הגנום כולו מסך עבור מטרות מירנה שימוש יעד המשימה ספריית מזהה

ספריית מזהה היעד הוא פלסמיד מבוסס, הגנום כולו אוסף של cDNA משובטים לשמש לזיהוי מטרות מירנה. כאן אנו מדגימים את השימוש והיישום.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע מסך רחב של גנום בתפוקה גבוהה של מטרות מיקרו RNA באמצעות ספריית מזהה היעד. זה מושג באמצעות טרנספקציה של תאים עם פלסמיד הספרייה. אוסף גנומי של טרנספקציה של CDNA משובט מלווה בבחירה עבור קווי תאים יציבים.

תאי הספרייה המבוססים עוברים לאחר מכן טרנספטציה עם מבנה ביטוי המיקרו RNA כדי לאפשר ביטוי משותף של יעד המיקרו RNA ותימידין קינאז. בשלב זה, גנציקלוביר משמש לבחירת תאים המבטאים מטרות מיקרו RNA ספציפיות על ידי בחירה כנגד ביטוי תימידין קינאז. אתרי המטרה של CD NA המכילים מיקרו RNA מוגברים לאחר מכן PCR באמצעות פריימרים להגברת מזהה היעד על מנת לרצף ולזהות את מטרות ספריית המיקרו RNA.

בסופו של דבר, מתקבלות תוצאות המזהות מטרות מיקרו RNA ספציפיות בתאים על סמך ניתוח ריצוף עמוק. ספריית זיהוי יעד המשימה נועדה לסייע בגילוי וזיהוי מטרות גנים עבור מיקרו RNA. כאן אנו מדגימים את השימוש והיישום שלו.

לפני תחילת פרוטוקול זה, בחר קו תאים שאינו מבטא או מבטא רמות נמוכות של תרבית ה-IRA המעניינת והרחיב את התאים כדי לקבל בערך פי שניים 10 לשבעת התאים בשטף של 80%. לאחר הטריפסין, התאים מעבירים אותם לכדור צינור עליון סטרילי של 15 מיליליטר לתאי הטריפסין ב-200 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר הסרת הרסוס הבינוני, השעו את כדור התא לשטיפה, צנטריפוגה שוב את התאים וחזרו על השטיפה בפעם השנייה.

בינתיים, הכינו מספיק צינורות של 0.5 מיליליטר למספר הטרנספקט על ידי הוספת שני מיקרוגרם של ספריית מזהה היעד לכל צינור. כעת השעו מחדש את גלולת התא בתוך צינור ה-15 מיליליטר באמצעות 600 מיקרוליטר של תמיסת חיבה מקסימלית של גרעין לכל טרנספקציה. תגובה אחת בכל פעם.

הוסף 100 מיקרוליטר תאים לאליקווט, שני מיקרוגרם פלסמיד מתערבבים עם קצה הפיפטה. העבירו כל תערובת לאפקטור גרעיני. הכנס ווט אחד למכשיר האפקטור הגרעיני והפעל תוכנית אופטימלית המתאימה לקו התאים.

לאחר מכן, מלאו פיפטת העברה במדיום חם מראש. קח את התאים שהועברו באותה פיפטה והעביר לבאר אחת של צלחת שש בארות שהוכנה בעבר. חזור על תהליך זה עבור כל חיבה גרעינית של NU לאחר חיבה גרעינית של NU.

החזירו את התאים לתא הגידול לדגירת לילה למחרת. החלף את המדיום ואפשר לתאים להתאושש במשך שלושה עד חמישה ימים. לאחר שהתאים התאוששו, הסר את המדיום והוסף מדיום שלם המכיל את הרמה המתאימה של אאוזין כדי לבחור אינטגרציה וביטוי יציבים של חלבון ההיתוך TKZO.

ניתן לקבוע בעבר את ריכוז האאוזין כמתואר בטקסט. עקוב אחר התאים לבחירת אאוזין באמצעות כדאיות התא. החלפת המדיום באאוזין טרי המכיל מדיום כל יומיים-שלושה.

לאחר שנפגש בבריכת המעבר של שש לוחות הבארות והרחיב את התאים לצלוחיות גדולות יותר. ניתוח עקומת הרג מבוצע כדי לקבוע את המינון הקטלני המינימלי עבור ריאגנטים הבחירה המשמשים במחקר. כדי להימנע מתגובות פנוטיפיות לא רצויות לביצוע עקומות הריגה, צלחת תחילה את התאים לכל באר של צלחת 96 בארות המכילה 120 מיקרוליטר של מדיום טרי למחרת.

