Name: הגנום עורך עם אצבע CompoZr nucleases אישית אבץ (ZFNs) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: חקור עריכת גנום מדויקת באמצעות נוקלאזות אצבע אבץ מותאמות אישית (ZFNs) ליצירת קווי תאים knockout. השיטה כוללת ניתוח ביואינפורמטי, עיצוב ZFNs, אספקה לתאים בנוקלאופקציה ואימות פעילות באמצעות PCR וג'ל אלקטרופורזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. תהליך עיצוב מותאם אישית ZFN <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזרז את תהליך התכנון ZFN, החוקר צריך לספק: </li><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מידע על הגן היעד כגון שם גנים, מינים, וכן ביאור / מספר זיהוי הגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבירור מעל כל מטרת הניסוי (למשל, נוק או הפיל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הגורמים הספציפיים של היעד הגן הכוללים מבנה הגן טיפוסית, ביולוגיה מיוחד מעורב לוקוס גנטי, או כל מקום אחר הומולוגיים אזורים בגנום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טווח מסוים של רצף ה-DNA של אצבע אבץ nucleases להתמקד. </li></ul><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צוות ביואינפורמטיקה Sigma עורכת בעיצוב ZFN סיליקו לפתח הראשונים אצבע אבץ אתרי היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היעד הראשוני אתרים ZFN ניתנים יועץ ZFN טכנית מדעית. עבור פרויקטים מורכבים יותר מבחינה טכנית, זה מדען Sigma עובד עם החוקרים לפתח אסטרטגיית הפרויקט. </li><l sigma zfn zfn. snp><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אינפורמטיקה מספקת היעד האתרים המובילים ZFN לחוקר לבדיקה. עם אישור של אתרי מטרה פוטנציאליים ZFN, מידע זה מסופק צוות הפקה ZFN כדי להתחיל את תהליך הייצור ZFN. </li></l></ol> 2. הייצור מותאם אישית ZFN <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארכיון סיגמא של מודולים אצבע אבץ משמש כדי להרכיב את העיצובים ZFN מאושרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב כל ZFN מורכב ורצף אומת על פלטפורמה תפוקה גבוהה שיבוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הייצור של כל העיצובים ZFN הוא להשלים את כל ZFN נשלח אימות. </li></ol> 3. אימות של ZFNs אישית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ZFN פרויקטיםהמין האנושי, עכבר, חולדה או CHO מאומתים על שורות תאים שאפיינו גם עבור כל מין, assay המבוסס על שמרים משמש אורגניזמים אחרים או סוגי תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בונה ZFN מועברים לתוך קו התא המתאים ידי nucleofection ואת ZFNs באים לידי ביטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA נאסף מתוך מאגר של תאים ZFN transfected והאזור עניין מוגבר PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay-1 CEL מתנהל ואילך מוצר ה-PCR. ג'ל אלקטרופורזה מנוהלת על assay cel-1 לפעילות ZFN תוקף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ZFN הגבוהה ביותר בפעילות העיצוב כמו אושר על ידי assay cel-1 מסופק מכן ללקוח. ZFNs מועברות ב-mRNA ו-DNA פלסמיד יחד עם primers ה-PCR עבור assay cel-1 ו-DNA הגנומי כביקורת חיובית. </li></ol> 4. מסירת ZFNs מאומת על ידי Nucleofection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע התאים בצפיפות של 2x10 5 תאים למ"ל יום לפני nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום nucleofection,להוציא את קו סלולרי Nucleofector ערכת V ולתת חם לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תוספת הפתרון Nucleofection V לפי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את התאים. צפיפות התאים צריך להיות בין 2.5-5x10 5 תאים למ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו צלחת 6-היטב עם 2ml של המדיום בכל היטב מראש חם CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות לפני nucleofection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרכזת 2x10 6 תאים לכל transfection (6 בסך הכל 8x10) בשעה 200xg במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעמיים עם 20 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צינורות הניסוי: (ראה טבלה בעלון מותאם אישית טכנית ZFN) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת היטב המכיל 6-Media משלב (6.5) מתוך האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים μl 400 (100 μl / התגובה) של פתרון Nucleofection V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובה אחת בכל פעם, להוסיף 100 μl של תאים ל-DNA או כל mRNA המכיל צינור. Transfאה את התערובת ל 2 מ"מ electroporation קובט ו nucleofect על Nucleofector עם תוכנית מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר nucleofection של מדגם זה, השתמש פיפטה העברת להוסיף ~ 500 μl של המדיום prewarmed מהצלחת 6-גם בשלב (6.9) כדי קובט. ואז, בזהירות להעביר תאים קובט עד בינוני prewarmed שנותר בצלחת 6 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את כל התגובות