Name: מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: למד מיפוי אופטי של פוטנציאל פעולה וסידן תוך-תאי בלב עכבר מבודד בפרפוזיה לנגנדורף. שיטה זו מספקת רזולוציה מרחבית גבוהה לחקר אלקטרופיזיולוגיה לבבית ומנגנוני הפרעות קצב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NIH מענקים R01 HL085369.

1. הכנה מתקדמים של פתרונות מניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני פתרונות המניות של הפתרון של Tyrode (16x) מראש במים deionized ולאחסן אותם ב 4 ° C: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במלאי אני (119.872 g / L NaCl, 3.056 גרם / L CaCl 2 (2H 2 O), 5.6 גרם / L KCl, 2.6274 גרם / L לאא 2 PO 4, 3.408 גרם / L MgCl 2 (6 שעות 2 O), (פישר מדעי הדשא, היריד, NJ)); </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במלאי II (26.88 g / L NaHCO3 (פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג'רזי)). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות המניות של צבעי ניאון. כדי למנוע קפיאה חוזרות הפשרה, אנו מאחסנים aliquots 30 μl של שני צבעים ב -20 ° C, שהיא די בניסוי אחד: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתח רגיש לצבוע RH237 (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) פתרון מניות, 1.25 מ"ג / מ"ל ​​פתרון sulfoxide דימתיל (DMSO, Sigma, סנט לואיס, מיזורי); </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אינדיקטור סידן Rhod-02:00 (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) פתרון המניות, 1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון DMSO. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עירור-התכווצות blebbistatin uncoupler פתרון מניות (Tocris Bioscience, סנט לואיס, מיזורי, 2 מ"ג / מ"ל ​​פתרון DMSO) מראש ולאחסן את blebbistatin מומס ב 4 ° C. </li></ol> 2. הכינו פתרונות זלוף וההתקנה ניסיוני 7 <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין פתרון Tyrode של 2L (128.2mM NaCl, 1.3mM CaCl 2 (2H 2 O), 4.7mM KCl, 1.05mM MgCl 2 (6 שעות 2 O), 1.19mM לאא 2 PO 4, NaHCO 3 20mm, 11.1mM D-גלוקוז ב-pH deionized מים = 7.35 ± 0.05). אם הפתרון המניות נמצא בשימוש כדי להפוך 2L של הפתרון של Tyrode (די בניסוי אחד) לקחת 1750 מ"ל מים ומערבבים deionized ו 125 מ"ל של צילומים אני, 125 מ"ל של מלאי השנייה, 4 גרם של גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את שתי משאבות של מערכות טפטוף. הגדר את המשאבה peristaltic (Peri-Star, WPI, Sarasota, ארה"ב) המשמש זלוף מדרדר עד 40 mL / min. הגדר את המשאבה peristaltic אחרים (קול, בן הזוג Masterflex Peristalic L / S, משאבת קול, בן הזוג Instrument החברה, ורנון הילס, אילינוי) המשמש superfusion וכדי להחזיר את perfusate חזרה המאגר מחזיק עד 80 mL / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את מערכת זלוף עם אתנול 70% למשך 30 דקות ולאחר מכן עם מים deionized 2L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל המים deionized הוא פונה מהאולם, להפיץ פתרון של Tyrode ולהעביר אותו דרך פילטר של 5 מיקרומטר (Millipore, Billerica, מסצ'וסטס, ארה"ב). חם perfusate כדי 37 מעלות צלזיוס עם ז'קט מים circulator (ThermoNESLAB EX7, ניוטאון, ארה"ב) perfusate חמצן על ידי מבעבע O 2 / CO 2 (95% / 5%) גז לתוך התמיסה. צג ה-pH של התמיסה עם מד pH (Oakton מכשירים, ורנון הילס, IL) ולהתאים את שיעור O 2 / CO 2 מבעבע כדי לשמור על pH על 7.35 ± 0.05. המשך ניטור pH וטמפרטורה במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנגנון כפול מיפוי אופטי מורכב משני MiCAM Ultima-L-CMOS מצלמות (SciMedia, בקוסטה