מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס
13 בספטמבר 2011
מאמר זה מפרט את הליך הנתיחה, הגדרת תפקיד, ואת תנאי הניסוי במהלך מיפוי אופטי פוטנציאל הטרנסממברני (VM) וסידן תאיים חולף (CAT) ב Langendorff מבודד בלב שלם perfused העכבר.
המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע מיפוי אופטי סימולטני של פוטנציאל ממבנה ותגובת סידן תוך-תאית בלבבות עכברים מבודדים ושלמים המבושריים ב-LOR. זאת מושג תחילה על ידי הוצאת לב העכבר השלם, ולאחר מכן קנולציה של האאורטה ותחילת בישורי LOR. השלב הבא הוא קיבוע הלב על ידי העמסתו על מדשק של התכווצות ועירור (excitation contraction coupler), ולאחר מכן הצמדת הלב לתא הבישורה באמצעות סיכות.
השלבים הסופיים הם טעינת הצבעים האופטיים והסדרים להפחתת ארטיפקטים של תנועה במהלך הניסוי. תמונות אופטיות מתקבלות על ידי איסוף האור הנפלט מהלב באמצעות מצלמות my cam Ultima LC Moss. היי, שמי di.
אני סטודנט לתואר מתקדם באוניברסיטת וושינגטון. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרו-אלקטרודה, הוא שמיפוי אופטי מאפשר רזולוציה מרחבית גבוהה יותר על פני כל שטח הלב. שלום, אני מאט סאלקין.
אני סטודנט לתואר מתקדם באוניברסיטת וושינגטון. שיטה זו, אם תבוצע נכון, יכולה לסייע במתן מענה לשאלות רבות באלקטרופיזיולוגיה של הלב, כגון הבסיס להיווצרות הפרעות קצב (arrhythmogenesis). התחלו בהגדרת משאבה פריסטלטית אחת להזרמת התמיסות בקצב של 40 milliliters per minute.
לאחר מכן, כוון משאבה פריסטלטית שנייה ל-80 milliliters per minute. משאבה זו מחזירה את ה-Perfuse eight חזרה למכל ההחזקה והחמסנה. הפעל את המשאבות ושטוף את המערכת עם ליטר אחד של 70% ethanol למשך 30 דקות בסיבוב חוזר.
בצעו שטיפה זו בעזרת שני ליטרים של מים דיוניים ללא רסירקולציה. לאחר ריקון המים, הזרים שני ליטרים של תמיסת Tyro והעבירו אותם דרך מסנן של חמישה מיקרון. חממו את הפרפוזאט ל-37 °C באמצעות מעטפת מים ומסחרור, והבעירו גז מחומצן לתוך התמיסה.
כווננו את קצב בעבוע הגז כדי לשמור על pH של 7.35 פלוס או מינוס 0.05. עקבו אחר ה-pH והטמפרטורה במהלך הניסוי. מכשיר המיפוי האופטי הכפול מורכב משתי מצלמות C moss במהירות גבוהה המסוגלות ללכוד תמונה של 100 על 100 פיקסלים בקצב של 3000 פריימים לשנייה.
חברו מסנן חסימה (band pass filter) למצלמה של דימות הסידן ומסנן מעביר (long pass filter) למצלמה של דימות המתח על גבי מחזיק מצלמות כפול. חברו מראת דיכרואיזם (dichroic mirror) ועדשה כך שאור הפליטה המגיע מהלב ימוקד על ידי העדשה אל המראה. כמו כן, חברו שתי מצלמות למחזיק וסדרו אותן כך שיהיו ניצבות זו לזו.
בשלב הבא, הגדירו את תאורת העירור. האור מיוצר על ידי נורת הלוגן ומופנה דרך מוליך אור גמיש. העבירו את האור דרך מסנן חום, תריס להגבלת החשיפה ומסנן חסימה (band pass) לעירור.
לבסוף, הכינו אלקטרודות של כסף וכסף כלורי על ידי התקנתן בתא. לאחר בדיקה כפולה וכיוון של הרמות במגברים ובמסננים, המערכת מוכנה עבור לב. השתמשו בתערובת של קטמין וקסילזין עם 100 יחידות של הפרין כדי להרדימ את העכבר לפני ההמשך.
