת של מטבוליזם אנרגיה בתאי NK אנושיים באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח, הרחבה, ובתחום ההדמיה vivo של תאי NK הנגזרים מhESCs וiPSCs.

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

שיטה פשוטה ואמינה מתוארת כאן כדי לנתח קבוצה של פונקציות תא NK כגון degranulation, ציטוקינים וייצור chemokine בתוך תת תא NK שונה.

Flow Cytometry מבוסס Assay עבור הניטור של פונקציות תא NK

מטרת מחקר זה הייתה לגבש טכנולוגיות המאפשרות התמרה חושית מוצלחת גנים בתאים ראשי טבעי רוצח (NK). בתיווך לתוספי התמרה חושית lentiviral של האדם או העכבר הראשי NK תאים תוצאות יעילות גבוהה יותר של ביטוי ג'ין. שיטה זו של ג'ין התמרה חושית ישפר במידה רבה מניפולציה גנטית של תאי NK.

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

שיטה מבוססת cytometry זרימה כדי לקבוע באופן כמותי את הפעילות ציטוטוקסיות של תאים אנושיים של הרוצח הטבעי מוצגים כאן.

וזמינותו Cytotoxicity מבוססי Cytometry זרימה להערכה של פעילות תאי NK אנושי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בייצור המוני של ג'ין להחרשת תאי NK מאתר באמצעות מערכת בידול נטולת מזין עבור המחקר מכניסטית חוץ גופית בתוך ו ויוו.

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

פרוטוקול לחקר אירועים המונעים על ידי FcγRIIIa על ידי נוגדנים טיפוליים בתאי הרג טבעיים אנושיים מתואר כאן. פלטפורמת גירוי מלאכותית זו מאפשרת חקירה של פונקציות אפקט במורד הזרם כגון degranulation, ייצור chemokine / ציטוקינים, ומסלולי איתות בתיווך FcγRIIIa וחלקי Fc של נוגדנים המעורבים בכריכה.

הערכה של אירועי תאי רוצח טבעי אנושי המונעים על ידי מעורבות FcγRIIIa בנוכחות נוגדנים טיפוליים

הפרוטוקול הנוכחי מראה כיצד להבדיל בין תאי CD3−/CD45+CD56+ עם ציטוטוקסיות קלה מתאי גזע פוטנציאליים מורחבים אנושיים (hEPSCs) בתנאי תרבית תלת-ממדית ודו-ממדית. זה מאפשר אימות פנוטיפי שגרתי ללא הרס של microenvironment מורכב.

יצירת תאי הרג טבעיים מתאי גזע פוטנציאליים מורחבים אנושיים

כאן, אנו מציגים שיטה להבדיל ולהרחיב תאי הרג טבעיים המבטאים קולטן אנטיגן כימרי (CAR) אנושי שמקורו ב-iPSC עם הרג משופר כנגד ממאירויות שונות. פרוטוקול זה מדגים את ההתמיינות וההרחבה של תאי CAR-NK שמקורם ב-iPSC אופטימליים של הרג טבעי (NK) ומדידת פעילות אנטי-גידולית כנגד קווי תאי גידול שונים.

התקדמות בתאי הרג טבעיים המבטאים קולטני אנטיגן כימריים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

למד שיטת בידוד תאי NK מדם אדם באמצעות ערכת RosetteSep של StemCell Technologies. שיטת הבחירה השלילית מבטיחה טוהר גבוה ושמירה על חיוניות התאים למחקר אימונולוגי.

והעשרה של תאים NK מ דם אדם עם קיט RosetteSep מ StemCell טכנולוגיות

גלה סרטונים נוספים