Name: הגנום כולו מסך עבור מטרות מירנה שימוש יעד המשימה ספריית מזהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: למד כיצד לזהות מטרות miRNA בגנום שלם באמצעות ספריית Target ID. שיטה זו משתמשת בזיהוי תאים יציבים ובריצוף עמוק כדי לחשוף אינטראקציות גנטיות ולקדם מחקר בגנומיקה וביולוגיה מולקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים המדע כולו Sigma החיים המשימה יעד מזהה ספריית פיתוח צוות, במיוחד קווין Gutshall למציאת טכנולוגיה משא ומתן תנאי הרשיון, והת&#39;ר Holemon על התמיכה שלה והשתתפות בדיונים לפתרון בעיות פוריות. כמו כן, אנו מודים לד&quot;ר יופ Gäken של לונדון בקינגס קולג&#39; בחופשיות על שיתוף שלא פורסמו התוצאות והצעות ו Qazi חמיד של RxBiosciences להכנת המנה הגדולה של cDNA וההתמדה שלו מקבל את זה משובטים. ברצוננו להודות נאן לין סקוט באהר מ SAFC לביצוע מערכי cDNA וניתוח נתונים. המשימה הוא סימן מסחרי רשום של Sigma-Aldrich ביוטכנולוגיה LP

<ol><li>Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigma-aldrich.com">http://www.sigma-aldrich.com</a> (2012).</li>
<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li>
<li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li>
<li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+microRNAs%3A+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li>
<li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperately+seeking+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li>
<li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li>
<li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li>
<li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li>
<li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-221+and+miR-222%2C+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas%2C+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noncoding+RNA%2C+miR-126%2C+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chrom.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li>
<li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li>
<li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.</li>
<li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620(2009).</li>
<li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8%2F200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li>
<li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP%5BTitle%5D)+AND+%22L.+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li>
<li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים יחסים כלכליים עם גורמים מסחריים בעלי עניין בעבודה שהוגש.