ולהחזיר את צלחת 6-היטב CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. </li></ol> 5. קציר הדנ"א הגנומי לאחר מסירת ZFNs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 גם בצלחת - לא לקצור את כל התאים אספו. חשוב לשמור על תרבות כדי שיהיה תאים לשבט תא בודד דילול לאחר שתוודא כי יש לך מוצרים cel-1 עיכול. אחד עד שלושה ימים לאחר nucleofection לאסוף את התאים כדי להכין את ה-DNA כרומוזומלי באמצעות DNA GenElute היונקים הגנום ערכת Miniprep. </li></ol> 6. Cel-1 Assay <li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר את הדנ"א הגנומי מן דגימות transfected ZFN והשליטה חיובית דנ"א גנומי המסופק בערכה, באמצעות primers המצורף. תגובת PCR מוגדר עם התנאים הבאים: (ראה טבלה בעלון מותאם אישית טכנית ZFN). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור heteroduplexes מן homoduplexes ה-PCR לקחת 10 μl של תגובה PCR מכל מדגם ZFN לטפל בתוספת מלאה להשתמש בתוכנית הבאה על thermocycler: 95 מעלות צלזיוס, 10 דקות 95 ° C עד 85 ° C, -2 ° C / 2 85 ° C עד 25 ° C, -0.1 ° C / 2 4 ° C, ללא הגבלת זמן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של משפר ו 1 μl של nuclease S (מ מס 'קטלוגי Transgenomic 706025) לתגובה כל דגירה על 42 מעלות צלזיוס במשך 20-40 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את digestions על ג'ל עמוד TBE 10% עם סמנים מתאימים, כגון סולם WideRange DNA DirectLoad (מק"ט D7058) (ראה תוצאות עלון מותאם אישית טכנית ZFN). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלאיתות חיובי לספירה זוהה ZFN שטופלו על ידי אוכלוסיות assay cel-I, המשך בידוד ואפיון משובט ו. </li> 7. בידוד אפיון משובט ו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתא בודד לשבט את ZFN שטופלו דגימות בשיטות סטנדרטיות כולל FACS ו שיבוט דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר המשובטים להרחיב במידה מספקת, ואז לפצל חלק חלקם של התאים לקציר הדנ"א הגנומי, הקפאת בחזרה את יתרת חומר הפקידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את הדנ"א הגנומי מן שיבוטים באמצעות cel-I primers ולנתח amplicon ידי assay cel-I (עם או בלי ה-DNA WT זינק ב), או לחילופין להשתמש amplicon להמשיך ישירות genotyping. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המועמד שיבוטים גנוטיפ מזוהה כבעל אללים בעריכת השיטה המועדפת. </li></ol> 8. נציג תוצאות דוגמה כולו CompoZr ZFN העבודה מוצגת באיור 2. ZFNs מועברותלתאים שם נקלטות ודבק את רצף ה-DNA המתאים היוצרת הפסקה פעמיים תקועים (DSB). תהליך התיקון הטבעי, שאינם הומולוגיים בסופו של דבר להצטרף (NHEJ), תיקון DSB. בכמה מקרים חריגים תוצאות NHEJ ב הכניסה מחיקה או החלפה של נוקלאוטידים. PCR הגברה של שנקטפו תוצאות הדנ"א הגנומי במבנה heteroduplex בין סוג פראי amplicons להשתנות אחרי denaturation / צעד חישול התגובה PCR. תוספת של cel-1 תוצאות האנזים המחשוף של כל מולקולות heteroduplex. Cel-1 תוצאות נפתרים על ידי ניתוח עמוד לאשר מחשוף ZFN. איור 3 מספק סכימטי של assay cel-1 ואת התוצאות הצפויות. נציג cel-1 תוצאות כלולים איורים 4 ו -5 איור 4 מכיל תוצאות זוג פעיל מאוד ZFNs (21%) ב K562 תאים,. איור 5 מכיל תוצאות זוג פחות פעילים (2.4%) של ZFNs בK562 תאים. פעילות ZFN הוא אישר דמויות הן על ידי נוכחות של שני קטעי ה-PCR מתחת שבר PCR ההורים. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ZFNs ייצוג nucleases אצבע קשורות אבץ. מתוכננים חלבונים המורכבים אצבע אבץ DNA-binding תחום התמזגו לתחום המחשוף של endonuclease הגבלת FokI. כאשר קשורים כמו heterodimer, ZFNs ליצור הפסקה פעמיים תקועים על רצף DNA מסוים המשתמש. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. סכמטי של זרימת עבודה מותאמים אישית ZFN שירות. ייצוג גרפי של זרימת עבודה כדי ליצור קו תאים מהונדסים גנטית באמצעות ZFNs CompoZr. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. סכמטי של assay cel-1 ואת התוצאות.) ZFN o פלסמיד mRNA R מועבר לתאים. ב) הביעו לאגד ZFNs וחותכים רצף היעד שלהם ליצור הפסקה גדילי כפול (DSB) בחלק של תאים. ג) תיקון החריג של DSBs מסוימים על ידי אי - שהצטרף בסופו של הומולוגיים התוצאות הכניסה נוקלאוטיד או מחיקה. D) הדנ"א הגנומי נאסף ממאגר transfected של תאים מוגבר על מוקד של עניין. EF) PCR המוצר הוא מפוגל מחדש מרותק יצירת היווצרות heteroduplex בין סוג פראי amplicons שונה. ז) cel-1 endonuclease אי התאמה ב assay תוצאות המחשוף של מולקולות heteroduplex. ע) cel-1 אנזים מעכל נפתרות על ידי. היחס הנצפה של המוצר מחשוף ללהקה Parenteral, נקבע על ידי ImageJ תוכנה, מציין לחתוך חלק והיעילות של ZFNs את. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> באיור 4. Cel-1 נובע ZFNs פעילים 21% התוכנה ImageJ זמין בכתובת:._blank "&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. Cel-1 נובע% 2.4 ZFNs פעילים ImageJ התוכנה ניתן למצוא באתר:. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~HEAD=NNS</a> .

