מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להשתמש במיקרוסקופיה של שדה בהיר (Brightfield), במיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית ובצילום וידאו בשיטת time-lapse כדי לחקור אינטראקציות דינמיות בין נויטרופילים לתאי אנדותל במהלך גיוס נויטרופילים בתגובה לחומרי משיכה כימיים של נויטרופילים in vivo. בסרטון זה, אנו מדגימים את ההליכים לשימוש במיקרוסקופיה וידאו אינטרה-ויטלית בשדה בהיר כדי להדמיות ולקביעת זחילה תוך-לומנלית של נויטרופילים, נדידה אנדותליאלית וכימותקסיס ברקמת שריר בקרב עכבר. גיוס לוקוציטים הוא סימן ההיכר של דלקת.

תהליך גיוס זה מתחיל כאשר לוקוציטים בזרם הדם מתחילים להתגלגל על האנדותל של ורידי פוסט-קפילריים באתר הדלקת. בתגובה לכימוקינים או לחומרי משיכה כימיים אחרים על פני השטח הלומנליים, לוקוציטים מתגלגלים אלו עוצרים ונצמדים בחוזקה לאנדותל. לאחר ההצמדה, לוקוציטים רבים זוחלים על פני השטח הלומנליים ונראה כי הם מחפשים אתר אופטימלי למעבר (transmigration).

בעקבות הזחילה, לויקוציטים נעים על פני האנדותל, תהליך המכונה הגירה אנדותליאלית (T endothelial migration). לאחר מכן, נויטרופילים נודדים ברקמה החוץ-כליית לעבר מקור חומר המשיכה הכימי באתר הדלקתי, תהליך הנקרא כימוטקסיס (chemotaxis MOIs). סרטון זה מציג ניסוי המדגים כיצד להשתמש במיקרוסקופיה תוך-חיה (intra vital) בשדה בהיר, בצילום רצף (time-lapse) ובתוכנת Image J כדי להדמיות, לעקוב ולקבוע זחילה תוך-לומנלית של נויטרופילים, הגירה אנדותליאלית והגירה בכימוטקסיס ברקמת שריר של Oma, ותגובה למקור חומר משיכה כימי של נויטרופילים.

שלום, אני ליס ליאו מהמחלקה לפרמקולוגיה בפקולטה לרפואה באוניברסיטת ססקצ'ואן. היום נראה לכם כיצד ליצור מעקב כימואטקטי של נויטרופילים בתוך ג'ל אגרו. כיצד להכין שריר רב-ראשי של עכבר עבור מיקרוסקופיה תוך-חיה.

כיצד לעקוב אחר תנועת תאים באמצעות MEGJ. ולבסוף, כיצד לנתח את פרמטרי גיוס הנויטרופילים. שני סטודנטים לתואר שני במעבדה שלנו, ngel Naja, sh, ו-Chile, ידגימו לכם את ההליכים הניסיוניים המפורטים. היי, אני Naja Sh. היי, אני Chile.

כדי להתחיל בניסוי זה, הכינו ראשית חומר למשיכת נויטרופילים (chemo attractant) בג'ל אגרו: פפטיו 10 milliliters של PBS בריכוז פי 2 לתוך מבחנה קונית של 50 milliliter. חממו את המבחנה על ידי הנחתה בתוך כוס כימית המכילה מים חמים. פפטיו 10 milliliters של מים מזוקקים.

הוסיפו 0.4 גרם אבקת agarose למבחנה קונית של 50 מיליליטר. חממו את התערובת בתנור מיקרוגל עד לרתיחה קלה כדי להכין 2% agarose ב-PBS. הוסיפו 2X PBS חמים למבחנה המכילה את תמיסת ה-agarose.

סובב את התמיסה המעורבבת ושמור אותה חמה בכלי עם מים חמים. ערבב היטב את תמיסת מושך הכימיה (chemo attractant) עם 3 µL של דיו הודו (India Ink) במכסה של מבחנה פמיקריס (eppendorf) בנפח 1.5 mL. הימנע מיצירת בועת אוויר במהלך הערבוב.

גזרו את קצה התוך של טיפ למטריצה של 200 µL ומיקרו-פיפט. העבירו 110 µL של תמיסת agro בטמפרטורה של 42 °C אל המכסה וערבבו מיד היטב. באמצעות טיפ פיפטה אחר, אחסנו ג'ל זה המכיל חומר משיכה כימי במקרר עד לשימוש. הרדימו עכבר זכר בוגר באמצעות הזרקה IP של תערובת של xylazine ו-ketamine.

גלחו את האזור מעל הווריד הג'וגולרי החיצוני הימני ואת החלק הקדמי של השכין. השתמשו במכונת גילוח חשמלית לאחר ההרדמה; חשוב להעניק תשומת לב וטיפול מיוחד לעכבר המורדם. ניתן להשתמש במנורת חימום כדי למנוע מהעכבר היפותרמיה.

