Name: RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: למד שיטה אמינה לבידוד RNA מ-Pseudomonas aeruginosa בחולדות. הפרוטוקול כולל ליזה וחלצת חומצת פנול כלורופורם לקבלת RNA באיכות גבוהה ל-qPCR ו-RNA-seq.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקים AI62983 (AYK), AI22535 (GPB).

1. דגם Murine של פ GI aeruginosa להתיישבות והפצת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים C3H/HeN (6-8 wks הישן, נקבה, הרלן) מטופלים עם אנטיביוטיקה דרך הפה כדי לרוקן צומח commensal ולאחר מכן מונו יישבו עם הרשות הפלסטינית כפי שתואר לעיל 4. </li></ol> 2. מסיק Murine תוכן לומינל Cecal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול מרגמה לנקות נירוסטה לתוך אמבט חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בחנק פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר פגר מאובטחת על לוח קלקר ומקלחת עם אתנול 95%. לעשות חתך אורכי קו האמצע דרך העור מעצם החזה ועד חיץ הנקבים. לשקף את העור הצפק לחשוף את חלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכרות cecum כולו. החזק את cecum עם מלקחיים מעל המכתש נירוסטה. Snip בשני הקצוות של cecum עם מספריים לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קצה פיפטה P1000 מלא מ"ל 1 של חיץ flushate cecal (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA ו - 200 mM NaCl) 5 אל הקצה הפרוקסימלי של cecum. פלאש החיץ flushate cecal ותכנים luminal cecal אל תוך המדוכה נירוסטה. 1 מ"ל של חיץ flushate cecal יהיה מספיק הסמקה כל תוכן cecal. Cecal תוכן flushate יהיה להקפיא מיד לבוא במגע עם מרגמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים את תוכן flushate cecal עם העלי סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרקע מקום קפוא תוכן luminal cecal לתוך צינור פוליפרופילן 50 מ"ל חרוטי שקוע באמבט קרח / אתנול יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.2 עד 2.7 עבור כל עכבר נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב -80 ° C. </li></ol> 3. בידוד חיידקי RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח חם 1 (בהתבסס על נפח סופי של שני תוכן luminal cecal, כ 3 מ"ל) של חומצת פנול / כלורופורם (05:01, v / v) הנכלל שפופרת 50 מ"ל Oak Ridge צנטריפוגה עם כובע מאובטחת parafilm ב 65 ° C אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים 0.5 נפח המאגר תמוגה (2% SDS, 16 mM EDTA ו - 200 mM NaCl) 6 הכלולים צינור פוליפרופילן 50 מ"ל חרוטי במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ תמוגה רותחים לתכנים luminal cecal. Homogenize. מרתיחים במשך 5 דקות עם vortexing תקופתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את 100 ° C תוכן cecal / מדגם תמוגה על חומצה 65 מעלות צלזיוס פנול / כלורופורם את הצינור צנטריפוגות רידג'. חותם כובע עם parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם vortexing תקופתיים (כל 2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב g 2500 ב · 4 במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות העברת השלב מימית (הימנעות מכל של הממשק לבן) כדי צנטריפוגה רידג' Oak טרי 50 מ"ל. היקף השלב מימית תהיה כ -50% מהנפח הכולל של תוכן cecal, חיץ תמוגה, וחומצה פנול / כלורופורם. הוסף נפח שווה של חומצת פנול / כלורופורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם כובע עם parafilm ומערבבים היטב על ידי vortexing במהירות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב g 2500 ב · 4 במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.7-3.9 עד אין ממשק לבן גלוי בין שלבי מימית ואורגנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות כדי להעביר את השלב מימית צנטריפוגה רידג' Oak טרי 50 מ"ל. הוסף נפח שווה של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (24:1, v / v). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם כובע ומערבבים היטב על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב g 2500 ב · 4 במשך 15 דקות. הסר השלב מימית (נפח יעמוד על כ 50% מנפח את התגובה בסה"כ) כדי שפופרת 15 מ"ל פוליפרופילן חרוטי ולהוסיף נפח שווה של isopropanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב -20 ° לפחות 2 שעות או למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב g 2500 · 4 ב 45 דקות. ג'ל כמו גלולה יהוו בחלק התחתון של הצינור. הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור עם 1 מ"ל של אתנול קר כקרח 70%. וורטקס. צנטריפוגה מדגם ב ב ז ב 10,000 · 4 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו להפוך את הצינור כדי לאפשר יבש גלולה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה רנ"א 200 μl מים RNase חינם. </li></ol> 4. DNase טיפול (Turbo-DNA חינם, Applied Biosystems) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של חיץ 10X DNase טורבו 2 μl טורבו DNase ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על ° 37 במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של מגיב DNase resuspended איון ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר, ערבוב מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 10,000 בטמפרטורת החדר למשך 1.5 דקות ולהעביר את supernatant לצינור microfuge חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כרך אחד של חומצה (4 מעלות) קר פנול / כלורופורם ומערבבים היטב על ידי vortexing דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 12,500 בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית לצינור חדשה ולהוסיף 1 נפח של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (49:1 v / v), מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 12,500 בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית (כ 50% מנפח את התגובה סה"כ) לצינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח של 0.1 נתרן אצטט 3M, ו-pH 5.52.5 כרכים של אתנול קר כקרח 100%. וורטקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב -20 ° לפחות 2 שעות או ב -80 ° במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 12,000 במשך 30 דקות ב 4 מעלות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור עם 1 מ"ל של אתנול קר כקרח 70% על ידי centrifuging במשך 5 דקות ב g 10,000 ב · 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant יבשה ואוויר במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 100 μl מים RNase חינם. במאי צריך לשים באמבט מים 65 ° עד resuspend ו לפזר את גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את היעילות של הטיפול DNase, בתגובה RT-PCR תקן הגברה של חלבון ריבוזומלי (או גן התייחסות אחרת) יכול להתבצע עבור דגימות מטופלים ולא מטופלים, תוך שימוש לא שולטת RT. </li></ol> 5. RNA שלב ניקוי (Qiagen, RNeasy Kit) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיינו בדפי 56-57 של Qiagen RNeasy מיני מדריך (4 th Edition, אפריל 2006). פעל כפי שצוין. </li></ol> 6. נציג תוצאות הסכום הכולל של RNA חיידקי התאושש באמצעות פרוטוקול זה הוא כ 2-3 מיקרוגרם משני cecums. RNA התאושש היא בכמות ובאיכות מספקת עבור qPCR הבאים, פרופיל שעתוק, ו-RNA ניסויים Seq. טוהר RNA נבחנת באופן שוטף על ידי מדידת יחס 260nm/280nm 7 המדגם, אך שיטה זו אינה מספקת מידע על תקינות RNA. Bioanalyzer Agilent היא פלטפורמה מיקרופלואידיקה מבוסס על כימות, אומדת ובקרת איכות של DNA, RNA, חלבונים בתאים וכן מנצל מטרי שלמות המכונה RNA מספר Integrity RNA (רין) 8. RNA חילוץ עם פרוטוקול זה מייצר 260/280 יחסי החל 1.7-2.0 וערכים רין ≥ 7.0. דוגמה לניתוח Agilent Bioanalyzer של RNA חיידקי התאושש על ידי פרוטוקול זה מוצג באיור 1. <img src="/files/ftp_upload/3293/3293fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Agilent Bioanalyzer electropherogram וג'ל כמו התמונה של מסך מדגם Pseudomonas aeruginosa RNA בודד התאושש תוכן cecal Murine. רין 8.0.