<ol><li>Kim, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+restriction+enzymes%3A+zinc+finger+fusions+to+FokI+cleavage+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).</li>
<li>Urnov, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li>
<li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li>
<li>Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+mouse+zygotes+mediated+by+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022(2010).</li>
<li>Geurts, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+rats+via+microinjection+of+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases.</a> Science. 325, 433(2009).</li>
<li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+inactivation+in+zebrafish+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).</li>
<li>Young, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+gene+disruption+in+the+soma+and+germ+line+of+the+frog+Xenopus+tropicalis+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Wanatabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+of+exogenous+EGFP+gene+in+porcine+somatic+cells+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).</li>
<li>Santiago, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li>
<li>Lui, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+triple-gene+knockout+mammalian+cell+line+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).</li>
<li>Moehle, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+addition+into+a+specified+location+in+the+human+genome+using+designed+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).</li>
<li>Doyon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+cold+shock+enhances+zinc-finger+nuclease+mediated+gene+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption.</a> Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).</li>
</ol>

החוקרים יכולים לספק תאים מהונדסים ZFN או בעלי חיים משתפי פעולה במסגרת הסכם מחקר סטנדרטי הרישיון. בנסיבות הזה Sigma שואל כי הסכם העברת החומר לשים במקום בין סיגמא, הלקוח ZFN ושותפו שלהם. רישיון המחקר ניתן לצפות ב: <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . אם יש אפשרות של יישום מסחרי באמצעות ZFN שונה תאים Sigma ואז מבקש רישיון מסחרי מוצבת במקום. הפקה וגישה חופשית למאמר זה ממומן על ידי Sigma, Inc