מיקרו RNA הם 20-24 RNAs נוקלאוטיד המווסתים ביטוי גנים לאחר תעתיק של התרגום מעכב mRNA, ולעתים קרובות, ערעור היציבות mRNA ממוקד (בדיקה ב [6]). מירנה אחד יכול לווסת כמה מאות mRNAs לשלוט התגובה של התא אותות התפתחותיים וסביבתיים. זיהוי ואימות mRNAs יעד הכרחי בקביעת התפקיד של מירנה ותפקוד במסלולים אלה. עם זאת, זיהוי המטרה היא לא פשוטה, כי אצל בעלי חיים, miRNAs ואתרי היעד שלהם הם לא משלים באופן מלא. &quot;הזרע&quot; באזור, מבסס 2 עד 7 מסוף 5&#39;-של מירנה, הוא בדרך כלל משלים מטרותיו. עם זאת, יש הרבה יוצאים מן הכלל זרע, במורד בסיס ההתאמה יכול לפצות על התאמה מושלמת זרע. מספר אלגוריתמים פותחו לחזות מטרות מירנה על בסיס התאמה זרע ופיצוי במורד הזרם, מבנה היעדעמדת D, שימור הרצף, ופרמטרים נוספים שונים נצפו על מטרות תוקף הניסוי (בדיקה ב [7]). בעוד סיליקו תחזיות נוח ולעשות רבות לזהות מטרות מירנה חוקיים, רובם חזו גנים להיכשל בדיקות אימות ניסיוני, ויעדים בפועל רבים אינם חזה. יתר על כן, מאז אלגוריתמים מבוססים על תכונות היעד שנקבעו קודם לכן, הם אינם מאפשרים גילוי של מטרות החורגות ממה שכבר ידוע. מספר מערכות ניסיוניות שימשו בהצלחה לזהות או לגלות מטרות תפקודיות מירנה בתאים חיים. אלה שיטות ההקרנה גלובליים כוללים microarrays ו-RNA רצף, RNA שיתוף immunoprecipitation (RIP), וסימון איזוטופ יציב עם חומצות אמינו תרבית תאים (SILAC), שיטה proteomic (בדיקה ב [7]). לכל שיטה יש יתרונות וחסרונות. מאז מירנה מיקוד לעתים קרובות מערערת mRNA מוביל לזילות שלו, אובדן oרווח R ברמת mRNA לאחר החדרת מירנה לחקות או מעכב, בהתאמה, יכול לזהות מטרות מירנה. הפסד זה או רווח של mRNA מזוהה בקלות על ידי microarray או רצף עמוק. תוך גילוי שיטות mRNA הם פשוט רגישים יותר מאשר שיטות זיהוי חלבונים, זיהוי ה-mRNA יחמיץ שום מטרות מירנה שאינם מפורקים. דיווחים אחרונים של המעבדה Bartell השוואת יעד תוצאות מירנה מ איתור RNA עם אלה SILAC [8] או פרופיל הריבוזום [9] מצביעים על כך miRNAs יונקים בעיקר לפעול על ידי הפחתת רמות ה-mRNA המטרה. עם זאת, מעבדות רבים אחרים העובדים עם מטרות מירנה בודדים לא זוהה שינוי בחלבון אך לא חל שינוי ברמת ה-mRNA. דיווחים על מה שנראה תקנה translational ללא אובדן mRNA לגילוי כוללים: miR-10b על HOXD10 [10], miR221/222 על p27kip1 [11], miR-21 על Pdcd4 [12], miR-126 על p85β [13] , miR-34 על SIRT1 [14], miR-21 על PTEN [15], miR-302d על Arid4b [16], miR-200C על JAG1 [17], ו miR-299, 297, 567,nd 609 על VEGFA [18]. יתר על כן, קלנסי ואח&#39; [19] לאחרונה דווח כי תקנה translational ידי בואו-7 התגלתה רק כאשר isoforms mRNA בודדים המכילים את האתר בואו-7 היעד התגלו באופן סלקטיבי. זה האחרון מצביע על כך, לפחות בחלק מהמקרים, רגולציה translational ניתן להתעלם בפרופיל מרוכבים - כלומר, כאשר כל isoforms mRNA מזוהים כמו mRNA 1 - כפי שנתקבל עם microarray רבים וניתוחים ברצף. שיתוף immunoprecipitation של מירנה-mRNA באמצעות מתחמי argonaute (בדרך כלל ago2) או חלבון אחר הקשור (RNA immunoprecipitation, או RIP) יהיה לבודד את מטרות מירנה ללא קשר מנגנון ויסות. בנוסף, RIP מזהה אנדוגני, ומן הסתם רלוונטי מבחינה