<ol><li>Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+caused+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infections caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).</li>
<li>Bertrand, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endemicity%2C+molecular+diversity+and+colonisation+routes+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units.</a> Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+in+vivo+transcription+profiling+for+identifying+Pseudomonas+aeruginosa+genes+needed+for+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination.</a> PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).</li>
<li>Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+murine+model+of+gastrointestinal+colonization+and+dissemination+in+neutropenia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia.</a> Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).</li>
<li>Alexander, R. J., Raicht, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+total+RNA+from+human+stool+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification of total RNA from human stool samples.</a> Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).</li>
<li>Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+gene+expression+detected+in+human+faeces+by+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR.</a> J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).</li>
<li>Manchester, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+UV+methods+for+measurement+of+protein+and+nucleic+acid+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations.</a> Biotechniques. 20, 968-970 (1996).</li>
<li>Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIN%3A+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).</li>
<li>Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+gut+microbiome+in+obese+and+lean+twins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A core gut microbiome in obese and lean twins.</a> Nature. 457, 480-484 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיטת מיצוי RNA המתואר כאן מאפשר התאוששות של כמויות מספיקות של באיכות גבוהה הכולל Pseudomonas aeruginosa RNA שנקטפו מן העיכול Murine. שיטה זו אינה מוגבלת פ aeruginosa ועלול להיות מיושם על חיידקים אחרים. ההתאוששות של אורגניזמים מספיק חיידקים מהמעי ישתנו באופן משמעותי מן אורגניזם לאורגניזם. במודל Murine שלנו, פ aeruginosa בדרך כלל colonizes מערכת העיכול Murine ברמות בין 5 x אוקטובר 07-05 x 10 8 CFU / g צואה 4. מאז התאושש תוכן cecal הם בערך 0.5 גרם, מספר משוער של פ aeruginosa התאושש משני cecums הוא בין 5 x 07-05 אוקטובר CFU x 8 10. אם מיקרואורגניזמים אחרים נמצאים בשימוש, יהיה זה נבון כדי לוודא רמות קולוניזציה GI ואז לחשב את מספר cecums צריך לשחזר את מספר ממוקד של CFU. חשוב גם לציין כי בעת שימוש במודל זה Murine בפרט, עכברים שטופלו באנטיביוטיקה לא נגוע הרשות אין כמויות מדידים של RNA שבודד תוכן cecal שלהם. מודל Murine שלנו הקולוניזציה Pseudomonas aeruginosa העיכול ומנסה לחקות את הפצת בפתוגנזה של פ בקטרמיה ב סרטן בתאי גזע להשתלה בחולים aeruginosa. באוכלוסיית חולים זו, commensal צומח תיגמר לעתים קרובות משני לטיפול אנטיביוטי או כימותרפיות (למשל דלדול אנטיביוטי של GI commensal הצומח) וכתוצאה מכך צמיחת יתר של חיידקים פתוגניים (למשל מונו בשיתוף עם aeruginosa פ &#39;) ולאחר מכן הפצתו הבאים לאחר דיכוי המערכת החיסונית. היתרונות והמגבלות של מודל זה Murine כבר התייחס בעבר 4. מטרת המחקר הנוכחי היא לספק מתודולוגיה לבידוד מוחלט RNA של חיידקים מן במערכת העיכול. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם Murine מודלים אחרים ללמוד היבטים אחרים של חיידקים בפתוגנזה של מערכת העיכול (כלומר commensal אינטראקציות הצומח, אפקטים על חיידקי מחלת מעי דלקתית, וכו &#39;). אחד היתרונות של שיטה זו היא שילוב של צעדים תמוגה מרובים כולל הקפאה / הפשרה, שיבוש מכני (כתישה עם homogenization, מרגמה / העלי), רותחים, תמוגה כימיים (למשל SDS). למרות ריבוי הצעדים תמוגה, כמה מיקרואורגניזמים (בעיקר חיידקים גראם חיוביים ופטריות / שמרים) עשויים לדרוש הפרעה מכנית נוספים. לאחר חם תמוגה / חומצת פנול, כלורופורם הדגירה (שלב 3.5), תוספת של חרוזים (0.1 מ&quot;מ עבור חיידקים ו / או 0.5-0.7 מ&quot;מ עבור שמרים), צעד הבאים חרוז פועם צריך להספיק כדי lyse האורגניזמים 9, 10. בהתחשב באופי המורכב של חומרים התאושש מן cecum Murine, חזר קר acid-phenol/chloroform עקירות (שלב 3.7-3.9) נדרשים לחלוטין על מנת להשיג איכות RNA מקובל והיושרה לתגובות במורד נוספת. בין 3-5 קר acid-phenol/chloroform עקירות ייתכן שתידרש לפני הלבן ממשק בין שלבי מימית ואורגנית מסולק. לבסוף, שילוב של הטיפול הן DNase (שלב 4) ו פרוטוקול ניקוי RNeasy (שלב 5) חיוניים הסרת DNA זיהום קטנים שאינם mRNA (5s וגם tRNA). כאמור, ה-RNA התאושש על ידי שימוש בפרוטוקול זה היא בכמות ובאיכות מספקת עבור פרופיל שעתוק הבאים 3, qPCR (לא פורסם), ו-RNA Seq (לא פורסם) ניסויים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> מכתש ועלי </td><td> דיג </td><td> 12-947-1 </td></tr><tr><td> Homogenizer </td><td> אומני </td><td> TM-125 </td></tr><tr><td> Oak Ridge צינורות צנטריפוגה (50 מ&quot;ל) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td></tr><tr><td> חומצה פנול / כלורופורם </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td></tr><tr><td> כלורופורם </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C2432 </td></tr><tr><td> Isoamyl אלכוהול </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> W205702 </td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 190764 </td></tr><tr><td> Diethyl pyrocarbonate (DEPC) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 40718 </td></tr><tr><td> DNase </td><td> Ambion </td><td> AM2238 </td></tr><tr><td> RNeasy Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> 3M נתרן אצטט </td><td> Ambion </td><td> AM9740 </td></tr><tr><td> 100% אתנול </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> E7023 </td></tr></tbody></table>