פעם ZFN-Modified תאים מבודדים להם קבוע תורשתי שינוי ה-DNA. התוצאה היא היכולת ליצור שורות תאים מהונדסים ביציבות או בעלי חיים גזע עם שינויים גנטיים הרצוי לערוך מחקר. CompoZr ZFNs מותאמים אישית לספק שיטה יציבה עבור עריכת הגנום במגוון רחב של סוגי תאים. פרסום הגנום מוצלחת עם עורך ZFNs כולל אך לא מוגבל ל שורות תאים אנושיים, עכבר, חולדה, דג הזברה, צפרדע, חזירי ומודלים צ מחקר. 3,4,5,6,7,8,9 היכולת ליצור פעמיים תקועים הפסקה באתר היעד הרצוי בסוג תא מסוים מובטח כאשר ZFNs מועברות כמו שצריך אל תוך התא. כמו כן, ניתן לבצע עוקבים אצבע שינויים אבץ לתא כדי שיהיה יותר הנדסה גנטית בתוך תא. 10 היכולת לבחור רצף יעד ספציפי ורק לשנות את מוקד מסוים הוא הגורם העיקרי היכולת ליצור מספר רב של modifiקטיונים. אישית CompoZr תעודת ZFN ניתוח נוצרת עם ריאגנטים במיוחד המסופק בערכה ובכך להבטיח כי כל מרכיבי הערכה אומתו באופן יסודי להצלחת הלקוח. השלבים הקריטיים של זרימת העבודה מתחילתו ועד סופו מוצגים להלן: התא שיבוט היכולת לבודד להרחיב את קו תא נתון יש לבדוק לפני תחילת כל הניסויים ZFN. תאים בודדים יש לבודד והרחיב על מנת להבטיח כי האוכלוסייה clonally הנגזרות אפשרי. כמה שורות תאים הם הסרבן בעניין זה, ועל טריקים כגון העשרה שיבוטים ערוכים, או תרבות עם התקשורת מיזוג יכול לעזור להתגבר על אתגרים אלה. משלוח יעילות אופטימיזציה של יעילות האספקה ​​היא חובה לפני מסירת ZFNs את. שיטות רבות ניתן להשתמש גם transfection השומנים מבוסס, electroporation, ו nucleofectiב. שיטת הצגה אידיאלית מורכבת זו מאפשרת את השילוב האופטימלי ביותר של יעילות מסירה הישרדות התא. Quantitating אלה יעילות ניתן להעריך על ידי אספקת שליטה GFP פלסמיד ו quantitating על ידי בדיקה ויזואלית או FACS 24-48hrs שלאחר הלידה. Cel-I assay זוהי חובתו של cel-assay אני מתבצע במקביל הבקרות המתאימות על מנת להבטיח כי הפרמטרים PCR, מערכת העיכול, וכן אלקטרופורזה לא יפריע פרשנות של הניסוי ZFN. כל ערכה כוללת בקרת DNA הגנומי שבו נעשה שימוש כדי ליצור את התמונה cel-I באישור של ניתוח. הגברה מ-DNA השליטה עם primers הניתנים ואחריו assay cel-I תאפשר למשתמש להשוות את התוצאות עם זה המסופק תעודת ניתוח (CofA) תמונה, ולבודד כל חוסר יעילות פוטנציאליים היבט זה של הניסוי. שליטה שליליות מתאימות כגון מעושה, או GFP טיפול בתאמדגם יש לכלול גם לאפשר הבהרה של כל המוצרים שאינם ספציפיים מחשוף. איכותי / כמותי וניתוח של תא יחיד שיבוטים לאחר הטיפול ZFN ו שיבוט תא בודד, אוכלוסיות של תאים עשויים להיות מוקרן לעריכה על מוקד של עניין על ידי מספר שיטות. Cel-assay אני יכול להתנהל על הדנ&quot;א הגנומי של שיבוטים לצורך זיהוי שיבוטים המועמד עבור genotyping נוסף. חשוב amplicon ספייק PCR WT לתוך amplicons מדגם ביחס 1:01 לפני ביצוע cel-I לעיכול כמו שיבוטים מוטציה הומוזיגוטים יכיל מולקולות הומוגניות, ובכך להעביר תוצאה שלילית cel-I assay. שיטה חלופית לסינון מועמדים אלה שיבוטים היא לעצב 1 הנחיתה PCR פריימר ישירות באתר היעד ZFN. הפועל בשיתוף עם אחד primers שליטה, תוצאה assay שלילי מצביע על אובדן הרצף WT. שיבוט הטרוזיגוטיים המכיל לפחות אלל WT יהיה yIELD PCR האות, אבל יכול להיות מופרדים מן שיבוטים WT באופן מלא על ידי ביצוע PCR בהקשר של SYBR QPCR. לאחר שיבוטים המועמד זוהו על ידי השיטות הנ&quot;ל, ניתן genotyped ידי pyrosequencing רגיל, סידור עמוק, או רצף שיטות אחרות. לכל שיטות רצף, amplicon נוצר מ-DNA גנומי משובט צריך להיות שנוצר. עבור אללים pyrosequencing המסורתיים ניתן הפרדה לפי המוצר ת&quot;א שיבוט PCR, ו רצף המושבות בודדים. שיטות כגון עמוק רצף שלב זה אינו הכרחי. הומולוגיה תיקון בימוי (HDR) פרוטוקול זה מספק שיטה בנוקאאוט גן ZFN מתווכת דרך NHEJ. שילוב transgenes ניתן גם שנערך על ידי הכנסת התורם פלסמיד בזרועות הומולוגיה כי האגף חתך ZFN באתר. 11 בתרחיש זה, ZFN נוצר פעמיים תקועים הפסקה תוקן על ידי HDR במקום NHEJ. HDR מכוונת אניntegration של transgenes ניתן אישר שימוש בשיטות דומות בהליכים הניתנים בכל פרוטוקול זה. פתרון בעיות מסירת ZFNs משלוח ZFN וביטוי משלוח יכול להיות נשלט על ידי אספקה ​​של ה-GFP או אחר כגון פלסמיד עבור להדמיה / או לכמת. ביטוי נמוך בשל חוסר תאימות עם מקדם סוג התא של עניין ניתן להתגבר על ידי אספקה ​​של ZFNs בפורמט ה-mRNA. בנוסף, שיטת ההלם הקר עשוי להיות מנוצל כדי להגביר עוד יותר את היעילות של ZFNs בתאים. 12 אם mRNA משמש זוהי חובתו של תאים נשטפים לפני המסירה על מנת להבטיח את כל סרום הנגזרות Rnases הוסרו. כמו כן, נבון להפשיר את ה-mRNA על קרח, ולהוסיף אותו אל התאים ברגע האחרון ממש כדי למזער כל סיכוי השפלה. Cel-I assay קרן של אסא cel-Iy הוא הגברה ספציפי נרחב של מוקד של עניין. אם לא מוגדרים מוצרים הגברה הם נצפו להשתמש תקן ה-PCR הליכי פתרון בעיות כדי להגדיל את הספציפיות כגון אופטימיזציה של כמות תבנית, ריכוז פריימר, ורכיבה על אופניים פרמטרים. ביצוע ניתוח PAGE לעומת agarose אלקטרופורזה רגילה שיטה זו האחרונה אינה מספקת רזולוציה רגישות נאותים. Cel-I תנאים לקט עשוי גם להיות מותאם אם לא מתעכל המוצר או מריחות מוגזמת הוא ציין. טיטרציה של כמות cel-1 nuclease ו / או משך זמן העיכול ניתן טיטרציה כדי לשפר את ההיבטים האלה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Nuclease S (cel-1 Enzyme) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> להרחיב את נאמנות גבוהה PCR מערכת </td><td> רוש </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> שורת תאים Nucleofector ערכת V </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP רעלן פנימי, חינם הפלסמיד Maxiprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