ביולוגית, אינטראקציות. עם זאת, לא ידוע אם כל מירנה-mRNA אינטראקציות הם פונקציונליים, ולקרוע יחמיץ שום מטרות mRNA כי מקשרים רק זמני או מפורקים במהירות. יתר על כן, ספציפיים מירנה-mRNA שותפים יש להסיק bioinformatiקאלי משום שכל מירנה-mRNA זוגות שיתוף זירז יחד. לבסוף, SILAC ישירות מזהה את המוצר הסופי של התקנה מירנה, החלבון עצמו, אבל הוא לא רגיש ועל כן מתגעגע חלבונים נדירים ושינויים לקפל קטנים רמות החלבון. לאור המגבלות הנוכחיות עם מירנה היעד שיטות הזיהוי, הרגשנו assay גלובלית נוספת כדי לזהות מטרות מירנה תפקודית על ידי מנגנון חלופי היה צורך. כדי למלא את הצורך הזה, אנחנו רישיון טכנולוגיה שהומצאה על ידי יופ Gaken ו עזים Mohamedali של לונדון בקינגס קולג&#39;. ההמצאה שלהם הוא חלבון כפול היתוך הבחירה, באופן ספציפי, שילוב kinase-zeocin תימידין, מוסדר על ידי ספריית cDNA של פוטנציאל היעד רצפים מירנה ב 3&#39;UTR שלה. תאים transfected ביציבות עם ולבטא TKzeo-cDNA בונה ניתן לבחור עם zeocin, כפי שמודגם באיור 2. לאחר הבעת עניין מירנה, מטרות של מירנה ניתן לבחור אינטרנטganciclovir ה, כפי שמודגם באיור 3. Ganciclovir הורג תאים להביע תימידין קינאז, כלומר, כל התאים לבטא TKzeo-cDNA חסר מטרה מירנה של עניין. ממוקד cDNA יכול להיות מבודד על ידי הגברה PCR של ה-DNA של תאים ששורדים primers באמצעות ganciclovir כי האגף מוצרים cDNA ו PCR יכול להיות רצף לזהות מטרות. פיתחנו טכנולוגיה במכללת המלך לתוך כלי חדש לזיהוי הגילוי העולמי של מטרות תפקודיות מירנה אדם - יעד המשימה ספריית מזהה. עם הספרייה מזהה מטרה, משתמשים יכולים לבודד את מטרות מירנה על ידי שורה של transfection התרבות יונקים התא ובחירת צעדים סמים. הספרייה היא מקיפה, והוא מכיל 66-79% מכלל הגנים האנושיים. תוצאות ראשוניות מצביעות על כך גם גילה בעבר, כמו גם מטרות חדשות יכול להיות מבודד ספריית יעד המשימה מזהה. אף על פי הפרוטוקול הוא באורך כלשהו,שימוש בספריית מזהה יעד מחייב תקן טכניקות מעבדה מולקולרית - תרבית תאים transfection יונקים,, בחירת התרופה, PCR, וסדר - ולכן, צריך להיות גם במסגרת האמצעים של רוב הביולוגים. אנו מציעים תשומת לב מספקת ישולם עיצוב ניסיוני נכונה, אופטימיזציה של תנאי התרבות, והכי חשוב, לפני בדיקה של כל סוג תא חדש כדי לקבוע רמות התרופה האופטימלי עבור צעדים הבחירה (kill של עקומות) כדי להבטיח הצלחה עם ספריית מזהה מטרה. כמו בכל יעד מירנה שיטות הזיהוי, מומלץ מאוד כי מטרות שזוהו על ידי הקרנת ספריית מזהה מטרה להיות מאומת עם השיטה השנייה, כגון microarray, qRT-PCR, assay הכתב (כלומר, בלוציפראז), או ניתוח המערבי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> התחלה מהירה REDTaq רדימיקס </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Ganciclovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo ת&quot;א </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute היונקים הדנ&quot;א הגנומי Miniprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> Nucleofection ספציפי תא kזה </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> היעד מזהה הספרייה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