מסה, קליפורניה), כי יש מרחבית גבוהה (100x100 פיקסלים, 230 ± 20 מיקרומטר לפיקסל) ואת הפתרון הזמני (1,000-3,000 מסגרות / sec). תקן להקת עוברים סינון (590 ± 15 ננומטר, Thorlabs, ניוטון, NJ) מול המצלמה מיועדת הדמיה סידן, בעוד, ארוך לעבור סינון (&gt; 700 ננומטר, Thorlabs, ניוטון, NJ) צריך להיות ממוקם מול המצלמה מיועדת הדמיה מתח. מצלמות מסודרים בניצב אחד לשני על ידי בעל, אשר מכיל מראה dichroic (635 הפסקת ננומטר, אומגה אופטי, Brattleboro, VT). מיד מתחת מחזיק את המצלמה כפול יש עדשה (ניקון עדשת 55 מ"מ 1:1.4 235,052), אשר מתמקדת את האור פליטה מגיע מלב אל המראה dichroic. המרחק העבודה היא 3 ס"מ בערך. האור מופק על ידי עירור מנורת הלוגן (Newport אוריאל מכשירים, סטרטפורד, CT, SciMedia, בקוסטה מסה, קליפורניה), והוא עבר דרך פילטר חום, תריס, ואת הלהקה לעבור סינון (520 ± 45 ננומטר). מדריך אור גמיש שמכוון את האור הלהקה לעבור סינון על הכנה, ואת תריס משמש כדי להבטיח הכנה הוא נחשף לאור רק במהלך רכישת התמונה להימנע photobleaching של צבעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Ag / AgCl 2 אלקטרודות עבור לצעוד חישה מראש ולהתקין אותם בחדר לפני הצבת לב. ודא מגברים ומסננים מותאמים לרמות המתאימות. </li></ol> 3. קציר הלב העכבר, cannulate, ולהקים זלוף Langendorff <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם קטמין / xylazine (ketamin, 80mg/kg משקל גוף; xylazine, 10 מ"ג / ק"ג משקל גוף) וכן הפרין (100 יחידות) על ידי הזרקת intraperitoneal. להבטיח רמה נאותה של הרדמה על ידי היעדר רפלקס הכאב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חתך באמצע sternal, להסיר במהירות את הלב לשטוף אותו מחומצן (95% O 2, 5% CO 2), טמפרטורה קבועה, (37 ± 1 ° C) הפתרון של Tyrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לזהות במהירות את אבי העורקים, לגרום חתך נקי לאורך האאורטה עולה מתחת העורק subclavian הנכון. קטע קצר של האאורטה מחוברת אז מנהג עשה 21-מד צינורית עם טיפ מתרחבים. תפר 4-0 שחור קלוע משי (תאגיד Specialties כירורגי, קריאה, הרשות הפלסטינית) משמש כדי לתקן את הלב על הצינורית. לאחר cannulation, הלב perfused retrogradely ו superfused עם הפתרון של Tyrode. שיעור זלוף מדרדר מותאם בטווח של 2-5 mL / min כדי לשמור על הלחץ אאורטלי בין 60 ל 80 מ"מ כספית (מתמר לחץ, העולם דיוק מכשירים Inc (WPI), Sarasota, ארה"ב; גשר מגבר TBM4M, WPI, סרסוטה, ארה"ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר cannulated הלב, הריאות, בלוטת התימוס, ורקמת השומן גזור אז הוסרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלב מבודד הוא ניצח (כלים המדע פיין) בפסגת לחלק התחתון של החדר זלוף (מצופה Sylgard) כדי למנוע הזרם המושרה התנועה. הנספחים פרוזדורים ימין ועל שמאל נמתחים גם והצמיד (כלים המדע פיין, Inc, פוסטר סיטי, קליפורניה) לחלק התחתון של החדר, אשר מספק שטח מקסימלי עבור מדידות אופטיות של אטריה. חשוב מאוד! צינורית סיליקון קטנה מוכנס לתוך החדר השמאלי דרך הוורידים ריאתי קבוע על ידי תפר משי ורקמות החיבור הסמוך. זה מונע גודש פתרון החמצה של perfusate לכודים החדר השמאלי, אשר חשוב במיוחד לאחר דיכוי של התכווצויות חדרית עם uncoupler עירור, התכווצות (ראה שלב 4 חלק 19). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודה בהתאמה אישית ממוקם על פני השטח של הלב לנהל את הגירויים צעדה, אשר מופק על ידי Master-8 (AMP מכשירים בע"מ, ירושלים) או PowerLab 26T (AD מכשירים, סידני, אוסטרליה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכוכית לכסות קטן הוא קבוע על פני השטח של הפתרון על הלב כדי להפחית חפץ תנועה מפתרון רוטט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס אור עירור על הלב. בנוסף, להתאים את המרחק בין מנגנון המצלמה כפול ואת הלב, כך הרזולוציה המקסימלית יושג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבו כל האורות בחדר להתחיל הקלטות חשמל באמצעות PowerLab 26T. </li></ol> 4. טען מתח צבעים סידן רגיש עירור-התכווצות uncoupler <ol start="19" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחממות של 0.6 מ"ל blebbistatin. מערבבים 0.5 מ"ל של blebbistatin עם perfusate במאגר מחזיק. לדלל את הנותרים 0.1 מ"ל של blebbistatin ב 1 מ"ל של הפתרון של Tyrode לאט להזריק אותו (במשך 20 דקות) דרך יציאת תרופה ממוקם ליד הצינורית. שימו לב כמו blebbistatin בהדרגה מפחיתה את חפץ בתנועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל 30 μL של מתח פתרון המניות רגיש RH237 צבע בתמיסה של 1 מ"ל Tyrode לאט להזריק מעל 5-7 דקות ליציאת זריקה כמו blebbistatin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 μL אינדיקטור סידן Rhod-02:00 היא 01:01 מעורבב עם Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, פתרון של 20% DMSO) ולאחר מכן בתמיסה מדוללת 1 מ"ל של Tyrode ויישומי לאט דרך נמל הזרקה אותו במשך 5-10 דקות . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן 5-10 דקות עבור blebbistatin וצבעים להגיע קרום התא cytosol. המשך הפרוטוקול כאשר תנועה מדוכאת לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח באופן רציף הקלטות א.ק.ג. על ההליך כולו כדי להבטיח תפקוד תקין חשמלית של הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל הקלטות אות ניאון באמצעות אישית SciMedia תוכנה (SciMedia, בקוסטה מסה, קליפורניה). </li></ol> 5. נציג התוצאות: <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. התקנה ניסיונית עבור זלוף, הקלטות חשמל מיפוי אופטי. EM = פליטת; Lp = longpass <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. הכנה ניסויית דוגמאות אות שנרשמו במהלך צעדה חדרית. משמאל: אותות א.ק.ג. נאספים Ag / AgCl 2 אלקטרודות דיסק (למעלה) ו דוגמה פרוטוקול S1S1 גירוי מוצג (התחתונה). במרכז: לב Langendorff הכנה העכבר. מימין: נציגת פוטנציאל פעולה אותות אופטיים סידן חולפת מן הפרוזדורים (למעלה) ואת החדרים (התחתון) מוצגים. חץ צהוב (למעלה) מצביע על פיזור האות ניאון בא החדרים, אשר ראו את הקלטות פרוזדורים. LV = החדר השמאלי, RV = החדר הימני; LA = שמאל אטריום; RA = ימין אטריום <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. הקלטות אופטי נציג V מ 'החתול החדרים של הלב סוג בר העכבר. א הכנה ניסיוני עם מערך של מיקומים מחולקת באופן שווה מסומן על ידי נקודות שחורות אשר הקלטות אופטי ניתן לראות (C). דוגמה ב 'מעקב של V מ' חתול ממיקום מרכזי במערך (ראו מסגרת in (ג)). ג V מ '(כחול) CAT (אדום) של מערך של מיקומים מחולקת באופן שווה. איתותי היו זרקת לפח 3x3. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. המפה הפעלה הולכה. א ההפעלה למשל מפה לב פראי סוג עכבר עם רוחבי (T) ו אורכית (L) הכיוונים מסומנים על ידי חצים לבנים. ב V אותות מ '(למעלה) ו DV / dt (התחתון) המתאים שלוש נקודות לראות (T1, T2, T3, L1, L2, L3). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3275/3275fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. פוטנציאל פעולה וניתוח חולף משך סידן. א משך פעולה פוטנציאליים repolarization 80% (APD80) ומשך סידן חולפת על רגיעה 80% (CaD80) המפות מוצגות מלב בתנאים השליטה (משמאל) לאחר יישום 30 nM isoproterenol (מימין). צבע צהוב / ירוק החדרים (ימין) מציין isoproterenol מקוצר APD80 ו CaD80. דוגמה ב 'העתקים של APD80 ו CaD80 מהעכבר החדרים בר סוג (למעלה) ו - אטריה (התחתונה).

