Name: LentiPlex המשימה משולב הקרנת shRNA ספריית בתאי יונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: למד כיצד לבצע מסכי בחירה חיוביים באמצעות ספריית shRNA של LentiPlex בתאי יונקים. השיטה מאפשרת זיהוי מהיר של גנים המקדמים הישרדות תאית מול סוכנים תרופתיים נוגדי סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המשימה הוא סימן מסחרי רשום של Sigma-Aldrich ביוטכנולוגיה LP LentiPlex הוא סימן מסחרי של חברת Sigma-Aldrich ביוטכנולוגיה LP

LentiPlex משולב מסך ההתקנה כדי לזהות רצפי shRNA של עניין, חשוב להגדיר את המסך כך שרוב התאים מקבלים רק אחד shRNA לבנות. באמצעות משרד הפנים נמוך (ריבוי של זיהום), ההסתברות של integrants מרובות לכל תא הוא ירד מאוד. עם זאת, יעילות התמרה, ו MOIs הרצוי ולכן תלוי מאוד בסוג תא היעד. לכן, זוהי חובתו של משרד הפנים להגדרה אופטימלית מתבצעת לפני תחילת המסך בסוג התא החדש. 1. התמרה של תאים יעד LentiPlex עם משלחת משולב shRNA הספריה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפועל משרד הפנים להשתמש ישתנו עבור תאים מסוגים שונים. אם הם משכפל הרצוי ואז מספר צלחות יש להגביר בהתאם. בנוסף, בדרך כלל זה לא יהיה יתרון לשלב את subpools שונים. שמירה subpools הנפרד יסייע בתהליך deconvolution. ודא נכסr תיוג של כל מנה רקמה תרבות עם מספר subpool שמוחל במהלך התמרה. נמוך הפנים מומלץ להפחית את ההסתברות integrants מרובות לכל תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1 - Seed את המספר המתאים של 60 מ"מ צלחות עם מספיק תאים כדי להשיג ~ 70% confluency ביום המחרת (10 בריכות בסך הכל, כל אחד ביצע בשלושה עותקים = ​​30 מנות בסך הכל). לצורך המחקר שלנו, 60 מנות מ"מ היו זורעים עם 6 x 105 A549 תאים להשיג confluency של 70% לפני התמרה. הדבר מבטיח כי התאים הם עדיין בשלב הצמיחה המעריכית. שיעורי הצמיחה משתנה בהתאם לסוג התא צריכה להיקבע לפני תחילת המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאים לדבוק דוגרים על ידי לילה ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified באווירה של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) כלילת שני נוסף 60 מ"מ מנות עבור התמרה עם shRNAs בקרה שלילית. לייבל את הכלים "שליטה" על SHC001H ו "בקרת B" עבור SHC002H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2 - ה Transduceדואר תאים עם חלקיקי LentiPlex ויראלי. ביום של התמרה, להפשיר את חלקיקי lentiviral על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקיקי מופשר אל מכסה המנוע זרימה למינרית ולשמור על הקרח, אם לא בשימוש מיידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב כמה כל אחד בבריכה תת אדם ויראלי להוסיף את התאים כדי לקבל את משרד הפנים של 1 בכל הכלים תרבית תאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמה: 1 x 10 6 תאים / תבשיל; titer ויראלי = 5 x 10 8 TU / מ"ל; הרצוי של משרד הפנים 1. ט) 1 x 10 6 תאים / תבשיל x (של משרד הפנים 1) = 1 x 10 6 יחידות transducing (TU) צריך ב.) 1 x 10 6 TU / (5.0 x 10 8 TU / מ"ל) המתקבל C של = 2 μL של פתרון מניות lentiviral יש להוסיף את המנה המתאימה. לדלל את כמות מחושבת של הנגיף μL 100-300 התקשורת להשלים כדי להבטיח חלוקה טובה יותר של הנגיף כאשר הוסיף בצלחת תרבית תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה מן התאים מראש seeded. הוסף להשלים התקשורת containing ברומיד hexadimethrine פתרון כל מנה. הריכוז הסופי של ברומיד מומלץ hexadimethrine בתקשורת הוא 8 מיקרוגרם / מ"ל. השתמש ברומיד hexadimethrine פחות אם אתה מוצא את זה כדי להיות רעיל לתאים היעד שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חלקיקים shRNA lentiviral אל הכלים המתאימים בהתאם לעיצוב הניסוי מראש. בעדינות מערבולת הצלחות כדי לפזר באופן שווה על פני הנגיף לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 18-20 שעות ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified באווירה