וודאו כי לבעל החיים אין רפלקס כאב באמצעות צביטה בבוהן. לאחר ביצוע חתך במרכז העצם הסטרנלית, הוציאו במהירות את הלב ואת הרקמות הסובבות אותו. לאחר מכן, בעזרת מיקרוסקופ דיסקציוני, זהו במהירות את האורטה ובצעו חתך נקי לרוחב האורטה העולה מתחת לעורק התת-בריחיי השמאלי.
כעת חברו קטע קצר של אאורטה לקנולה בכילור 21 שהוכנה במיוחד, באמצעות ארבעה תפרי silk שזורים בצבע שחור. לאחר הקנולציה, בצעו פרפוזיה וסופוזיה רטרוגרדיבית של הלב עם תמיסות Tyro, תוך כיוון קצב הזרימה כדי לשמור על לחץ אאורטלי שבין 60 ל-80 millimeters Mercury, כפי שנמדד באמצעות חיישן לחץ.
כעת נבצע דיסקציה ונסיר את הריאה, הטימוס ורקמת השומן שמסביב. כעת נחדיר צינור סיליקון אל החדר השמאלי דרך הוורידים הראייתיים. נתפר את הצינור לרקמת חיבור סמוכה.
שלב חשוב מאוד זה מונע גודש והחמצה של ה-Perfuse eight הלכוד בחדר השמאלי, במיוחד לאחר דיכוי התכווצויות החדרים. כדי למנוע תנועות לב המושרה על ידי Perfuse eight, תקפיחו את הלב בנקודת השיא (apex) שלו לתחתית תא הפרפוזיה המצופה ב-sill guard. בנוסף, מתחו ותקפיחו את התוספות של העליות הימנית והשמאלית כדי להגדיל את שטח הפנים של העליות בתצורה אנכית.
פעולה זו תמקסם את שטח הפנים של ההקלטה. כדי לבצע את גירויי הקצב, חברו אלקטרודה מותאמת אישית לפני השטח של הלב. כדי להפחית ארטיפקטים של תנועה, קבעו זכוכית כיסוי קטנה מעל הלב על פני התמיסה.
בצעו זאת על ידי קיבוע הזכוכית בין מספר סיכות. כהכנה סופית, מקדו את אור העירור על הלב ומקמו את המצלמות לקבלת תמונה אופטית, ולאחר מכן התחילו בהעמסת הצבע בזמן טעינת הצבעים. עקבו באופן רציף אחר רישומי ה-ECG כדי להבטיח תפקוד חשמלי תקין של הלב.
התחילו בחימום של BLEs statin לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, ערבבו חצי מיליליטר של BLEs statin לתוך profuse eight במאגר ההחזקה, ומדללו את ה-1/10 מיליליטר הנותר של BLEs statin לתוך מיליליטר אחד של תמיסת Tyros. במהלך 20 הדקות הבאות, הזרקו לאט את ה-BLEs statin ב-tyros דרך פתח הגשת התרופה הסמוך לקניולה.
הסטטין של ה-BLEs יפחית בהדרגה את ארטיפקט התנועה. לאחר מכן, דללו 30 µL של צבע רגיש למתח בתוך 1 mL של תמיסת tyro, והזריקו תערובת זו באיטיות במשך חמש עד שבע דקות לאותו פתח תרופות. לאחר מכן, הכינו את אותה התערובת פעם נוספת.
הפעם, הוסיפו 30 µL נוספים של אינדיקטור סידן. הגשה את התערובת זו באיטיות, במשך חמש עד 10 דקות, דרך אותו פתח. לאחר הזרקת אינדיקטור הסידן, המתינו חמש עד 10 דקות נוספות עד להדמיה מלאה של התנועה על ידי ה-BLEs statin, וכדי שהצבעים יחדרו לתאים לפני המשך הניסוי.