<ol><li>Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+maps+of+intracellular+%5BCa2%2B%5Di+transients+and+action-potentials+from+the+surface+of+perfused+guinea-pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts.</a> Circulation. 90, 1-1 (1994).</li>
<li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+repolarization+and+refractoriness+from+intact+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of repolarization and refractoriness from intact hearts.</a> Circulation. 90, 1469-1480 (1994).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> J Physiol. 529, 171-188 (2000).</li>
<li>Pruvot, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+calcium+cycling+versus+restitution+in+the+mechanism+of+repolarization+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Role of calcium cycling versus restitution in the mechanism of repolarization alternans.</a> Circ Res. 94, 1083-1090 (2004).</li>
<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95, 21-33 (2004).</li>
<li>Fast, V. G. Recording action potential using voltage sensitive dyes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFast%2C+VG+%22Practical+methods+in+cardiovascular+research%22">Practical methods in cardiovascular research</a>. Dhein, S., Delmoar, M. , Springer. New York. 233-255 (2005).</li>
<li>Glukhov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+K%28ATP%29+channel+pharmacology+in+intact+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. , (2009).</li>
<li>Baker, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dispersion+of+repolarization+and+refractoriness+in+transgenic+mouse+hearts+promotes+reentrant+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced dispersion of repolarization and refractoriness in transgenic mouse hearts promotes reentrant ventricular tachycardia.</a> Circ Res. 86, 396-407 (2000).</li>
<li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacol Res. 41, 613-627 (2000).</li>
<li>Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+electrode+polarization+in+the+far+field%3A+implications+for+external+defibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Virtual electrode polarization in the far field: implications for external defibrillation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279, 1055-1070 (2000).</li>
<li>Hammouda, M., Kinosita, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coronary+circulation+in+the+isolated+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The coronary circulation in the isolated heart.</a> J Physiol. 61, 615-628 (1926).</li>
<li>Salama, G., Hwang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+optical+mapping+of+intracellular+free+calcium+and+action+potentials+from+Langendorff+perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts.</a> Curr Protoc Cytom. 12, 17-17 (2009).</li>
<li>Lou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+panoramic+imaging+of+epicardial+electrical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity.</a> Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).</li>
<li>Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+new%2C+long-wavelength%2C+voltage-sensitive+dyes+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart.</a> J Membr Biol. 208, 125-140 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בניסוי זה שינינו את שיטת זלוף Langendorff ידי הוספת צינורית סיליקון קטנה, אשר הוא חיוני במיוחד לאחר דיכוי התכווצויות חדרית עם uncoupler עירור-התכווצות. צינורית סיליקון משמש כדי למנוע גודש פתרון, החמצה של הפתרון זלוף, ופיתוח של איסכמיה של החדר השמאלי. הלב העכבר רגיש מאוד היפותרמיה, ולכן וריאציות הטמפרטורה על פני הלב תגרום הבדלים מלאכותיים משך פוטנציאל פעולה. כתוצאה מכך, מערכת חימום בוצע בתא זלוף על מנת לשמור על טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס במהלך מכלול הניסוי 8. מאז מודל Langendorff אינו שומר העצבוב של הלב, צריך לשקול להוסיף עצביים אל perfusate על מנת לחקור את הטון אוהד הפאראסימפתטית פיזיולוגיים 9. מלבד זלוף מדרדר, תוספת של superfusion הלב עוזר לשמור על פרמטרים סביבתיים מתאימים כגון pH וטמפרטורה. בשיטה זו, בלב Langendorff perfused הונח אופקית. התקנה אנכית זלוף Langendorff יכול לשמש גם 10, אך עלולה לגרום מכניקה לב שונה במקצת 11. בנוסף CMOS מצלמות, גלאים חלופיים זמינים גם יכול להיות מיושם על המפה V מ &#39;חתול בו זמנית 12. יישום של מצלמות CMOS ברזולוציה גבוהה במרחב ובזמן מבטיח את הדיוק של הקלטות, אולם אותות מיפוי אופטי אינם מתא בודד. במקום זאת, כל אות ניאון נובע מאות או אלפי תאים, בהתאם הגדלה אופטית. הקרינה חדרית הרבה יותר גדול יכול לעוות אותות פרוזדורים על ידי פיזור אופטי, ולכן פרשנות זהירה של אותות רשמה אופטית נדרש. מגבלה נוספת של הכנה העכבר הוא עיוות האות לרעש הנגרם על ידי העקמומיות של פני השטח בשל גודלו הקטן של הלב 13. מדידות מהירות הולכה ניתן לשנות לא רק עקמומיות הלב העכבר אלא גם קוטביות אלקטרודה אלקטרודות וירטואלי. כדי להשיג דיוק עבור מהירות ההולכה, אנאיזוטרופיה ההפעלה, ומפות repolarization, נכון התמקדות של המצלמה על פני השטח של הלב היא חיונית. בשיטה זו, בזמן אמת הקלטות א.ק.ג. ניתן להשלים את החקירה אופטי של electrophysiology לב. מתח רגיש צבען (RH237) ו אינדיקטור סידן (Rhod, 02:00) משמשים בפרוטוקול בגלל תגובה מהירה שלהם, עירור דומה, ספקטרום פליטה ברורים 3,7. קיימים שילובים של צבעים חלופיים שניתן להשתמש בהם כדי למדוד V מ &#39;חתול אחר מאשר RH237 ו-Rhod 02:00 3. לצבוע רומן מתח רגיש, PGHI, עם שינוי גדול של סטוק (&gt; 200nm) נמצא כדי לאפשר יותר מ V אותות חתול בגלל הפרדה גדולה יותר של אורכי גל הפליטה בין PGHI ו-Rhod 02:00 14. שיפורים עתידיים עשויים להתמקד בחקר בדיקות ניאון רומן, פיתוח של גלאי הדמיה חדש, תוכנת עיבוד תמונה משופרת. רזולוציה גבוהה הרומן שיטות הדמיה אופטית למיפוי אופטי 3D הם גם הכיוונים העתידיים החשובים של מיפוי אופטי 5.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> כימי </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג&#39;רזי </td><td> S271-1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 (2H 2 O) </td><td> פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג&#39;רזי </td><td> C79-500 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג&#39;רזי </td><td> S217-500 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (6 שעות 2 O) </td><td> פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג&#39;רזי </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> לאא 2 PO 4 (H 2 O) </td><td> פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג&#39;רזי </td><td> S369-500 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג&#39;רזי </td><td> S233-3 </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> פישר סיינטיפיק, הדשא הוגן, ניו ג&#39;רזי </td><td> D16-1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td> Tocris Bioscience, Ellisville, MO </td><td> 1760 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td> Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה </td><td> S1109 </td></tr><tr><td> Rhod, 02:00 </td><td> Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה </td><td> R1244 </td></tr><tr><td> Pluronic F127 </td><td> Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה </td><td> P3000MP </td></tr><tr><td> Sulphoxide דימתיל (DMSO) </td><td> סיגמא, סנט לואיס, מיזורי </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

