RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד את ה-RNA הכולל של Pseudomonas aerogen ששוחל מ-ECMs של עכברים. הדבר מבוצע תחילה על ידי איסוף תכולת הלומן של הרצף. לאחר מכן, מבודד ה-RNA הבקטריאלי.

לאחר מכן, מבוצעים טיפול ב-D'S וניקוי של ה-RNA. לבסוף, נמדדת כמות ה-RNA ונבדקת טהרת הבידוד באמצעות bioanalyzer וניתוח ספקטרופוטומטרי. בסופו של דבר, ניתן להשיג RNA חיידקי באיכות ובכמות מספקות להערכה ניסויית המשכית, כגון באמצעות QPCR, ניתוח, פרופילינג של תעתוק או ניסויי ריצוף RNA.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיצוי טריול (triol extraction), הוא ששיטה זו משלבת מספר שלבי ליזיס בחומצה קשוחה ביותר, ושלבי מיצוי בכלורופורם, כדי להבטיח RNA באיכות גבוהה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן את שלבי הליזיס והמיצוי קשה ללמוד מכיוון שפרוטוקולים כתובים משמיטים פרטים קטנים החיוניים להצלחה. את הפרו prosedur ידגימו אדוארדו לופז מדינה, עמית פוסט-דוקטורט, ומגן נובאואר, מנהלת המעבדה, שניהם מהמעבדה שלי. לפני תחילת הקציר, IMSA מנקה מכתש מפלדת אל-חלד באמבט חנקן נוזלי.

לאחר המתת עכבר C3 HHEN בן שישה עד שמונה שבועות שהושלם בקולוניזציה של pseudomonas aerogen, הנח את בעל החיים במצב גב (supine) על לוח styrofoam והשקה את הבטן ב-95% ethanol. לאחר מכן, בצע חתך אורך במרכז העור מהסטרנום ועד לפרינאום. לאחר מכן, משוך לאחור את העור והפריטונאום וחשוף את חלל הבטן.

כעת כריתו את העੁੰגב (cecum) כולו באמצעות פינצטה. החזיקו את העੁੰגב מעל מכתש פלדת אל-חלד וגזרו את שני קצותיו בעזרת מספרי נתיחה. מלאו טיפ של פיפט פ 1000 ב-1 mL של בופר sequel flush eight, ולאחר מכן הכניסו את הטיפ לקצה הפרוקסימלי של העੁੰגב.

שטפו את ה-sequel flush eight buffer ואת התכני הלומינליים של ה-sequel אל תוך מכתש מפלדת אל חלד. כעת גרסו את תכני ה-sequel flush eight בעזרת פסטל סטרילי.

לאחר מכן, שפכו אתונול לתוך מיכל עם קרח יבש והניחו מבחנה קונוית מ 폴פרופילן בנפח 50 מיליליטר בתוך אמבט האתונול והקרח היבש. העבירו את תכולת ה-luminal הקפואה והטחונה אל המבחנה הקונוית ואחסנו את המבחנה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. סדרת השלבים הבאה היא המורכבת ביותר בפרוצדורה.

בהינתן הטבעם המורכב של החומרים המבודדים מהעוור (cecum) של MI, נדרשות חילוצים חוזרים של cold filoform על מנת להשיג אחידות ושלמות מקובלות; ייתכן שיהיו נחוצים בין שלוש לחמש חילוצים לפני שהממשק הרחב בין השכבה המימית לשכבה האורגנית ייעלם. העבירו נפח אחד של acid phenol chloroform לשפופרת צנטריפוגה של Oak Ridge בנפח 50 milliliter. הדקו את המכסה היטב ולאחר מכן חממו את השפופרה במבחן מים בטמפרטורה של 65 °C.

העבר חצי נפח של בופר ליזיס למבחנה קונית מפוליפרופילן של 50 מיליליטר, ולאחר מכן הרתח את הבופר למשך חמש דקות. לאחר הוצאת תכני ה-sequel luminal מאחסון בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius, חמם קצרות את המבחנה באמצעות שפשוף מהיר ביד ולאחר מכן הוסף למבחנה את בופר הליזיס הרותח. נער את התערובת כדי להומוגניז את תמיסת ה-SQL luminal content של בופר הליזיס.

הרתיחו את בופר הליזיס ואת תכני ה-SQL luminal למשך חמש דקות. תוך כדי ערבול (vortexing) תקופתי, פתחו את מבחנת הצנטריפוגה של Oak Ridge המכילה את תמיסת הפנול-כלורופורם והעבירו אליה את דגימת הליזיס של תכני ה-SQL. לאחר מכן, אטמו שוב את הפקק באמצעות perfil והחזירו את המבחנה למקלחת המים בטמפרטורה של 65 degrees Celsius למשך 10 דקות, תוך כדי ניעור המבחנה מדי שתי דקות.