rna בידוד pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול murine

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas (רש&quot;פ) aeruginosa זיהומים לגרום תחלואה ותמותה משמעותי ב מארחים בעלי מערכת חיסונית חלשה, כגון חולים עם לוקמיה, פצעים חמורים לשרוף, או השתלות איברים 1. אצל חולים בעלי סיכון גבוה ב לפיתוח זיהומים הרשות הדם, מערכת העיכול (GI) הינו המאגר העיקרי של קולוניזציה 2, אבל המנגנונים שבאמצעותם מעברים הרשות מן חיידק colonizing אסימפטומטיים עד פולשנית, וקטלני לעיתים קרובות, הפתוגן אינם ברורים. בעבר, ביצענו ניסויים פרופיל vivo שעתוק על ידי הרשות מחלים mRNA מתאי חיידקים המתגוררים cecums של קולוניזציה עכברים 3 על מנת לזהות שינויים בביטוי גנים חיידקיים במהלך שינויים מצב החיסון של המארח. בדומה לכל ניסוי פרופיל שעתוק, הצעד שער הגבלת היא בבידוד של כמויות מספיקות של mRNA באיכות גבוהה. לאור שפע של אנזימים, פסולת, שאריות מזון, חומר חלקיקי במערכת העיכול, האתגר של בידוד RNA הוא מרתיע. כאן, אנו מציגים שיטה בידוד אמין לשחזור של RNA חיידקי התאושש העיכול Murine. שיטה זו מנצלת מודל ומבוססת Murine של קולוניזציה GI הרשות נויטרופניה-Induced הפצת 4. קולוניזציה GI פעם עם הרשות הפלסטינית הוא אישר, עכברים הם מורדמים תוכן ו cecal הם התאושש פלאש קפוא. RNA מופק אז באמצעות שילוב של הפרעה מכנית, רותחים, פנול / כלורופורם עקירות, טיפול DNase ו כרומטוגרפיה זיקה. כמות וטוהר יאושרו על ידי לספקטרופוטומטריה (טכנולוגיות Nanodrop) ו bioanalyzer (Agilent Technologies) (איור 1). שיטה זו של בידוד חיידקים במערכת העיכול RNA יכול בקלות להיות מותאם חיידקים ופטריות אחרות.