הלב העכבר הוא מודל פופולרי ללימודי לב וכלי דם בשל קיומה של הטכנולוגיה בעלות נמוכה עבור הנדסה גנטית של מין זה. Phenotyping פיזיולוגיים לב וכלי דם של הלב העכבר ניתן לעשות זאת בקלות באמצעות דימות פלואורסצנטי העסקת בדיקות שונות פוטנציאל הטרנסממברני (V מ &#39;), הארעיים סידן (CAT), ופרמטרים נוספים. עירור-התכווצות צימוד מאופיין הדינמיקה פעולה פוטנציאליים תאיים סידן, ולכן חשוב למפות באופן ביקורתי הן מ V ו-CAT בו זמנית באותו מקום על הלב 1-4. מיפוי אופטי סימולטני מן Langendorff perfused לבבות העכבר יש את הפוטנציאל להבהיר המנגנונים אי ספיקת לב, הפרעות קצב, מחלות מטבוליות, מחלות לב אחרות. ויזואליזציה של הפעלה, מהירות ההולכה, משך פעולה פוטנציאליים, ופרמטרים נוספים על מספר עצום של אתרים לא ניתן להשיג מחקירה ברמה התאית אבל גם נפתרת על ידי מיפוי אופטי 1,5,6. במאמר זה אנו מציגים את תוכנית ההתקנה מכשור תנאי הניסוי למיפוי אופטי סימולטני של V מ &#39;חתול ועכבר לבבות עם רזולוציה במרחב ובזמן גבוהה באמצעות המדינה-of-the-art טכנולוגיית CMOS הדמיה. הקלטות אופטי עקבי להשיג בשיטה זו להמחיש כי מיפוי אופטי סימולטני של לבבות Langendorff עכבר perfused הוא גם ריאלי ואמין.