שטפו את הדגימה ב-2,500 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C. כעת העבירו בזהירות את הפאזה המימית לשפור צנטריפוגה חדש של Oak Ridge בנפח 50 מיליליטר, תוך הימנעות ממגע עם השכבה הלבנה בממשק. לאחר מכן, הוסיפו לשפור החדש נפח שווה של acid phenol chloroform.

אטמו את הפקק בעזרת Parafilm וערבבו היטב את התכנים באמצעות וורטקס (vortex) של המבחנה במהירות גבוהה. המשיכו בצנטריפוגציה של הדגימה והעבירו את הפאזה המימית למבחנת צנטריפוגה. אם נפח הפאזה המימית העליונה הופך לקטן מדי, ניתן להעביר אותה למבחנה בעלת קוטר קטן יותר.

המשיכו בתהליך זה עד שלא יהיה ממשק לבן גלוי בין הפאזה המימית לפאזה האורגנית. כאשר הממשק הלבן ייעלם, העבירו בזהירות את הפאזה המימית למבחנה לצנטריפוגה נקייה. לאחר מכן, הוסיפו למבחנה נפח שווה של chloroform, isoamyl alcohol, סגרו את המכסה וערבבו היטב את התוכן באמצעות vortexing.

לאחר מכן, לאחר צנטריפוגה חוזרת של הדגימה, העבירו את הפאזה המימית למבחנה קונית מפּוליפרופילן בנפח 15 milliliters והוסיפו נפח שווה של isopropanol. לאחר מכן, דגרו את התמיסה בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius למשך שעתיים לפחות או למשך הלילה. לאחר דגירת הדגימה, צנטריפוגו את המבחנה למשך 45 דקות.

לאחר זיהוי המשקע בעל המרקם הג'לתי בתחתית המבחנה, הסירו את הנוזל העליון (supernatant). כעת שטפו את המשקע באמצעות 1 mL של 70% ethanol קר מאוד (בטמפרטורת קרח) על ידי ערבוב במכשיר vortex, ולאחר מכן סבבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-10,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C. לבסוף, הסירו את הנוזל העליון והפכו את המבחנה כדי לאפשר למשקע להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

לאחר מכן, השביו את משקע ה-RNA ב-200 µL של מים נטולי RNase. ראשית, הוסיפו למבחנה המיקרו-צנטריפוגית 20 µL של 10 x turbo DNA buffer ושני µL של turbo DNAset וערבבו את התמיסה בעדינות. לאחר מכן, דגרו את המבחנה בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות, הוסיפו למבחנה 20 µL של DNA inactivation reagent משוחב וערבבו היטב.

כעת הדגרי את המבחנה למשך חמש דקות נוספות בטמפרטורת החדר, תוך ערבוב מדי פעם. לאחר מכן, השקיעי את המשקע במיקרו-צנטריפוגה ב-10,000 ×g למשך 1.5 דקות, והעבירי את הנוזל העליון למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה. הוסיפי נפח אחד של פנול-כלורפורם חומצי קר למשקע, ולאחר מכן ערבבי את התמיסה היטב באמצעות וורטקס למשך דקה אחת.

לאחר סבוב של התמיסה בצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-12,500 ×g, העבירו את הפאזה המימית למבחנה חדשה והוסיפו נפח אחד של כלורופורם-איזואמיל אלכוהול. לאחר מכן, ערבבו את התמיסה באמצעות וורטקס (vortexing) וסובבו את התמיסה שוב בצנטריפוגה, תחת אותם תנאים. העבירו את הפאזה המימית למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה.

לאחר מכן, הוסיפו 0.1 נפח של סודיום אצטט בריכוז three molar ו-2.5 נפחים של ethanol 100% קר מאוד. ערבבו את המבחנה באמצעות וורטקס. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius למשך 30 דקות.

לאחר סתירה במהירות של 12,000 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, הסירו את הנוזל העליון (supernatant). לבסוף, שטפו את המשקע ב-1 ml של אתנול 70% קר מאוד. הסירו את הנוזל העליון ויבשו את המשקע באוויר למשך 10 דקות.

לאחר מכן, השביה מחדש את המשקע ב-100 µL של מים נקיים מ-RNA. ה-Agilent Bioanalyzer הוא פלטפורמה מבוססת מיקרופלואידקה לקביעת גודל, כימות ובקרת איכות של DNA, RNA, חלבונים ותאים, והוא משתמש במדד שלם של RNA המכונה RNA integrity number או RIN. RNA שחולץ באמצעות פרוטוקול זה מניב יחסי 260/280 הנעים בין 1.7 ל-2.0 וערכי RIN הגדולים או שווים ל-7.0.

דוגמה לאלקטרופורוגרמה של Agilent bioanalyzer עבור RNA חיידקי מוצגת כאן משמאל, ותמונה דמוית ג'ל של pseudomonas arosa שהופקה מתכני SQL של עכברים מוצגת כאן מימין. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון qPCR או ריצוף RNA כדי לענות על שאלות נוספות, כגון פרופיל ביטוי גנים מדויק יותר.