הגנום כולו מסך עבור מטרות מירנה שימוש יעד המשימה ספריית מזהה

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

ספריית מזהה יעד נועד לסייע מטרות גילוי וזיהוי של microRNA (מירנה). ספריית מזהה היעד הוא פלסמיד מבוסס, הגנום כולו ספריית cDNA משובטים לתוך הזרם 3&#39;UTR של חלבון מבחר כפול היתוך, תימידין קינאז-zeocin (TKzeo). הסיבוב הראשון של הברירה היא transformants יציבות, ואחריו עם הקדמה של מירנה עניין, ובסופו של דבר, בחירה עבור cDNAs המכילים היעד של מירנה. CDNAs נבחרים מזוהים על ידי רצף (ראה איור 1-3 עבור זרימת עבודה מזהה ספריית היעד לפרטים נוספים). כדי להבטיח כיסוי רחב של transcriptome האנושי, יעד מזהה ספריית cDNAs נוצרו באמצעות תחול oligo-DT באמצעות מאגר של RNA הכל מוכן מרקמות אדם מספר רב של שורות תאים. וכתוצאה מכך מגוון cDNA מ 0.5 עד 4 קילו, עם גודל ממוצע של 1.2 קילו, והיו משובטים לתוך כפול מבחר p3TKzeo פלסמיד (ראה איור 4 על מפת הפלסמיד). הגן מטרות המיוצגות library ניתן למצוא באתר האינטרנט Sigma-Aldrich. תוצאות Illumina רצף (לוח 3), עולה כי הספרייה כולל 16,922 של 21,518 גנים ייחודיים UCSC RefGene (79%), או 14,000 גנים עם 10 או יותר קורא (66%).