מאמר זה מפרט את הליך הנתיחה, הגדרת תפקיד, ואת תנאי הניסוי במהלך מיפוי אופטי פוטנציאל הטרנסממברני (VM) וסידן תאיים חולף (CAT) ב Langendorff מבודד בלב שלם perfused העכבר.

לב העכבר הוא מודל נפוץ למחקרי מערכת קרדיווסקולרית, בשל קיומה של טכנולוגיה זולה להנדסה גנטית במין זה. ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע מיפוי אופטי סימולטני של פוטנציאל ממבנה ותגובת סידן תוך-תאית בלבבות עכברים מבודדים ושלמים המבושריים ב-LOR. זאת מושג תחילה על ידי הוצאת לב העכבר השלם, ולאחר מכן קנולציה של האאורטה ותחילת בישורי LOR. השלב הבא הוא קיבוע הלב על ידי העמסתו על מדשק של התכווצות ועירור (excitation contraction coupler), ולאחר מכן הצמדת הלב לתא הבישורה באמצעות סיכות.השלבים הסופיים הם טעינת הצבעים האופטיים והסדרים להפחתת ארטיפקטים של תנועה במהלך הניסוי. תמונות אופטיות מתקבלות על ידי איסוף האור הנפלט מהלב באמצעות מצלמות my cam Ultima LC Moss. היי, שמי di.אני סטודנט לתואר מתקדם באוניברסיטת וושינגטון. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרו-אלקטרודה, הוא שמיפוי אופטי מאפשר רזולוציה מרחבית גבוהה יותר על פני כל שטח הלב. שלום, אני מאט סאלקין.אני סטודנט לתואר מתקדם באוניברסיטת וושינגטון. שיטה זו, אם תבוצע נכון, יכולה לסייע במתן מענה לשאלות רבות באלקטרופיזיולוגיה של הלב, כגון הבסיס להיווצרות הפרעות קצב (arrhythmogenesis). התחלו בהגדרת משאבה פריסטלטית אחת להזרמת התמיסות בקצב של 40 milliliters per minute.לאחר מכן, כוון משאבה פריסטלטית שנייה ל-80 milliliters per minute. משאבה זו מחזירה את ה-Perfuse eight חזרה למכל ההחזקה והחמסנה. הפעל את המשאבות ושטוף את המערכת עם ליטר אחד של 70% ethanol למשך 30 דקות בסיבוב חוזר.בצעו שטיפה זו בעזרת שני ליטרים של מים דיוניים ללא רסירקולציה. לאחר ריקון המים, הזרים שני ליטרים של תמיסת Tyro והעבירו אותם דרך מסנן של חמישה מיקרון. חממו את הפרפוזאט ל-37 °C באמצעות מעטפת מים ומסחרור, והבעירו גז מחומצן לתוך התמיסה.כווננו את קצב בעבוע הגז כדי לשמור על pH של 7.35 פלוס או מינוס 0.05. עקבו אחר ה-pH והטמפרטורה במהלך הניסוי. מכשיר המיפוי האופטי הכפול מורכב משתי מצלמות C moss במהירות גבוהה המסוגלות ללכוד תמונה של 100 על 100 פיקסלים בקצב של 3000 פריימים לשנייה.חברו מסנן חסימה (band pass filter) למצלמה של דימות הסידן ומסנן מעביר (long pass filter) למצלמה של דימות המתח על גבי מחזיק מצלמות כפול. חברו מראת דיכרואיזם (dichroic mirror) ועדשה כך שאור הפליטה המגיע מהלב ימוקד על ידי העדשה אל המראה. כמו כן, חברו שתי מצלמות למחזיק וסדרו אותן כך שיהיו ניצבות זו לזו.בשלב הבא, הגדירו את תאורת העירור. האור מיוצר על ידי נורת הלוגן ומופנה דרך מוליך אור גמיש. העבירו את האור דרך מסנן חום, תריס להגבלת החשיפה ומסנן חסימה (band pass) לעירור.לבסוף, הכינו אלקטרודות של כסף וכסף כלורי על ידי התקנתן בתא. לאחר בדיקה כפולה וכיוון של הרמות במגברים ובמסננים, המערכת מוכנה עבור לב. השתמשו בתערובת של קטמין וקסילזין עם 100 יחידות של הפרין כדי להרדימ את העכבר לפני ההמשך.וודאו כי לבעל החיים אין רפלקס כאב באמצעות צביטה בבוהן. לאחר ביצוע חתך במרכז העצם הסטרנלית, הוציאו במהירות את הלב ואת הרקמות הסובבות אותו. לאחר מכן, בעזרת מיקרוסקופ דיסקציוני, זהו במהירות את האורטה ובצעו חתך נקי לרוחב האורטה העולה מתחת לעורק התת-בריחיי השמאלי.