הכנה זו של הלב בוצעה. בהתאם לפרוטוקול, אותות ECG הוקלטו במהלך קוצבי פרוקודור של הבלב מעוררות S one S one. פוטנציאלי פעולה ואותות של תנודות סידן הוקלטו מהעליות בצד שמאל ומהחדרים בצד ימין.
החץ מראה היכן התרחסה פיזור אותים מהחדרים; על ידי קיבוץ (binning) של ההקלטות מהמצלמה ליחידות של שלושה פיקסלים על שלושה פיקסלים, ניתן להציג מהנתונים מערך של תנודות סידן ופוטנציאלי פעולה. ניתן להבנות דמות המציגה הולכה של פוטנציאל פעולה. נתונים משלוש נקודות עוקבות על הציר הרוחבי והאורכי מראים את השינוי באמפליטודה עם התפשטות פוטנציאל הפעולה על פני שטח הפנימי של החדר.
באופן דומה, ניתן להוסיף איור המציג את משכי פוטנציאל הפעולה והמעברים של הסידסיום. איור זה מציג תנאי ביקורת בצד שמאל ובצד ימין. הלב קיבל הזרקה של isoproterenol, אשר מקצרת בבירור את משך המעברים של הסידסיום ושל פוטנציאלי הפעולה.
במקום שבו הטכניקה כבר נשלטה, ניתן להשלים אותה בשעתיים עד שלוש שעות בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון פרוטוקול קצב (pacing protocol), כדי לענות על שאלות נוספות, כגון שאלות הנוגעות לתקופת הרפרקטוריות של ה-AV node.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוצדורה מפורטת למיפוי אופטי של פוטנציאל ממברנה ושינויים חולפים של סידן תוך-תאי בלבבות עכברים מבודדים שבוצע להם בישוף בשיטת Langendorff. השיטה משפרת את הרזולוציה המרחבית בהשוואה לטכניקות מסורתיות, ומספקת תובנות לגבי אלקטרופיזיולוגיה של הלב.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אלקטרופיזיולוגיה של הלב
- טכניקות של מיפוי אופטי
- מודלים של לב עכבר
רקע
- מיפוי אופטי מאפשר מדידה סימולטנית של Vm ו-CaT.
- לשיטות מסורתיות, כגון מיקרו-אלקטרודות, יש מגבלות ברזולוציה המרחבית.
- טכניקה זו יכולה לסייע בחקר האריתמוגנזה.
- פרופוזיית לנגנדורף (Langendorff perfusion) שומרת על חיוניות הלב לצורך ניסויים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה למיפוי אופטי בלבבות של עכברים.
- שיפור ההבנה של הפעילות החשמלית של הלב.
- סיוע במחקר על המנגנונים של הפרעות קצב לב (arrhythmias).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הוצאה וקנוולציה של לב העכבר לצורך פרפוזיה.
- שימוש במצלמות מהירות ללכידת תמונות אופטיות.
- טעינת צבעים אופטיים להדמיה של פוטנציאל טרנס-ממברנלי ותנודות סידן.
- ניטור pH וטמפרטורה במהלך הניסוי.
תוצאות עיקריות
- מיפוי אופטי מוצלח של Vm ו-CaT בלב מבודד.
- הוכחת הפחתה של ארטיפקטים של תנועה באמצעות יישום הצבע.
- הקלטה יעילה של פוטנציאלי פעולה ואותות של תנודות סידן.
- תיקוף השיטה למחקרי אלקטרופיזיולוגיה עתידיים.
מסקנות
- טכניקת המיפוי האופטי מספקת רזולוציה מרחבית גבוהה.