העכבר צריך להיות חסר רפלקס של כאב. בצעו חתך אופקי, אתרו והחדירו קטטר לוריד הג'וגולרי (jugular vein) באמצעות צינור PE 10 מלא בתמיסת סלין עם Heparin בריכוז של 100 units per milliliter. חברו את הלוח למסחרר מים בטמפרטורה של 37 °C כדי לשמור על שריר הקרמסטר (cremaster muscle) ועל גוף העכבר חמים.

קבעו את רגליו האחוריות של העכבר באמצעות סרטי טבור, כאשר העכבר שוכב על גבו על לוח שריר הקרמסטר. בצעו חתך בעור השכין כדי לחשוף את שריר הקרמסטר השמאלי. דלקו בזהירות את השריר מהפציה הנלווית.

שטפו את שריר הקרמסטר (cremaster muscle) במי מלח עם בופר ביקרבונט המחוממים ל-37 °C. קשרו תפר 4.0 בקצה הדיסטלי של שריר הקרמסטר כדי לקבע אותו על מעמד זכוכית הצפייה השקוף של לוח שריר הקרמסטר. בצעו כריתה בקוסיקה (cauterization) לאורכית של שריר הקרמסטר באמצעות מכשיר כריתה עם תפר 4.0.

החזיקו את השריר בצורה שטוחה ואבטחו אותו לאורך הקצוות על גבי המעמד. הפרידו את האשך ואת האפידידימיס מהשריר שמתחתיהם והזיזו אותם אל תוך חלל הבטן. מרחו שכבה דקה של גריז ואקום לקצוות נגדיים של זכוכית כיסוי בגודל 22 על 22 מילימטר.

לאחר מכן, כסו את השריר החשוף באמצעות לבישת זכוכית. הניחו את לוח השרירים הראשי עלבמת המיקרוסקופ. בחנו את השריר תחת המיקרוסקופ ואתרו וריד פוסט-קפילרי מתאים.

בחרו את כלי הדם בעל קצב גזירה נורמלי וקוטר שבין 25 ל-40 micrometers. כווננו את מצלמת הווידאו כך שניתן יהיה להדמיות את כלי הדם בעמדה אנכית, בקצה הימני או השמאלי של מסך הטלוויזיה. לאחר 30 דקות, הקליטו את תמונות הווידאו של כלי הדם הפוסט-קפילרי שנבחר כנתוני ביקורת בסיסיים (baseline control), באמצעות מכשיר הקלטת וידאו כגון מקליט DVD.

אלו הן תמונות הווידאו של ביקורת הבסיס של הווריד הפוסט-קפילרי. לפני הנחת הג'ל המכיל חומר מסבב כימי (chemo attractant) על פני שריר הקרמסטרי, הפסיקו את הסופרפוזיה והסירו את לוחית הזכוכית. השתמשו במיקרו-מנקב כדי להוציא גליל בגודל של 1 מילימטר מעוקב של ג'ל המכיל חומר מסבב כימי ממכסה של מבחנת אפנדורף. באמצעות קצה חתוך של טיפ פיפט של 200 µL, הניחו את הג'ל המנקב המכיל חומר מסבב כימי על פני שריר הקרמסטרי באזור שנבחר מראש, במרחק של 350 µm מהווריד הפוסט-קפילרי הנצפה.

הוסיפו זכוכית כיסוי כדי להחזיק את הג'ל במקומו, ובצעו perfuse לרקמת השריר בקצב איטי מאוד, שאינו עולה על 10 µL לדקה, כדי לאפשר ביסוס של מדרג (gradient) של חומר מושך כימי (chemo attractant) המשתחרר לאט ונוצר מהג'ל. הקליטו את תמונת הווידאו למשך 90 דקות לאחר הוספת הג'ל המכיל את החומר המושך הכימי. במהלך ההקלטה, כווננו ושמרו על מיקוד המיקרוסקופ על הלוקוציטים הנצמדים, הזוחלים, העוברים תהליך של transmigrating ו-chemotaxing בתוך הכלי וברקמת השריר.

בסיום הניסוי, ייבאו את קובץ הווידאו למחשב. לצורך ניתוח במחשב, חלצו והמירו את הווידאו לפורמט AVI. לדוגמה, ניתן להשתמש בתוכנה החינמית bit ripper כדי להמיר וידאו מ-DVD לקובץ AVI.

השתמש בתוכנה לעריכת וידאו, לדוגמה Windows Movie Maker, כדי ליצור סרטון time-lapse מהסרטון המקורי בזמן אמת, המר ושמור את סרטון ה-time-lapse בפורמט DV A VI. הקלט תמונות של מיקרומטר כיול תחת אותן הגדרות מיקרוסקופ. ייבא את התמונות למחשב.