ספריית מזהה היעד הוא פלסמיד מבוסס, הגנום כולו אוסף של cDNA משובטים לשמש לזיהוי מטרות מירנה. כאן אנו מדגימים את השימוש והיישום.

ספריית Target ID נועדה לסייע בגילוי ובזיהוי של מטרות למיקרו-RNA (miRNA). ספריית Target ID מבוססת על פלסמיד, ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע סריקה של תאי מטרה של micro RNA בפריסה גנומית ובספיקות גבוהה באמצעות ספריית target ID. דבר זה מושג באמצעות טרנספקציית תאים עם פלסמיד הספרייה. לאחר טרנספקציה של אוסף CDNAs משובטים בפריסה גנומית, תבוצע ברירה של שורות תאים יציבות.לאחר מכן, התאים של הספריה המוקמת עוברים טרנספקציה עם מבנה ביטוי של micro RNA כדי לאפשר ביטוי משותף של מטרה ל-micro RNA ושל thymidine kinase. בשלב זה, נעשה שימוש ב-ganciclovir כדי לבחור תאים המבטאים מטרות ספציפיות של micro RNA, על ידי ברירה נגד ביטוי של thymidine kinase. לאחר מכן, ה-CD NA המכילים אתרי מטרה של micro RNA עוברים הגברה באמצעות PCR בעזרת פריימרים להגברת ה-target ID, במטרה לרצף ולזהות את מטרות ספריה ה-micro RNA.בסופו של דבר, מתקבלים תוצאות המזהות מטרות micro RNA ספציפיות בתאים על בסיס אנליזה של ריצוף עמוק (deep sequencing). ספריית זיהוי מטרות השליחות נועדה לסייע בגילוי ובזיהוי של מטרות גנים עבור micro RNA. כאן אנו מדגימים את השימוש בה ואת יישומה.לפני תחילת פרוטוקול זה, בחרו שורת תאים שאינה מבטאת, או מבטאת רמות נמוכות של ה-IRA הרלוונטי, ורבּו את התאים עד להשגה של כ-2×10⁷ תאים ב-80% confluence. לאחר טיפול בטריפסין, העבירו את התאים למבחנה סטרילית עם מכסה הברגה בנפח 15 milliliters ומרכזו את התאים המטופלים בטריפסין ב-200×g למשך חמש דקות. לאחר הסרת המדיום, השביו את משקע התאים לצורך שטיפה, צנטריפוגו את התאים שוב וחזרו על השטיפה פעם שנייה.במקביל, הכינו מספיק מבחנות של 0.5 מיליליטר עבור מספר התעתוקים (transfects) על ידי הוספת שני מיקרוגרם של ספריית ה-ID של היעד לכל מבחנה. כעת, השעו מחדש את משקע התאים בתוך מבחנת ה-15 מיליליטר באמצעות 600 מיקרוליטר של תמיססת maxim Nucle affection לכל תעתוק. בצעו זאת עבור תגובה אחת בכל פעם.הוסיפו 100 µL של תאים למשבצת, ושני מיקרוגרמים של פלסמיד, תוך ערבוב באמצעות קצה הפ pipette. העבירו כל תערובת ל-nuclear effector vete. הכניסו vete אחד למכשיר ה-nuclear effector והפעילו תוכנית מותאמת המתאימה לסוג התאים.בשלב הבא, מלאו פיפטת העברה במצע שחומם מראש. שאבו את התאים שעברו טרנספקציה לאותה פיפטה והעבירו אותם לבאר אחת בלוח שש בארות שהוכן מראש. חזרו על תהליך זה עבור כל NU nuclear affection בעקבות NU nuclear affection.החזירו את התאים לתא הגידול לדגירה למשך לילה. למחרת, החליפו את המצע ואפשרו לתאים להתאושש במשך שלושה עד חמישה ימים. לאחר שהתאים התאוששו, הסירו את המצע והוסיפו מצע מלא המכיל את רמת ה-eosin המתאימה, כדי לבצע ברירה לשילוב יציב וביטוי של חלבון היתוך TKZO.ניתן לקבוע מראש את ריכוז ה-eosin כפי שמתואר בטקסט. יש לעקוב אחר התאים לצורך ברירה באמצעות eosin על ידי בדיקת חיוניות התאים. יש להחליף את המצע במצע רענן המכיל eosin מדי יומיים עד שלושה ימים.ברגע שהתאים הגיעו למצב של התמזגות (confluent) בצלחת שש-הבארות, העבירו את מאגר התאים והרחיבו אותם לבקבוקים גדולים יותר. ביצוע ניתוח עקומת הריגה (kill curve) נועד לקבוע את המינון הקטלני המינימלי עבור ריאגנטים הסלקציה המשמשים במחקר. כדי למנוע תגובות פנוטיפיות לא רצויות בעת ביצוע עקומות הריגה, זרעו תחילה את התאים בכל בארה של צלחת 96-בארות המכילה 120 µL של מצע טרי, וביצעו את השלב הבא למחרת.