הגנום עורך עם אצבע compozr nucleases אישית אבץ (zfns)

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

הגנום עריכה היא טכניקה רבת עוצמה, שניתן להשתמש בהם כדי להבהיר את תפקיד הגן ואת הבסיס הגנטי של המחלה. הגן המסורתית עריכת שיטות כגון mutagenesis הכימי מבוסס או שילוב אקראי של רצפי DNA להעניק שינויים גנטיים חסרות הבחנה בצורה יעילה הכוללת ודורשים שילוב של רצפים סינתטיים לא רצויים או שימוש התנאים תרבות חריגים, פוטנציאל מבלבל המחקר הביולוגי. לעומת זאת, הביטוי ZFN חולפת בתא יכול להקל מדויק, תורשתי עריכת הגן בצורה היעילה ביותר ללא צורך בממשל של כימיקלים או שילוב של transgenes סינתטיים. Nucleases אצבע אבץ (ZFNs) הם אנזימים אשר נקלטות וחותכים רצפים שונים של גדילי הדנ&quot;א הכפול (dsDNA). יחידה תפקודית CompoZr ZFN מורכב משני חלבונים monomeric בודדים אשר נקלטות על ידי ה-DNA &quot;חצי אתר&quot; של כ 15-18 נוקלאוטידים (ראה איור 1). כאשר 2 ZFN מונומרס &quot;בית&quot; לאתרים סמוכים היעד שלהם את ה-DNA מחשוף תחומים dimerize וליצור הפסקה הגדיל פעמיים (DSB) ב-DNA. 1 מבוא של ZFN בתיווך DSBs בגנום מניח היסודות עריכת הגנום היעילה ביותר. תיקון מושלם של DSBs בתא דרך לא הומולוגיים בסוף שהצטרף מסלול (NHEJ) תיקון דנ&quot;א יכול לגרום הוספות קטנות ומחיקות (indels). יצירת indels בתוך רצף הגן המקודד של התא יכול לגרום frameshift ו בנוקאאוט תפקודית הבאות של לוקוס הגן על יעילות גבוהה. 2 אמנם פרוטוקול זה מתאר את השימוש ZFNs ליצור פצצה גן, שילוב של transgenes יכול גם להתנהל דרך הומולוגיה מכוונת לתיקון במקום לחתוך ZFN. אישית CompoZr ZFN שירות מייצג גישה שיטתית, מקיפה, היטב מאופיין לעריכה הגן ממוקד עבור הקהילה המדעית עם הטכנולוגיה ZFN. מדענים סיגמא לעבוד בשיתוף פעולה הדוק עם חוקרים 1) perfoבדיקת RM ניתוח בשל כולל ניתוח של מבנה הגן ביולוגיה רלוונטי,, ​​מערכת מודל בהתאם מטרות הפרויקט, 2) ליישם את הידע הזה כדי לפתח אסטרטגיה קול מיקוד, 3) ואז לתכנן, לבנות, והן מבחינה תפקודית לאמת ZFNs לפעילות רלוונטי התא קו. החוקר מקבל שליטה חיובית הדנ&quot;א הגנומי primers, ומוכן לשימוש ריאגנטים ZFN שסופקו ב-DNA הן הפלסמיד ואת חוץ גופית בפורמט ה-mRNA עיבד. ריאגנטים אלה עשויים אז להיות מועברת לביטוי חולף בתור תא של החוקר או סוג תא של בחירה. דגימות נבדקו אז מוקד של עניין קנה מידה בטכניקות ביולוגיה מולקולרית כולל הגברה PCR, תקציר האנזימטית, ו אלקטרופורזה לעריכה הגן. לאחר איתות חיובי עבור עריכת הגן מזוהה בקרב האוכלוסייה הראשונית, הם תאים מתא בודד לשכפל ו genotyped לזיהוי של שיבוטים / אללים מוטנטים.

אישית CompoZr אבץ אצבעות nuclease (ZFN) שירות המאפשר עריכת הגנום מדויקת כל אורגניזם או קו תאים על כל מוקד מוגדר על ידי המשתמש. מאמר זה מתאר את תהליך האימות, עיצוב, ייצור ויישום של שירות מותאם אישית ZFN CompoZr.

הגנום עורך עם אצבע CompoZr nucleases אישית אבץ (ZFNs)

עריכה גנומית היא טכניקה עוצמתית שניתן להשתמש בה כדי להשקיף על תפקוד גנים ועל הבסיס הגנטי של מחלות. שיטות מסורתיות לעריכה גנטית כגון...