כעת חברו קטע קצר של אאורטה לקנולה בכילור 21 שהוכנה במיוחד, באמצעות ארבעה תפרי silk שזורים בצבע שחור. לאחר הקנולציה, בצעו פרפוזיה וסופוזיה רטרוגרדיבית של הלב עם תמיסות Tyro, תוך כיוון קצב הזרימה כדי לשמור על לחץ אאורטלי שבין 60 ל-80 millimeters Mercury, כפי שנמדד באמצעות חיישן לחץ.כעת נבצע דיסקציה ונסיר את הריאה, הטימוס ורקמת השומן שמסביב. כעת נחדיר צינור סיליקון אל החדר השמאלי דרך הוורידים הראייתיים. נתפר את הצינור לרקמת חיבור סמוכה.שלב חשוב מאוד זה מונע גודש והחמצה של ה-Perfuse eight הלכוד בחדר השמאלי, במיוחד לאחר דיכוי התכווצויות החדרים. כדי למנוע תנועות לב המושרה על ידי Perfuse eight, תקפיחו את הלב בנקודת השיא (apex) שלו לתחתית תא הפרפוזיה המצופה ב-sill guard. בנוסף, מתחו ותקפיחו את התוספות של העליות הימנית והשמאלית כדי להגדיל את שטח הפנים של העליות בתצורה אנכית.פעולה זו תמקסם את שטח הפנים של ההקלטה. כדי לבצע את גירויי הקצב, חברו אלקטרודה מותאמת אישית לפני השטח של הלב. כדי להפחית ארטיפקטים של תנועה, קבעו זכוכית כיסוי קטנה מעל הלב על פני התמיסה.בצעו זאת על ידי קיבוע הזכוכית בין מספר סיכות. כהכנה סופית, מקדו את אור העירור על הלב ומקמו את המצלמות לקבלת תמונה אופטית, ולאחר מכן התחילו בהעמסת הצבע בזמן טעינת הצבעים. עקבו באופן רציף אחר רישומי ה-ECG כדי להבטיח תפקוד חשמלי תקין של הלב.התחילו בחימום של BLEs statin לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, ערבבו חצי מיליליטר של BLEs statin לתוך profuse eight במאגר ההחזקה, ומדללו את ה-1/10 מיליליטר הנותר של BLEs statin לתוך מיליליטר אחד של תמיסת Tyros. במהלך 20 הדקות הבאות, הזרקו לאט את ה-BLEs statin ב-tyros דרך פתח הגשת התרופה הסמוך לקניולה.הסטטין של ה-BLEs יפחית בהדרגה את ארטיפקט התנועה. לאחר מכן, דללו 30 µL של צבע רגיש למתח בתוך 1 mL של תמיסת tyro, והזריקו תערובת זו באיטיות במשך חמש עד שבע דקות לאותו פתח תרופות. לאחר מכן, הכינו את אותה התערובת פעם נוספת.הפעם, הוסיפו 30 µL נוספים של אינדיקטור סידן. הגשה את התערובת זו באיטיות, במשך חמש עד 10 דקות, דרך אותו פתח. לאחר הזרקת אינדיקטור הסידן, המתינו חמש עד 10 דקות נוספות עד להדמיה מלאה של התנועה על ידי ה-BLEs statin, וכדי שהצבעים יחדרו לתאים לפני המשך הניסוי.הכנה זו של הלב בוצעה. בהתאם לפרוטוקול, אותות ECG הוקלטו במהלך קוצבי פרוקודור של הבלב מעוררות S one S one. פוטנציאלי פעולה ואותות של תנודות סידן הוקלטו מהעליות בצד שמאל ומהחדרים בצד ימין.החץ מראה היכן התרחסה פיזור אותים מהחדרים; על ידי קיבוץ (binning) של ההקלטות מהמצלמה ליחידות של שלושה פיקסלים על שלושה פיקסלים, ניתן להציג מהנתונים מערך של תנודות סידן ופוטנציאלי פעולה. ניתן להבנות דמות המציגה הולכה של פוטנציאל פעולה. נתונים משלוש נקודות עוקבות על הציר הרוחבי והאורכי מראים את השינוי באמפליטודה עם התפשטות פוטנציאל הפעולה על פני שטח הפנימי של החדר.באופן דומה, ניתן להוסיף איור המציג את משכי פוטנציאל הפעולה והמעברים של הסידסיום. איור זה מציג תנאי ביקורת בצד שמאל ובצד ימין. הלב קיבל הזרקה של isoproterenol, אשר מקצרת בבירור את משך המעברים של הסידסיום ושל פוטנציאלי הפעולה.במקום שבו הטכניקה כבר נשלטה, ניתן להשלים אותה בשעתיים עד שלוש שעות בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון פרוטוקול קצב (pacing protocol), כדי לענות על שאלות נוספות, כגון שאלות הנוגעות לתקופת הרפרקטוריות של ה-AV node.