הוסף תרופה לבארות הנבחרות. אנטיביוטיקה G418 או PureMycin משמשות לבחירה עבור אינטגרציה של קונסטרקט ביטוי miRNA, או שנעשה שימוש באסיקלוביר (acyclovir) כדי לבחור נגד ביטוי של תימידין קינאז (thymidine kinase). במהלך האינקובציה, בחן את חיות התאים עבור כל ריכוז של התרופה מדי יומיים. החלף את המצע המכיל את סוכן הבחירה מדי שלושה ימים.יש להשתמש בריכוז המינימלי של ריאגנט הברירה הגורם למות תאים מלא לאחר הזמן הרצוי עבור סוג התאים והניסוי המדובר, לאחר שריכוזי התרופות נקבעו. הכין את ה-MI לטרנספקציה על ידי גידול והתרחבות של תאי ספריית ה-ID המיועדים להגעה למספר של two times 10 to the seventh תאים. בצע trypsinization כאשר התאים נמצאים ב-80%Co fluency ומעלה.העבירו את התאים למבחנה סטרילית עם פקק הברגה בנפח 15 מיליליטר והשקיעו אותם ב-200 ×g למשך חמש דקות. הסירו את המצע ושטפו את משקע התאים פעמיים כפי שנעשה קודם לכן. לאחר מכן, עבור כל טרנספקציה, הוסיפו שני מיקרוגרם של פלסמיד הביטוי MIRA למבחנה בנפח 0.5 מיליליטר.בצע החדרה גרעינית (NU nuclear affection) של ה-mRNA לתאי הספריה באותה שיטה ששימשה לטרנספקציה של ספריית ה-ID של המטרה. לאחר שהתאים התאוששו במשך שלושה עד חמישה ימים, החלף את המצע במצע מלא המכיל את רמת האנטיביוטיקה המתאימה, כפי שנקבע מבדיקת עקומת ההריגה (kill curve test).עקוב אחר התאים לצורך סלקציה של אנטיביוטיקה, והחלף את המצע במצע המכיל את האנטיביוטיקה מדי יומיים עד שלושה ימים. לאחר הגעה למצב של התלכדות (confluence) בפלטת שש הבארות, העבר את מאגר התאים והרחב אותם לבקבוקים גדולים יותר. כפי שנעשה קודם לכן, החלף את המצע במצע טרי המכיל את הרמות המתאימות של GCV ואנטיביוטיקה.יש לעקוב אחר התאים כדי לבדוק ביטוי של thymidine kinase וביטוי mRNA באמצעות בדיקת חיוניות תאים, ולהרחיב את התאים ששרדו בנוכחות GCV ואנטיביוטיקה. לאחר מכן, יש להכין DNA גנומי מהתאים שנבחרו באמצעות GCV. יש לבצע הגברה ב-PCR של מקטעי הספרייה שנבחרו בעזרת הפריימרים של הערכה, ולבצע להם סב-קלונינג כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.ניתן לבצע תגובות ריצוף באמצעות פריימרים להגברה. כשלב סופי, זהו את יעדי הגנים על ידי יישור blast של הרצפים מול התרנסקריפטום האנושי עבור תמלילים ידועים ומול הגנום האנושי עבור תמלילים חדשים. קונסטרוקט המבטא mere 3 73 הועבר בטרנספקציה יציבה לספריית MC seven ונבחר במצע המכיל ganciclovir כדי להעשיר תאים המבטאים יעדי mere 3 73.ל-GCV אין השפעה על תאי MCF שבע ללא ספרייה מכיוון שאינם מבטאים תימידין קינאז. לעומת זאת, תאי ספרייה C שבע אכן מבטאים תימידין קינאז אך אינם נהרגים לחלוטין על ידי ganciclovir בריכוז של 8 או 16 µM, כפי שמעידה ספיגת brilliant blue על ידי התאים החיים. עם זאת, תאי הספרייה מפסיקים לגדול ב-GCV, כפי שעולה מצבע צבען הפנול אדום במצע שלהם.התאים שנעצרה צמיחתם אינם מחמיצים את המצע שלהם והצבע נשאר אדמדם. במקום שישנה לאורנג', בודדו רצפי מטרה צהובים מהתאים ששרדו. אלו הועשרו באמצעות PCR ועברו ריצוף.התקבלו כמעט 12 מיליון קריאות cDNA שמופו לכמעט 12,000 גנים ייחודיים. מתוך גנים ייחודיים אלו, 234 נחשבו לפגיעות (hits) מהימנות על סמך תדירות הפגיעות והיו ספציפיים ל-mere 3 73. השוואה ראשונית מצאה כי 10 מהגנים הייחודיים שזוהו באמצעות ספריית ה-target ID מופיעים גם ברשימה של מטרות mere 3 73 שזוהו בעבר ב-tar base.לפיכך, עשרה אלו הם ככל הנראה יעדים תקפים של 3 73, והם נמצאים כעת באפיון לצורך תיקוף ניסיוני של פגיעות נבחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בספריית מזהי יעדי המשימה כדי לבצע סריקה רחבה של הגנום בעקביות גבוהה עבור יעדי גנים של micro RNA.