שיטה אמינה הבידוד של RNA<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; התאושש cecums Murine מתואר. RNA התאושש היא בכמות ובאיכות מספקת עבור qPCR הבאים, פרופיל שעתוק, ו-RNA ניסויים Seq. טכניקה זו ניתן להתאים עבור בידוד RNA של חיידקים במעיים אחרים.

RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

זיהומים ב-*Pseudomonas aeruginosa* (PA) גורמים לתחלואה ותמותה משמעותיות במארחים עם מערכת חיסונית פגועה, כגון חולים עם...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד את ה-RNA הכולל של Pseudomonas aerogen ששוחל מ-ECMs של עכברים. הדבר מבוצע תחילה על ידי איסוף תכולת הלומן של הרצף. לאחר מכן, מבודד ה-RNA הבקטריאלי.לאחר מכן, מבוצעים טיפול ב-D'S וניקוי של ה-RNA. לבסוף, נמדדת כמות ה-RNA ונבדקת טהרת הבידוד באמצעות bioanalyzer וניתוח ספקטרופוטומטרי. בסופו של דבר, ניתן להשיג RNA חיידקי באיכות ובכמות מספקות להערכה ניסויית המשכית, כגון באמצעות QPCR, ניתוח, פרופילינג של תעתוק או ניסויי ריצוף RNA.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיצוי טריול (triol extraction), הוא ששיטה זו משלבת מספר שלבי ליזיס בחומצה קשוחה ביותר, ושלבי מיצוי בכלורופורם, כדי להבטיח RNA באיכות גבוהה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן את שלבי הליזיס והמיצוי קשה ללמוד מכיוון שפרוטוקולים כתובים משמיטים פרטים קטנים החיוניים להצלחה. את הפרו prosedur ידגימו אדוארדו לופז מדינה, עמית פוסט-דוקטורט, ומגן נובאואר, מנהלת המעבדה, שניהם מהמעבדה שלי. לפני תחילת הקציר, IMSA מנקה מכתש מפלדת אל-חלד באמבט חנקן נוזלי.לאחר המתת עכבר C3 HHEN בן שישה עד שמונה שבועות שהושלם בקולוניזציה של pseudomonas aerogen, הנח את בעל החיים במצב גב (supine) על לוח styrofoam והשקה את הבטן ב-95% ethanol. לאחר מכן, בצע חתך אורך במרכז העור מהסטרנום ועד לפרינאום. לאחר מכן, משוך לאחור את העור והפריטונאום וחשוף את חלל הבטן.כעת כריתו את העੁੰגב (cecum) כולו באמצעות פינצטה. החזיקו את העੁੰגב מעל מכתש פלדת אל-חלד וגזרו את שני קצותיו בעזרת מספרי נתיחה. מלאו טיפ של פיפט פ 1000 ב-1 mL של בופר sequel flush eight, ולאחר מכן הכניסו את הטיפ לקצה הפרוקסימלי של העੁੰגב.שטפו את ה-sequel flush eight buffer ואת התכני הלומינליים של ה-sequel אל תוך מכתש מפלדת אל חלד. כעת גרסו את תכני ה-sequel flush eight בעזרת פסטל סטרילי.לאחר מכן, שפכו אתונול לתוך מיכל עם קרח יבש והניחו מבחנה קונוית מ 폴פרופילן בנפח 50 מיליליטר בתוך אמבט האתונול והקרח היבש. העבירו את תכולת ה-luminal הקפואה והטחונה אל המבחנה הקונוית ואחסנו את המבחנה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. סדרת השלבים הבאה היא המורכבת ביותר בפרוצדורה.בהינתן הטבעם המורכב של החומרים המבודדים מהעוור (cecum) של MI, נדרשות חילוצים חוזרים של cold filoform על מנת להשיג אחידות ושלמות מקובלות; ייתכן שיהיו נחוצים בין שלוש לחמש חילוצים לפני שהממשק הרחב בין השכבה המימית לשכבה האורגנית ייעלם. העבירו נפח אחד של acid phenol chloroform לשפופרת צנטריפוגה של Oak Ridge בנפח 50 milliliter. הדקו את המכסה היטב ולאחר מכן חממו את השפופרה במבחן מים בטמפרטורה של 65 °C.העבר חצי נפח של בופר ליזיס למבחנה קונית מפוליפרופילן של 50 מיליליטר, ולאחר מכן הרתח את הבופר למשך חמש דקות. לאחר הוצאת תכני ה-sequel luminal מאחסון בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius, חמם קצרות את המבחנה באמצעות שפשוף מהיר ביד ולאחר מכן הוסף למבחנה את בופר הליזיס הרותח. נער את התערובת כדי להומוגניז את תמיסת ה-SQL luminal content של בופר הליזיס.הרתיחו את בופר הליזיס ואת תכני ה-SQL luminal למשך חמש דקות. תוך כדי ערבול (vortexing) תקופתי, פתחו את מבחנת הצנטריפוגה של Oak Ridge המכילה את תמיסת הפנול-כלורופורם והעבירו אליה את דגימת הליזיס של תכני ה-SQL. לאחר מכן, אטמו שוב את הפקק באמצעות perfil והחזירו את המבחנה למקלחת המים בטמפרטורה של 65 degrees Celsius למשך 10 דקות, תוך כדי ניעור המבחנה מדי שתי דקות.