- שיטה זו יכולה לקדם את המחקר באלקטרופיזיולוגיה של הלב.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור אריתמוגנזה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיפוי אופטי של פוטנציאל קרום התא ושל תנודות סידן בלבבות של עכברים מספק נתונים מרחביים וזמניים ברזולוציה גבוהה, החיוניים להסרת סיכונים מכניסטיים בתהליך תיקוף של מטרות קרדיווסקולריות. גישה זו מאפשרת הערכה כמותית של פנוטיפים אלקטרופיזיולוגיים, ובכך תומכת בביטחון חיזוי במודלים פרה-קליניים של הפרעות קצב ואי-ספיקת לב. על ידי לכידה בו-זמנית של דינמיקת Vm ו-CaT, השיטה מגשרת בין ביולוגיה של גילוי לבין התאמה של ביומרקרים תרגומיים במערכות רלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מיפוי של דינמיקת פוטנציאל הפעולה ותנודות הסידן ברחבי רקמת הלב.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה סימולטנית של פרמטרי צימוד עיבור-כיווץ.
- ערך ניבוי: מגביר את הביטחון ביעד על ידי קישור הפרעות מולקולריות לתפליות אלקטרופיזיולוגיות פונקציונליות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנה של מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף להערכת תרכובות בהמשך התהליך, באמצעות רכישת אות אופטי סטנדרטית.
- פלט כמותי: יצירת מדידות הדירות של משך פוטנציאל הפעולה, מהירות ההולכה ואמפליטודת הטרנזיינט של הסידן.
- שביליות (Scalability): מאפשרת שימוש חוזר בפלטפורמה על פני מודלים מרובים של מחלות לב, באמצעות פרוטוקולים עקביים של פרפוזיית Langendorff וטעינת צבע.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: רלוונטי למחקרים על אי-ספיקת לב, הפרעות קצב לב ומחלות מטבוליות תוך שימוש במודלים של עכברים מהונדסים גנטית.
- המשכיות תרגומית: מקשר תובנות מכניסטיות משלב הגילוי לאימות פרה-קליני באמצעות שימור ארכיטקטורת הרקמה ופרפוזיה פיזיולוגית.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקריטריונים של קידום על ידי כימות סיכון אלקטרופיזיולוגי בשלב מוקדם של צינור הגילוי.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות של מטרות, דרך זיהוי מובילים (leads) ועד להערכת יעילות פרה-קלינית, ובכך מאפשרת שכלול איטרטיבי של מועמדים לתרופות קרדיווסקולריות בהתבסס על תוצאי מדידה אלקטרופיזיולוגיות תפקודיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קורלציה בין התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות לבין דפוסים אלקטרופיזיולוגיים מרחביים.
- סריקה: מספקת סטנדרטיזציה של הבדיקה ופלט כמותי החיוניים לסריקה אמינה של תרכובות בגילוי תעלות יונים ומודולטורים.
- אנליטיקה: מספקת מדידות ספאטיו-טמפורליות של Vm ו-CaT המאפשרות ניתוח השוואתי בין תנאים ניסויים וגנוטיפים שונים.
- מחקר תרגומי: שומרת על רלוונטיות פיזיולוגית באמצעות פרפוזיית Langendorff, ובכך תומכת בהשלכה לתגובות של איבר שלם.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת פנוטיפינג אלקטרופיזיולוגית הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להחלה על פרויקטים קרדיווסקולריים ומחלקות מטרות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באלקטרופיזיולוגיה של הלב.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה וחזרתיות באמצעות פרמטרים מוגדרים של פרפוזיה, טעינת צבע ודימות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי זיהוי ליקויים אלקטרופיזיולוגיים לפני השקעה משמעותית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מועמדים מותאם לסיכון, בהתבסס על פרופילים כמותיים של פוטנציאל פעולה וטרנזיינט סידן.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנתיחה של הלב, פרפוזיית Langendorff ומערכות דימוי אופטיות.
- תלוי במצלמות CMOS במהירות גבוהה, מקורות אור לעירור וסטים של פילטרים אופטיים לזיהוי בערוץ כפול.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של פרוטוקולים לטעינת צבע ואסטרטגיות להפחתת ארטיפקטים של תנועה.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר לזני עכברים שונים או למודלים של מחלות עם פיזיולוגיה לבבית משונה.
- כולל מגבלות מעשיות כגון רעילות של הצבע, פוטו-בליצ'ינג (photobleaching) והצורך בדיכוי תנועה קפדני לשמירה על איכות הנתונים.