optical-mapping-action-potentials-calcium-transients-mouse

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מאמר זה מתאר טכניקה גבוהה ברזולוציה של זמן ומרחב התנועה תמונה אופטית פעולה פוטנציאל על פני השטח של Langendorff-perfused הלבבות חולדה באמצעות צבע פוטנציומטרית (di-8-ANEPPS).

מיפוי אופטי של Langendorff-perfused לבבות עכברוש

מאמר זה מתאר את ההליכים הבסיסיים לעריכת ניסויים מיפוי אופטי בלב Langendorff-perfused הארנב באמצעות מערכת הדמיה פנורמית, ואת שיטת כפול (מתח סידן) הדמיה.

Multiparametric מיפוי אופטי של הלב Langendorff-perfused הארנב

מאמר זה מתאר את הטכניקה המשמשת לביצוע מיפוי אופטי דו-ערוצי בחד-שכבות חד-שכבתיות של תאי פרוזדורים HL-1. פרוטוקול ייחודי זה מאפשר הדמיה בו-זמנית של פעילות סידן (Ca) ומתח (Vm) באותו אזור לזיהוי וניתוח מפורט של תכונות אלקטרופיזיולוגיות של תרבית חד-שכבתית.

מתח וסידן ערוץ כפול אופטי מיפוי של תרבית HL-1 פרוזדורים Myocyte חד שכבתי

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול מפורט וציוד הכרחי למיפוי כפול אופטי של (מ 'V) פוטנציאל הטרנסממברני וחופשי רשתית תוך-sarcoplasmic (SR) Ca 2 + בלב ארנב Langendorff-perfused. שיטה זו מאפשרת לתצפית ישירה וכימות של מטר V ו2+ דינמיקת Ca SR בלב שלם.

מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ופוטנציאל הטרנסממברני בלב ארנב Langendorff-perfused

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיפוי אופטי של פעילות חשמלית מן אטריום ימין בעכבר במיוחד צומת סין-פרוזדורים, ברזולוציה גבוהה במרחב ובזמן.

מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה של צומת סין- פרוזדורי העכבר

פרוטוקול זה מתאר הערכת אלקטרופיזיולוגיות אטריה מאתר ניצול מערכת מיפוי אופטי עם הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית רזולוציה גבוהה, כולל הקלטות כפולה של מתח הממברנה, Ca2 + חולף תחת מתוכנת גירוי דרך קטטר אלקטרודה מיוחדת.

אלקטרופיזיולוגיות להערכת אטריה מאתר עם מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה

אנו מציגים את המתודולוגיה עבור בידוד של מוציטים מורטין וכיצד להשיג מתח או סימני הסידן במקביל עם הקיצור סרקומר באמצעות מכשירי האור הפלואורסצנטית עם מדידות הגיאומטריה הדיגיטלית בו.

הדמיה אופטית של מודציטים מבודדים המוח החדרית

מטרת מחקר זה הייתה ליצור שיטה לחקירת דינמיקה קרדיולוגית באמצעות מודל בעלי חיים טרנסלבותית. הגישה הניסיונית המתוארת משלבת אופקרדיוגרפיה כפולה בשילוב עם מחקר אלקטרולוגי להערכת פעילות החשמל במודל לב פורצין מבודד, שלם.

אופקרדיוגרפיה ולימודי אלקטרופיזיולוגיה של לשעבר Vivo נגדורף

פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור הנחת פרוסות לב של האדם לניסויים פרה-קליניים ופרטים השימוש במיפוי אופטי עבור הקלטת מתח טרנסממברניות ואותות סידן תאיים בו מפרוסות אלה.

מיפוי אופטי של הערכת החשמל לניתוחי לב באמצעות מתח כפול וסידן

פרוטוקול זה מציג מיפוי אופטי דו-צבעי של לבבות עכברים המתקבלים מחיות בר וחיות בר המושפעות מטכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית, כולל מדידות אלקטרופיזיולוגיות של מתח טרנסממברנה וטרנזיאנטים תוך-תאיים Ca2+ ברזולוציה טמפורלית ומרחבית גבוהה.

מיפוי אופטי של לבבות בצבע כפול מעכברי RyR2R2474S של טכיקרדיה חדרית פולימורפית קטכולמינרגית

למד מיפוי אופטי של פוטנציאל פעולה וסידן תוך-תאי בלב עכבר מבודד בפרפוזיה לנגנדורף. שיטה זו מספקת רזולוציה מרחבית גבוהה לחקר אלקטרופיזיולוגיה לבבית ומנגנוני הפרעות קצב.

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

גלה סרטונים נוספים