שטפו את הדגימה ב-2,500 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C. כעת העבירו בזהירות את הפאזה המימית לשפור צנטריפוגה חדש של Oak Ridge בנפח 50 מיליליטר, תוך הימנעות ממגע עם השכבה הלבנה בממשק. לאחר מכן, הוסיפו לשפור החדש נפח שווה של acid phenol chloroform.אטמו את הפקק בעזרת Parafilm וערבבו היטב את התכנים באמצעות וורטקס (vortex) של המבחנה במהירות גבוהה. המשיכו בצנטריפוגציה של הדגימה והעבירו את הפאזה המימית למבחנת צנטריפוגה. אם נפח הפאזה המימית העליונה הופך לקטן מדי, ניתן להעביר אותה למבחנה בעלת קוטר קטן יותר.המשיכו בתהליך זה עד שלא יהיה ממשק לבן גלוי בין הפאזה המימית לפאזה האורגנית. כאשר הממשק הלבן ייעלם, העבירו בזהירות את הפאזה המימית למבחנה לצנטריפוגה נקייה. לאחר מכן, הוסיפו למבחנה נפח שווה של chloroform, isoamyl alcohol, סגרו את המכסה וערבבו היטב את התוכן באמצעות vortexing.לאחר מכן, לאחר צנטריפוגה חוזרת של הדגימה, העבירו את הפאזה המימית למבחנה קונית מפּוליפרופילן בנפח 15 milliliters והוסיפו נפח שווה של isopropanol. לאחר מכן, דגרו את התמיסה בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius למשך שעתיים לפחות או למשך הלילה. לאחר דגירת הדגימה, צנטריפוגו את המבחנה למשך 45 דקות.לאחר זיהוי המשקע בעל המרקם הג'לתי בתחתית המבחנה, הסירו את הנוזל העליון (supernatant). כעת שטפו את המשקע באמצעות 1 mL של 70% ethanol קר מאוד (בטמפרטורת קרח) על ידי ערבוב במכשיר vortex, ולאחר מכן סבבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-10,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. לבסוף, הסירו את הנוזל העליון והפכו את המבחנה כדי לאפשר למשקע להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.לאחר מכן, השביו את משקע ה-RNA ב-200 µL של מים נטולי RNase. ראשית, הוסיפו למבחנה המיקרו-צנטריפוגית 20 µL של 10 x turbo DNA buffer ושני µL של turbo DNAset וערבבו את התמיסה בעדינות. לאחר מכן, דגרו את המבחנה בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות, הוסיפו למבחנה 20 µL של DNA inactivation reagent משוחב וערבבו היטב.כעת הדגרי את המבחנה למשך חמש דקות נוספות בטמפרטורת החדר, תוך ערבוב מדי פעם. לאחר מכן, השקיעי את המשקע במיקרו-צנטריפוגה ב-10,000 ×g למשך 1.5 דקות, והעבירי את הנוזל העליון למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה. הוסיפי נפח אחד של פנול-כלורפורם חומצי קר למשקע, ולאחר מכן ערבבי את התמיסה היטב באמצעות וורטקס למשך דקה אחת.לאחר סבוב של התמיסה בצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-12,500 ×g, העבירו את הפאזה המימית למבחנה חדשה והוסיפו נפח אחד של כלורופורם-איזואמיל אלכוהול. לאחר מכן, ערבבו את התמיסה באמצעות וורטקס (vortexing) וסובבו את התמיסה שוב בצנטריפוגה, תחת אותם תנאים. העבירו את הפאזה המימית למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה.לאחר מכן, הוסיפו 0.1 נפח של סודיום אצטט בריכוז three molar ו-2.5 נפחים של ethanol 100% קר מאוד. ערבבו את המבחנה באמצעות וורטקס. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius למשך 30 דקות.לאחר סתירה במהירות של 12,000 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, הסירו את הנוזל העליון (supernatant). לבסוף, שטפו את המשקע ב-1 ml של אתנול 70% קר מאוד. הסירו את הנוזל העליון ויבשו את המשקע באוויר למשך 10 דקות.לאחר מכן, השביה מחדש את המשקע ב-100 µL של מים נקיים מ-RNA. ה-Agilent Bioanalyzer הוא פלטפורמה מבוססת מיקרופלואידקה לקביעת גודל, כימות ובקרת איכות של DNA, RNA, חלבונים ותאים, והוא משתמש במדד שלם של RNA המכונה RNA integrity number או RIN. RNA שחולץ באמצעות פרוטוקול זה מניב יחסי 260/280 הנעים בין 1.7 ל-2.0 וערכי RIN הגדולים או שווים ל-7.0.דוגמה לאלקטרופורוגרמה של Agilent bioanalyzer עבור RNA חיידקי מוצגת כאן משמאל, ותמונה דמוית ג'ל של pseudomonas arosa שהופקה מתכני SQL של עכברים מוצגת כאן מימין. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון qPCR או ריצוף RNA כדי לענות על שאלות נוספות, כגון פרופיל ביטוי גנים מדויק יותר.

