פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ אנופלס Spp.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחלץ DNA של מלריה, טפילים ויתושים מחלקי המעי האמצעי ובלוטות הרוק של חריגות, דגימות. זה מושג על ידי חיתוך היתוש בדיוק במפרק שבין הבטן לבית החזה, ובכך להפריד את המעי האמצעי מחלק בלוטות הרוק. לאחר מכן, כל קטע נטחן בנפרד במים דה-יונים.

לאחר מכן משקרים את תרחיף הרקמה ונשטפים וכדור התא משוחזר. לבסוף, כדור התא מורכב מחדש ומבושל, וה-DNA מופק. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות טפיל יתושים ומלריה באיכות גבוהה, DNA, המתאים לשימוש כתבנית לזיהוי חריגות, מיני וקטור וזיהומי מלריה גנוטיפיים באמצעות PCR ועיכול אנזימי הגבלה ספציפיים לאלל.

אז היתרון העיקרי של הטכניקה הפשוטה הזו על פני הקיימות כמו שיטות מיצוי ומיון אורגניות הוא שהיא משתמשת במעט מאוד ריאגנטים בטוחים וזמינים וגם הרבה פחות זמן עיבוד. כדי להתחיל לנתח את היתוש, הניחו אותו על חתיכת פרפורם קטנה והרכיבו אותו על מיקרוסקופ מנתח. מכסים אותו בטיפת מים נטולי יונים.

כדי לרכך את הרקמה בגודלה, פגר היתוש בדיוק במפרק שבין בית החזה לבטן. ובכך חתך את הראש ובית החזה מחלק הבטן. העבירו כל קטע יתושים מנותח לתוך חיטוי נקי, צינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר עם תווית מראש עם מספר זיהוי יתוש וחלק גוף השליכו את סרט הפרה ובעזרת מגבון קים רטוב ב-70% אלכוהול נגבו בזהירות את שלב המיקרוסקופ לפני העיבוד ליתוש הבא כדי לחלץ את הפיפטה הראשונה של DNA היתוש 20 מיקרוליטר של מים נטולי יונים לתוך צינור הדגימה.

והשתמש בקצה הפיפטה כדי לטחון את קטע היתושים השקוע לתרחיף אחיד. הוסף 100 מיקרוליטר של חיטוי, תמיסת XPBS 1% ספונין אחת לדגימה הומוגנית ומערבולת בעדינות לערבוב. דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

הצנטריפוגה הבאה ב -20, 000 גרם למשך שתי דקות, והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר XPBS אחד. ואז חזור על הסיבוב.

הוסף 75 מיקרוליטר מים סטריליים נטולי יונים ו -25 מיקרוליטר של 20% משקל לנפח. תרחיף שרף Cellex 100 במים נטולי יונים ומערבולת עדינה כדי להשעות מחדש את הגלולה באמצעות מחט היפודרמית סטרילית בגודל 23 המודלקת במבער בונסן . חורר חור במכסה של צינור הדגימה.

מרתיחים את מתלה הדגימה בגוש חימום למשך 10 דקות. צנטריפוגה ב-20,000 גרם למשך דקה אחת, ולהעביר את תמיסת ה-DNA לבקבוקון אחסון מתויג מראש לשימוש כתבנית בתגובות PCR כדי לבדוק את איכות ה-DNA שחולץ, להגביר אזור של פרוקי הרגליים mi המיטוכונדריאלי ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד דהידרוגנאז תת-יחידה ארבע שצפוי לייצר שבר של 400 זוגות בסיסים. לאחר מכן, כדי להבדיל בין מיני Ananais Gambia, יש להגביר אזור המאגף SNPs באזור המרווח הבין-גני שצפוי לייצר גדלים של 390 זוגות בסיסים עבור Ananais Gambia Sens Stricto, ו-315 זוגות בסיסים עבור ananais api.

Ansis אז לגנוטיפ p falciparum אנטי חומצה פולית עמידות לתרופות פולימורפיזמים. בצע PCR מקונן כדי להגביר את האזור המאגף את קודוני חומצות האמינו 16, 51, 59, 108 ו-164. בטפילים הגן דיהידרו פולאט רדוקטאז לבצע עיכול ספציפי לאלל של האמפליקון כדי לזהות עמידות לתרופות נגד חומצה פולית.

פולימורפיזמים קשורים. בדוק את התגובות בבדיקת ג'ל 2%AROS. דוגמאות לתוצאות מבדיקות PCR לזיהוי מולקולרי אנאליס RABIS באיכות תמצית DNA של יתושים, וגנוטיפ p falciparum מראות כי שיטת קלקס הפשוטה מניבה תוצאות דומות לפרוטוקול ההמלחה הסטנדרטי למרות פחות שלבים ופחות מרבע מהזמן עם איכות DNA דומה בתמציות המתאימות, אין זה מפתיע ששיעורי החיוביות של הדגימה ביחס לחריגות, מיני אחים בגמביה, כמו גם שיעורי ההדבקה בטפילים לא היו שונים סטטיסטית בהתבסס על מבחן הצ'י בריבוע של מק'ניר.

הוספת BSA לתערובות תגובה מביאה לעלייה כללית של חיובי PCR עקב הסרת מעכבי PCR הן עבור הקלקס הפשוט והן עבור פרוטוקול המלחה רגיל. עם זאת, עלייה זו לא הייתה מובהקת סטטיסטית למעט איכות ה-DNA בתמציות קלקס. עיכול אנזים הגבלה ספציפי לאלל של אמפליקון p falciparum מאפשר גנוטיפ של זיהומי מלריה במעי האמצעי ובבלוטות הרוק עבור אללים עמידים לתרופות לאחר שליטה.

טכניקה זו אמורה להיות מסוגלת להתבצע תוך כ-37 דקות אם היא מבוצעת כראוי.