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש בנוקלאזאז אצבע אבץ (ZFN) בהנדסה מותאמת אישית כדי להחדיר מוטציה משבשת בלוכוס ספציפי, במטרה ליצור בסופו של דבר שורת תאים עם נוק-אאוט (knockout). הדבר מושג תחילה על ידי ניתוח רצף ה-DNA של הגן המטרה באמצעות אלגוריתם composer כדי להפיק עיצובי insco ZFN. ה-ZFNs מורכבים, מועברים לתאים באמצעות טרנספקציה גרעינית (nuclear transfection) ונבדקים לפעילותם באתרים של הגנים המטרה הרלוונטיים לצורך יצירת שורת תאי נוק-אאוט.ראשית, סוג התאים המבוקש מטופל ב-ZFN פעיל. לאחר מכן, אוכלוסייה זו מופרדת לתאים בודדים. ולבסוף, אוכלוסיות קלונאליות אלו מורחבות לצורך אפיון גנוטי נוסף. קלונים עם אירועי חיבור לא-הומולוגיים (non-homologous joining) משבשים באתר המטרה עשויים להיבדק בהמשך בהקשר של נוק-אאוט (knockout) פונקציונלי של הגן.בסופו של דבר, אפיון גנטי, הכולל בדיקת cell one וריצוף DNA, נחוץ כדי לאשר שינויים שנצפו בפנוטיפ התאי כתוצאה משינוי גנטי בתיווך ZFN. היתרון המרכזי של נוקלאזות אצבעות אבץ ביחס לשיטות קיימות, כגון רקומבינציה הומולוגית מסורתית, הוא שעריכת גנים באמצעות ZFN מאפשרת לחוקרים ליצור שינויים גנטיים ספציפיים וצפויים ללא צורך בברירה.שלב זה כולל ביטול גנים (knockouts), מודיפיקציות גנטיות ואינטגרציות גניות. תהליך התכנון של ZFN מתחיל במחקרים ביו-אינפורמטיים פשוטים, המתמקדים בזיהוי אזורי רצף ייחודיים המכילים מספר ואיכות מספיקים של מוטיבים של קישורי אצבעות אבץ, המאפשרים ביצוע של ביטול גן. אסטרטגיה ניסיונית המוצגת באופן ברור תסייע מאוד לתהליך זה, וכך גם מידע על הגן המטרה, כגון מבנה גן לא טיפוסי, ביולוגיה מיוחדת הקשורה לאתר הגנטי, וכל אזור הומולוגי אחר בגנום.עבור פרויקטים מורכבים יותר, מדען של sigma יעבוד בשיתוף פעולה הדוק עם החוקרים. ה-Zfns מעוצבים in silico ומוקדי ה-off-target ברחבי הגנום כולו נחזים. כמו כן, מבוצעים ניתוחי repeat masking ו-snip עבור כל מוקד פוטנציאלי של ZFN.אתרי המטרה המובילים של ZFN נסקרים לפני ייצור ה-ZFN. חוקרים שואלים לעיתים קרובות, האם ZF N'S יעבדו עבור הפרויקט שלי? כדי להשיב לשאלה זו בצורה הטובה ביותר, עלינו להביא בחשבון מספר שיקולים מרכזיים.האם ניתן להעביר ביעילות ולהביע קסטת ביטוי טיפוסית בסוג התאים המבוקש? האם ניתן לבודד ולאחר מכן להרחיב שיבוטים של תאי יחיד? ולבסוף, האם קיימת השפעה מזיקה על צמיחת התאים או על חיוניות התאים כתוצאה מהשבבת (knockout) של הגן המבוקש?התשובות לשאלות אלו עשויות או לא להכריע באופן מוחלט לגבי היתכנותו של פרויקט. עם זאת, הן מאפשרות לנו להעריך עד כמה פרויקט מסוים עשוי להיות קל או קשה, או שהן עשויות להשפיע על היבטים מסוימים של זרימת העבודה שהם קריטיים להצלחה. Sigma משתמשת בארכיון מודולי אצבעות האבץ שלה כדי להרכיב את תכנוני ה-ZFN המאושרים.כל תכנון ZFN מורכב ועובר אימות רצף בפלטפורמת שיבוט בעלת תפוקה גבוהה. לאחר מכן, ה-ZF NS מסופקים בפורמט DNA פלסמי לקו תאים רלוונטי ומאופיין היטב, ומובעים באופן מספיק תוך 24 עד 48 שעות. DNA גנומי מופק לאחר מכן מכל מאגר של תאים שעברו טיפול ב-ZFN, ואחריו ביצוע הגברה באמצעות PCR של אתר המטרה של ה-ZFN.בדיקת תא בודד (cell one assay) מבוצעת על תוצרי ה-PCR, ופעילות ה-ZFN מוערכת באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל. העיצוב של ה-ZFN בעל הפעילות הגבוהה ביותר הוא זה שנספק. בנוסף, מסופק DNA גנומי כביקורת חיובית יחד עם פריימרים ל-PCR לצורך שחזור התוצאות המוצגות בתעודת האנליזה.כדי להתחיל את ניסוי ה-ZFN, התחילו בזריעת התאים בצפיפות של 200,000 תאים למיליליטר ביום שלפני ה-nu nuclear affection. למחרת, ספרו את התאים לפני ההמשך. אם צפיפותם היא בין 250 ל-500,000 תאים למיליליטר, הכינו את תמיסת ה-NU nuclear affection V עבור שורת התאים שבה אתם עובדים, בהתאם לפרוטוקול היצרן.