פתחו את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ. מדדו את גודל המסך הן בציר X והן בציר Y וחשבו את מספר הפיקסלים למיקרומטר. כדי לייבא את הסרטון, פתחו את ImageJ. שוב, לחצו על file import באמצעות תוסף QuickTime movies, בחרו את הסרטון לניתוח ולחצו על okay בממשק פתיחת סרטוני QT, ולחצו על plugins. לביצוע מעקב ידני אחרי התאים (Manual tracking), מלאו את המידע הרלוונטי בשדות בתחתית המסך לפני תחילת המעקב; את הפרמטרים הבאים יש לקבוע לפני תחילת מעקב הזמן.

המרווח בשניות הוא משך הזמן הכולל חלקי 30, כיול xy הוא מדידת המיקרומטר לפיקסל מכיול תמונת המיקרומטר, כיול Z מוגדר על אפס, וגודל ריבוע החיפוש למרכוז שווה לאחד. יש לבחור בסרטון המוקלט נקודה יציבה וברורה כנקודת ייחוס. נקודת ייחוס זו יכולה להיות כל נקודה מבנית ברורה וקטנה שנותרת ללא שינוי ויציבה לאורך כל הניסוי.

לחצו על add track כדי לעקוב אחר נקודת הייחוס מהפריים הראשון ועד האחרון. לאחר מכן, לחצו ועקבו אחר נויטרופילים זוחלים ונודדים אחד אחד. לחצו על add track כדי לעקוב אחר התא מרגע הופעתו ברקמה ועד להיעלמותו בכל פריים.

לאחר מכן לחצו על track כדי לסיים ושמרו את התוצאות ב-Microsoft Excel. פתחו את קובץ התוצאות ב-Microsoft Excel והתחילו בניתוח הנתונים.

חשוב לכלול את תנועות נקודת הייחוס בניתוח. בעת מעקב אחר זחילה של נויטרופילים ובחלל הלומן, אנו קובעים את מרחק הזחילה ומהירות הזחילה של הנויטרופילים ובחלל הלומן. בעת ניתוח נדידה טרנס-אנדותליילית של נויטרופילים, אנו מודדים את זמן הנדידה הטרנס-אנדותליילית ואת זמן הניתוק.

בעת קביעת כימוטקסיס של נויטרופילים ברקמת שריר, אנו מודדים את המרחק ואת המהירות של נדידת הנויטרופילים והכימוטקסיס בשריר, וכן קובעים את מדד הכימוטקסיס במהלך כימוטקסיס של נויטרופילים ברקמת שריר. הגדרות הפרמטרים הללו המופיעות על המסך מפורטות בפרוטוקול הכתוב שלנו. בניסוי זה, אנו מדגימים את ההליכים לשימוש במיקרוסקופיה תוך-חיה (intravital) בשדה בהיר כדי להדמיות ולקביעה של זחילה תוך-לומנלית של נויטרופילים, נדירה אנדותליאלית ונדירה בכימוטקסיס.

בתגובה למשיכי כימותרפיה של נויטרופילים in vivo, השתמשנו ב-MIP two CX CL two או בפפטיד סינתטי W-K-Y-M-V-M שהוכנו באגרו-ג'ל כדי להשרות גיוס נויטרופילים ברקמת שריר CMA של עכבר. כפי שניתן לראות מדמות זו, MIP two בריכוז 0.5 MICROMOLAR ו-W-K-Y-M-V-M בריכוז 0.1 millimolar עוררו זחילה תוך-לומית של נויטרופילים במהירויות דומות. הנדידה הטרנס-אנדותל Swimming של הנויטרופילים וההיפרדות מהוריד היו דומות באורך הזמן.

שני חומרי המשיכה הכימיים הללו גרמו גם הם לנדידת נויטרופילים ולכימותקסיס ברקמת שריר במהירות דומה כמעט ועם מדדי כימותקסיס דומים של נויטרופילים. מיקרוסקופיה תוך-חיה (Intravital microscopy) היא כלי בעל ערך לתצפית ישירה על תהליך גיוס הנויטרופילים ולעבור קביעה כמותית של תפקודי התאים והמולקולות בכל שלב של הגיוס. באמצעות צילום וידאו במרווחי זמן (time-lapse) ותוכנת Image J, ניתן למדוד זחילה תוך-לומנלית, נדידה אנדותליאלית ונדידה בכימותקסיס של לוקוציטים ורקמות תחת מיקרוסקופיה תוך-חיה בשדה בהיר, תוך שימוש במעכבים סלקטיביים, עכברים טרנסגניים וחומרי משיכה כימיים סלקטיביים.

מערכת הבדיקה יכולה לסייע לנו לחשוף את תפקידיהם של חלבונים ספציפיים בגיוס לוקוציטים.