genome-wide-screen-for-mirna-targets-using-mission-target-id

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו להשתמש בספריית esiRNA האדם המסך תפוקה גבוהה עבור גנים המעורבים חלוקת התא. אנו מדגימים כיצד להקים ולנהל מסכי esiRNA, וכן כיצד לנתח ולאמת את התוצאות.

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

כאן אנו להשתמש בספריית LentiPlex האנושי ונקווה המסורתית רצף שיטות לזיהוי מטרות הגן לקידום הישרדות התא. אנו מדגימים כיצד להגדיר deconvolute מסך LentiPlex ולאמת את התוצאות.

LentiPlex המשימה משולב הקרנת shRNA ספריית בתאי יונקים

מיקרו RNA (miRNAs) הם הרגולטורים החשובים של ביטוי גנים הוכחו לשחק תפקיד תהליכים ביולוגיים רבים. כדי להבין טוב יותר מירנה-UTR אינטראקציות, יצרנו אוסף גנום רחב של 3 כתבים UTR בלוציפראז יחד עם הגן בלוציפראז הרומן מגיב assay, מערכת LightSwitch.

זיהוי מטרות של רנ&quot;א האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3&#39;UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד

זיהוי זוהר של אלמנטים פונקציונליים ב-3' אזורים לא מתורגמים (3'UTRs) (3'LIFE) היא טכניקה לזיהוי ויסות פונקציונלי ב-3'UTRs על ידי miRNAs או גורמים רגולטוריים אחרים. פרוטוקול זה משתמש במתודולוגיה בעלת תפוקה גבוהה כגון טרנספקציה של 96 בארות ומבחני לוציפראז כדי לסנן מאות אינטראקציות משוערות לדיכוי תפקודי.

זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3&#39;LIFE

זיהוי מטרות תרופות חדשות שעוברות מניסויים פרה-קליניים לניסויים בבני אדם הוא בראש סדר העדיפויות המדעי. לשם כך, אנו מתארים כאן גישה גנומית פונקציונלית לבחינת ההשפעה של דלדול גנים על ספרואידים בקו תאים סרטניים, אשר מודלים בצורה מתאימה יותר סרטן אנושי in vivo.

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

דו ח זה מתאר שיטה מהירה ואמינה עבור אימות מטרות mRNA miRNAs הסלולר. משתמשת בשיטה biotinylated סינתטי מבוססת מגבר קדם חומצת גרעין נעול miRNA מחקה ללכידת המטרה mRNA. לאחר מכן, מצופים streptavidin beads מגנטי מועסקים הנפתח המטרה mRNA על כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז qPCR.

הנועד מבוסס-ביוטין הנפתח Validate mRNA miRNAs מטרות של הסלולר

המתואר כאן הוא פרוטוקול לאפיון מודולים של miRNAs ביולוגית מירסטים וההרכבה שלהם לתוך טרנסגנים קצרים, אשר מאפשר ביטוי יתר בו של טיפול גנטי יישומים.

אפיון של miRNAs הקשורים פונקציונלית ב גלינובלסטומה וההנדסה שלהם לאשכולות מלאכותיים עבור טיפול גנטי

כאן אנו מציגים צינור miRNA חדש ואוטומטי לחלוטין, mirMachine ש-1) יכול לזהות miRNAs ידועים וחדשניים בצורה מדויקת יותר ו-2) הוא אוטומטי לחלוטין וזמין באופן חופשי. משתמשים יכולים כעת לבצע סקריפט הגשה קצר כדי להפעיל את צינור mirMachine האוטומטי לחלוטין.

mirMachine: חנות אחת לביאור miRNA צמחי

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה של עריכת גנים של גנים חוזרים פלינדרומיים קצרים (CRISPR) בתפוקה גבוהה, המקובצים באופן קבוע, עבור ניתוח רשת של אשכולות מיקרו-רנ"א, המאפשרת ייצור מהיר של פאנל של קווי תאים מהונדסים גנטית הנושאים שילובי מחיקה ייחודיים של חברי אשכול miRNA בגודל של עד 35 קילו-בתים בתוך ניסוי יחיד.

כלי עריכת גנים CRISPR לניתוח רשת אשכולות מיקרו-רנ"א

פיתחנו גישה אונקוגנומית השוואתית חוצת מינים המשתמשת בניתוחים גנומיים ובמסכים גנומיים פונקציונליים כדי לזהות ולהשוות מטרות טיפוליות בגידולים הנובעים ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית וסוג הגידול האנושי המתאים.

פרופיילינג גנטי וסינון נשירה בקנה מידה גנומי לזיהוי מטרות טיפוליות במודלים עכבריים של גידול ממאיר במעטפת עצב היקפית

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

למד כיצד לזהות מטרות miRNA בגנום שלם באמצעות ספריית Target ID. שיטה זו משתמשת בזיהוי תאים יציבים ובריצוף עמוק כדי לחשוף אינטראקציות גנטיות ולקדם מחקר בגנומיקה וביולוגיה מולקולרית.

הגנום כולו מסך עבור מטרות מירנה שימוש יעד המשימה ספריית מזהה

גלה סרטונים נוספים