rna-isolation-pseudomonas-aeruginosa-colonizing-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Morrill, S. R., et al. מודלים של קולוניזציה נרתיקית של עכברים על ידי חיידקים שגדלו אנאירובית. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים פרוטוקול למידול קולוניזציה נרתיקית בעכברים באמצעות חיידקים אנאירוביים עמידים לאנטיביוטיקה. זה מתחיל בטיפול הורמונלי להגברת הרגישות לאפיתל, ואחריו חיסון נרתיקי וחיסון משותף בתנאים אנאירוביים. ההליך מסתיים בדגימה ותרבית לאחר החיסון כדי להעריך את קולוניזציה של חיידקים והיווצרות ביופילם.

מידול קולוניזציה של נרתיק עכברים על ידי חיידקים אנאירוביים

מקור: טיילור, מ.נ., et.al. שימוש בנתוני תולעת בודדת כדי לכמת הטרוגניות באינטראקציות חיידקיות-חיידקיות Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את החשיפה של תולעי Caenorhabditis elegans נטולות חיידקים ותואמות גיל לזן חיידקים לצורך קולוניזציה של המעי. זה מסביר את ההסרה הסלקטיבית של חיידקים חיצוניים שאינם נדבקים, ומשאירים רק חיידקים ברי קיימא דבוקים לאפיתל המעי לצורך כימות.