הוסף תרופה לבארות נבחרות. אנטיביוטיקה G ארבע 18 או מיצין טהור משמשים לבחירה לשילוב של מבנה ביטוי המירנה או כנגד אציקלוביר משמש לבחירה נגד ביטוי תימידין קינאז במהלך הדגירה, בדוק את כדאיות התאים עבור כל ריכוז תרופה כל יומיים. החלפת המדיום המכיל את מגיב הבחירה כל שלושה ימים.

יש להשתמש בריכוז המינימלי של מגיב הבחירה הגורם למוות מלא של תאים לאחר הזמן הרצוי עבור אותו סוג תא ולניסוי לאחר קביעת ריכוזי התרופות. התכוננו לטרנספקציה של MI על ידי הגדלה והרחבה של תאי ספריית מזהה היעד כדי להגיע פעמיים 10 לתאים השביעיים. עיניים טריפסין כאשר התאים נמצאים בשטף Co של יותר מ-80%.

העבירו את התאים לצינור וכדור בורג סטרילי של 15 מיליליטר ב-200 פעמים G למשך חמש דקות. הסר את המדיום ושטוף את כדור התא פעמיים כמו קודם. לאחר מכן, עבור כל טרנספקציה, הוסף שני מיקרוגרם של פלסמיד ביטוי MIRA לצינור של 0.5 מיליליטר.

בצע חיבה גרעינית NU של ה-mRNA לתאי הספרייה באותה שיטה המשמשת להעברה של ספריית מזהה היעד. לאחר שהתאים התאוששו במשך שלושה עד חמישה ימים, החלף את המדיום במדיום שלם המכיל את רמת האנטיביוטיקה המתאימה. כפי שנקבע ממבחן עקומת ההריגה.

עקוב אחר התאים לבחירת אנטיביוטיקה, והחלף את המדיום במדיום המכיל את האנטיביוטיקה כל יומיים-שלושה. לאחר שהתלכד בבריכת מעבר שש הלוחות והרחיב את התאים לצלוחיות גדולות יותר. כמו קודם, החלף את המדיום במדיום טרי המכיל את הרמות המתאימות של GCV ואנטיביוטיקה.

עקוב אחר התאים לביטוי תימידין קינאז וביטוי mRNA באמצעות כדאיות התאים והרחיב את התאים השורדים בנוכחות GCV ואנטיביוטיקה. לאחר מכן, הכינו דנ"א גנומי מהתאים שנבחרו ב-GCV. PCR מגביר את תוספות הספרייה הנבחרות עם פריימרים של ערכה ומשכפל אותן כמתואר בפרוטוקול הכתוב.

לאחר מכן ניתן לבצע תגובות ריצוף עם פריימרים להגברה. כשלב אחרון, זהה מטרות גנים על ידי יישור פיצוץ של רצפים עם הטרנסקריפטום האנושי עבור תעתיקים ידועים והגנום האנושי עבור תעתיקים חדשים. מבנה ביטוי של 3 73 בלבד הועבר ביציבות לספריית MC 7 ונבחר בגנציקלוביר המכיל מדיום להעשרה עבור תאים המבטאים רק 3 73 מטרות.

ל-GCV אין השפעה על תאי MCF שבעה ללא ספרייה מכיוון שהם אינם מבטאים תימידין קינאז. מצד שני, C שבעה תאי ספרייה אכן מבטאים תימידין קינאז אך אינם נהרגים לחלוטין על ידי גנציקלוביר בשמונה או 16 מיקרומולר כפי שמוצג על ידי התאים החיים התופסים כחול מבריק. עם זאת, תאי הספרייה מפסיקים לגדול ב-GCV כפי שמעיד צבע הצבע האדום של הפנול במדיום שלהם.

התאים העצורים אינם מחמצים את המדיום שלהם והצבע נשאר אדמדם. במקום להשתנות לכתום, רצפי מטרה צהובים בודדו מהתאים ששרדו. PCR מוגבר ורצף.

כמעט 12 מיליון קריאות CDNA התקבלו שמופו לכמעט 12,000 גנים ייחודיים. מבין הגנים הייחודיים הללו, 234 נחשבו לפגיעות אמינות בזכות תדירות הפגיעה והיו ספציפיים ל-3,73 בלבד. השוואה ראשונית מצאה כי 10 מהגנים הייחודיים שזוהו עם ספריית מזהה היעד נמצאים גם ברשימה של 3,73 מטרות בלבד שזוהו בעבר בבסיס הזפת.

לכן, 10 אלה הם ככל הנראה מטרות תקפות של 3,73 בלבד וכרגע מאופיינים כדי לאמת פגיעות נבחרות באופן ניסיוני. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בספריית מזהה יעד המשימה כדי לבצע מסך רחב של גנום בתפוקה גבוהה עבור מטרות גן מיקרו RNA.