כעת, מלאו פלטת שש בארות בשני מיליליטר של מצע לכל בארה וחממו את הפלטה באינקובטור למשך 20 דקות לפחות. סבבו בצנטריפוגה 2 מיליון תאים לכל נוקלאופקציה. הסירו את העליון ותלו את התאים בעדינות ב-10 מיליליטר של HBSS. לאחר מכן, חזרו על הליך השטיפה פעם או פעמיים נוספות. ZF NS שסופקו בפורמט mRNA מניבים בדרך כלל תדרי עריכת גנים גבוהים יותר מאלו של אותם ZF NS שסופקו בפורמט פלסמיד DNA.עם זאת, הובלה של ZF NS בפורמט mRNA מחייבת נקיטת מספר אמצעי זהירות נוספים כדי למנוע פירוק. ראשית, שטפו את התאים בשני עד שלושה נפחים גדולים של PBS או HBSS כדי להסיר RNAs ממקור סרומי. כמו כן, שמרו תמיד את ה-mRNA על קרח לאורך כל מהלך הניסוי.לבסוף, הקפידו להוסיף את ה-mRNA לתאים שלכם ברגע האחרון האפשרי כדי למנוע דגרדציה. לאחר מכן, הכינו את המבחנות הניסוייות בהתאם לטבלה בחוברת ההנחיות הטכנית של ה-ZFN המותאם אישית. עבור כל טרנספקציה, השביו את התאים ב-100 µL של תמיסת nuclear affection solution V. הכינו תגובה אחת בכל פעם.הוסיפו 100 µL של תאים לכל מבחנה המכילה DNA או mRNA. לאחר מכן, העבירו כל תערובת למכשיר electroporation של שני מילימטרים. בצעו את ה-nucleofection לתאים באמצעות התוכנית המתאימה מיד לאחר העברת כל דגימה למכשיר.השתמשו בפיפטת העברה כדי להוסיף 0.5 mL של מצע מחומם מבאר בפלטה שש-תאי שהוכנה מראש. העבירו בזהירות את התאים מה-qve בחזרה למצע הנותר. באותה באר השלימו את כל התגובות והחזירו את הפלטה לאינקובטור למשך יום אחד עד שלושה ימים.לאחר השפעת הגרעין, בודדו DNA גנומי באמצעות ערכת genal loop mammalian genomic DNA mini prep ללא קציר של כל התאים המאוחדים. לאחר מכן, השתמשו בפריימרים המסופקים כדי לבצע PCR. הגבירו את ה-DNA הגנומי מהדגימות שעברו טרנספקציה של ZFN ומ-DNA גנומי של בקרת חיוביות המסופק בערכה.עכלו כל תוצר PCR עם מיקרוליטר אחד של enhancer ומיקרוליטר אחד של nuclease s. דגרו אותם ב-42 °C למשך 20 עד 40 דקות. לאחר מכן, הרצו את העיכולים על ג'ל TBE בריכוז 10% עם סממנים מתאימים, כגון direct load wide range DNA ladder, לאחר ביצוע שיבוט של תאים בודדים עבור הדגימות שעובדו ב-ZFN והמתנה להתרחבות מספקת של השיבוטים.אסוף חלק מהתאים עבור DNA גנומי, המשך את גידול התאים שנותרו או הקפא אותם כחומר מאגר. בצע הגברה של ה-DNA הגנומי באמצעות הפריימרים של cell one ונתח את התוצר באמצעות בדיקת cell one עם ובלי הוספת amplicon of wild type ביחס של אחד לאחד. לחלופין, השתמש ב-amplicon זה כדי לעבור ישירות לביצוע גנוטיפינג של שיבוטי מועמדים באמצעות ריצוף או שיטות מועדפות אחרות.בדוגמה זו, נעשה שימוש במבחן cell one להערכת הפעילות של זוג ZF NS בתאי K 5 62. הנתיב glan מייצג את ביקרת החיוביות, והנתיב Z מציג מוצרי חיתוך שמהם מוערכת תדירותם של מקטעי PCR עם התאמה חלקית; מנתונים אלו עלה כי פעילות ה-ZF N היא 21%, נתון הנחשב לגבוה מאוד. כאן אנו מציגים את הפעילות של זוג שונה של Z fns.זוג ZFN זה היה פחות פעיל באופן משמעותי מהזוג השני, אך עדיין היה יעיל. ההערכה היא שהוא יצר indels ב-2.4% מאוכלוסיית התאים. חלק מהפרמטרים הקריטיים יותר בעבודה עם ZF X כוללים אופטימיזציה של ההגשה והביטוי בסוג התאים שלך.על ידי אופטימיזציה של פרמטרים אלו, ניתן להפחית באופן משמעותי את כמות הזמן והמאמץ הנדרשים לבידוד של ה-gene knockout. Clone Z fns מהווים כלי מדויק מאוד לעריכה ממוקדת של הגנום כאשר הם משמשים נכון ובתוך ההקשר המתאים. הם יכולים לספק למדענים אמצעי מהיר ויעיל ביותר לחקר הביולוגיה של כמעט כל תוצר גני או מסלול ביולוגי.