הערכת קולוניזציה של חיידקי מעיים ב - C. elegans נטול חיידקים

קולוניזציה של nasopharynx מורין עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס ואת החילוץ הבא של תאים חסידיים או מגויסים מתואר. טכניקה זו כרוכה בשטיפת nasopharynx ואיסוף של הנוזל דרך nares והוא מסתגל לקריאות שונות, כולל כימות תאים דיפרנציאלי וניתוח של ביטוי mRNA באתרו.

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

Wormsorter מאפשר מסכי גנטיים בelegans Caenorhabditis ידי מיון תולעים לפי ביטוי של כתבי ניאון. כאן, אנו מתארים את השימוש חדש: מיון על פי קולוניזציה על ידי פתוגן-GFP-לבטא, ואנו מעסיקים אותו כדי לבחון את התפקיד הבין היטב הכרת הפתוגן בייזום תגובה חיסונית.

הפרדה אוטומטית של<em&gt; ג elegans</em&gt; יישבו variably ידי פתוגן חיידקים

כאן, הליך מתואר להקמת זיהום מערכתי בחולדה היילודים עם תרבויות של Escherichia coli K1. הליך בלתי פולשני זה מאפשר קולוניזציה של מערכת העיכול, טרנסלוקציה של הפתוגן למחזור המערכתי, ופלישה של מערכת העצבים המרכזית במקלעת דמית העין.

דגם לא פולשנית של Neuropathogenic Coli Escherichia זיהום בעכברוש הילודים

פרוטוקול מפורט של דגם העכבר עבור enterohemorrhagic e. coli (EHEC) מושבת באמצעות חיידקים התווית על-ידי ביולומינסנציה מוצג. זיהוי חיידקים זוהרים אלו באמצעות פולשני ויוו מערכת בבעלי חיים הדמיה יכול לקדם את ההבנה הנוכחית שלנו של EHEC קולוניזציה.

זיהוי של כיבוש Escherichia Coli Enterohemorrhagic מאתר מארח על-ידי המערכת לא פולשנית In Vivo ביולומינסנציה

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה של לבודד תאים אפיתל יחיד, שלפוחית השתן נגוע של המודל מאתר של דלקת בדרכי השתן.

בידוד של אחת הקהילות חיידקי תאיים שנוצר ממודל מאתר של זיהום בדרכי השתן לניתוח תא בודד במורד הזרם

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ומשתנה של מודל העכבר של זיהום כדי להעריך את הנחת של זנים מהונדסים גנטית של הפסאודומונס aeruginosa בהשוואה לארצות הברית מינהל המזון והתרופות (FDA)-מאושר es, האנציכיה ליישומים מסחריים.

הדור של המסגרת של גן In-Frame מוטציות מחיקה ב פסאודומונס aeruginosa ובדיקת התקפה אלימה מודל עכבר פשוט של זיהום

מודל עכברי של חיסון אורופתוגני E. coli (UPEC) טרנס-urethral כדי ליצור מאגרי שלפוחית שתן תוך-תאיים סמויים וחשיפה שלפוחית השתן לאחר מכן ל - G. vaginalis כדי לגרום ל- UPEC UTI חוזר ונשנה מודגם. כמו כן הודגמו ספירה של חיידקים, ציטולוגיה של שתן, וקיבוע ועיבוד שלפוחית השתן באתרם לסריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים.

זיהום חוזר בדרכי השתן של Escherichia coli שנגרם על ידי גרדנרלה וגינליס חשיפה לשלפוחית השתן בעכברים

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הנדרשים להתיישבות בעכברים עם pks+ Escherichia coli בתנאים לא דלקתיים, וכן שיטות לא פולשניות לאימות קולוניזציה והערכת התרחבות pks+ E. coli בצואה.

התיישבות עם עכברים pks+ Escherichia coli בתנאים לא דלקתיים

למד שיטה אמינה לבידוד RNA מ-Pseudomonas aeruginosa בחולדות. הפרוטוקול כולל ליזה וחלצת חומצת פנול כלורופורם לקבלת RNA באיכות גבוהה ל-qPCR ו-RNA-seq.

RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

גלה סרטונים נוספים