genome-editing-with-compozr-custom-zinc-finger-nucleases-zfns

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים טכניקה של עריכת גנום מבוסס נוקלאז באצבעות אבץ בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). מכיוון שניתן להתמיין לתאי גזעי עוברי אורח לסוגי תאים שונים, טכנולוגיה זו מועילה למחקרים פתולוגיים ופרמקולוגיים במבחנה באופן ספציפי למטופל.

Zinc Finger Nuclease-Based Genome Editing: טכניקה לשינוי גנום בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ידי מנגנון תיקון תלוי הומולוגיה דו-גדילי

nucleases מעצב כגון nucleases אצבע אבץ (ZFNs) וnucleases מפעיל כמו activator-שעתוק (TALENs) יכול לשמש כדי לשנות את הגנום של עוברי preimplantation עכבר על ידי מפעילה שני סוף nonhomologous להצטרף (NHEJ) ורקומבינציה הומולוגית מסלולים (HR). מקדמות אלה לאפשר את הדור המהיר של עכברים עם שינויים גנטיים מדויקים.

עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

שורות תאי כתב להציע אמצעים כדי להמחיש, לעקוב ובודד תאים של ריבית מאוכלוסיות הטרוגניות. עם זאת, באמצעות רקומבינציה הומולוגית קונבנציונלית בתאי גזע עובריים אנושיים מיקוד הגן הוא מאוד לא יעיל. בזאת, אנו מתארים מיקוד מוקד PITX3 CNS המוח התיכון ספציפי גורם שעתוק עם EGFP באמצעות רקומבינציה הומולוגית המשופרת nuclease אבץ האצבע.

ג&#39;ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

עריכת גנום של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) יכולה להיעשות במהירות וביעילות. מוצג כאן הליך ניסיוני חזק להנדסה גנטית של hPSCs כפי שמודגם על ידי עריכת מיקום נמל המבטחים AAVS1 כדי לבטא EGFP ולהציג עמידות לאנטיביוטיקה.

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

הגנום יישוב עריכה במערכת מודל רזבורה rerio (דג זברה) כבר באופן משמעותי בהנחייתם של הופעתה של גישות CRISPR. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול יעילים, חזקים הדור, זיהוי של אללים נגזר CRISPR שטויות המשלבת וזמינותו ניידות heteroduplex וזיהוי מוטציות באמצעות הדור הבא רצפי.

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר עריכה חלקה של CRISPR/Cas9 של הגנום C. elegans באמצעות מתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים וסמן ה- DPY-10 המשותף CRISPR להקרנה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מגוון של שינויים גנטיים C. elegans כולל הוספות, מחיקות, תחליפי גנים והחלפות קודון.

CRISPR/Cas9 עריכה של ג'ין C. elegans rbm-3.2 באמצעות סמן ההקרנה DPY-10 Co-CRISPR ומתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים.

פרוטוקול זה מתאר גישה המאפשרת עריכות מדויקות של דגי זברה באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. צינור פנוטיפ מוצג כדי להדגים את הישימות של טכניקות אלה כדי לדגום וריאנט גן הקשור לתסמונת QT ארוכה.

CRISPR-Cas9-עריכות מדויקות בתיווך בלבבות דגי זברה

טכנולוגיות CRISPR-Cas חוללו מהפכה בתחום עריכת הגנום. עם זאת, מציאת ובידוד עריכת קו הנבט הרצויה נותרה צוואר בקבוק משמעותי. לכן, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון מהיר של זרע דג זברה מוזרק F0 CRISPR לעריכות קו הנבט באמצעות טכניקות PCR סטנדרטיות, תקציר הגבלה ואלקטרופורזה בג'ל.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע עריכה יעילה של בסיס אדנין ללא הגבלת PAM כדי לבנות מודל מדויק של מחלת דגי זברה באמצעות zSpRY-ABE8e.

עריכת בסיס יעילה ללא PAM עבור דגי זברה מידול של מחלות גנטיות אנושיות עם zSpRY-ABE8e

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מוטציה אימהית המצמיד קו נוק-אין יציב של zpc:cas9 עם מסירה בתיווך Tol2 של קלטות ביטוי sgRNA.

דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

חקור עריכת גנום מדויקת באמצעות נוקלאזות אצבע אבץ מותאמות אישית (ZFNs) ליצירת קווי תאים knockout. השיטה כוללת ניתוח ביואינפורמטי, עיצוב ZFNs, אספקה לתאים בנוקלאופקציה ואימות פעילות באמצעות PCR וג'ל אלקטרופורזה.

הגנום עורך עם אצבע CompoZr nucleases אישית אבץ (ZFNs)

גלה סרטונים נוספים