של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) חזור על 3-8 על זהות משרד הפנים עם SHC001H (ריק וקטור shRNA הבקרה) בכלי בקרה A ו SHC002H (מקושקשות shRNA שליטה) בחוק הפיקוח דיש ב התייחס הכלים האלה זהה את הכלים ניסיוני לאורך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3 - שנה את התקשורת. לשאוב וירוס המכילים מדיה להוסיף מדיה שלם טרי (ללא ברומיד hexadimethrine). דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> 2. התייחס מצופהתאים עם רכיב טיפולי מגיב / <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4 - מדיה לשאוב מבארות ולהוסיף התקשורת טרי המכיל מרכיב טיפולי בריכוז האופטימלי. כמו עם התנאים תרבות, טיפולים ישתנו ריכוזי נכונה המשכים צריך להיקבע מראש. במחקר זה, השתמשנו באפשרות 100 ng / mL של TRAIL ו 1 מיקרומטר של פקליטקסל. תאים שטופלו במשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים שורדים צריך להיות מחדש seeded לתוך צלוחיות T75 ואיפשר להרחיב עד כמעט 100% ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) בסוף הבחירה, לבדוק בקרה צלחת ואת צלחת בקרה דיש ב A ו-B צריך צלחת לכל אחד מאיתנו יש מושבות פחות מ לפחות אחת המנות ספריה נקווה. אם יש מספר גבוה באופן בלתי צפוי של מושבות בצלחת, מאשר כל אחד את תהליך התמרה השפיע על מסלול הקשורים הפנוטיפ הרצוי או לחץ סלקטיבי אינו חזק מספיק מחדש אופטימיזציה של assay ייתכן שתידרש. אם B מהודרת מכיל מושבות רבות מדיאז הביטוי של shRNA ומעורבות של מסלול RNAi עלול להיות בעל השפעה על הפנוטיפ של עניין. אם זה לחזור על המקרה עם SHC001H, על מנת להבטיח כי ההשפעה אינה ספציפית SHC002H. </li></ol> 3. Deconvolution מן האוכלוסייה תא polyclonal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר האוכלוסייה הטרוגנית של תאים subpool כל לבודד הדנ"א הגנומי. בניסוי שלנו, תאים נשטפו בקצרה PBS ו trypsinized לפני הדנ"א הגנומי היה מבודד באמצעות GenElute היונקים הגנום Miniprep ערכת וסיפקה פרוטוקול (Sigma-Aldrich, G1N70). לחלופין, טיהור אחרים כל גנומית ערכות הזמינים כעת בשוק יכול לשמש לבידוד DNA. חשוב לעקוב אחר ההמלצות פרוטוקול בסכום התחלתי של תאים בתרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR הגברה של מטרות. הליך ההתאוששות shRNA תבנית המאפשרת הגברה של הבריכה כולה מוסיף shRNA מן האוכלוסייה התא הנבחר, או שליפה של indiviכפול shRNA תבניות ממושבות כי נאספו בנפרד מורחבת. לאחר הגברה של מוסיף shRNA מתוך מלאה תאים היעד הנבחר, מוצרי ה-PCR יכול להיות רצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעד זה הגברה PCR היה מותאם שימוש Sigma רדימיקס, קטלוג מס 'P2893. ריאגנטים אחרים יכולים לשמש הגברה, אבל בתנאי רכיבה על אופניים ו / או ריכוז מגנזיום ייתכן שיהיה צורך לשנות עבור הגברה מוצלח. Primers הגברה ב mM ריכוז 20 כלולים בערכה LentiPlex. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובת PCR, כמתואר בטבלה 1. מוסיפים את המרכיבים לפי הסדר הרשום. הסכומים המתוארים כאן הם עבור one תגובה 50 μL. לתגובות נוספות, בהיקף תערובת רכיבים אמן על ידי המספר הרצוי של תגובות וכוללים overage 10%. כמות של תבנית ה-DNA המומלץ הוא 5-10 ng. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ מאוד כי התגובה תבנית אחת מורכבת של וקטור המשימה shRNA האדם בקרה חיובית מדולל כדי appropriate ריכוז. הגברה מוצלחת עם תבנית זו מציינת כי הרכיבים assay PCR ותנאי הרכיבה מספיקות. הערה: כדי למנוע זיהום שריד של דגימות חומרים כימיים ניסיוניים, הוא הציע כי שליטה חיובי להיות מדולל במיקום נפרד מהמקום שבו עוקבים PCR תגובות מוגדרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את תוכנית ה-PCR המפורטים בטבלה 2 לתוך thermocycler שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדגם זה, משלבים 3 תגובה PCR μL עם μL 1 של צבע ו electrophorese לצד μL 5 של DirectLoad ™ PCR 100 נ"ב סולם נמוך, מס 'קטלוגי D3687 על 1% agarose ג'ל כדי לאשר את קיומו של amplicon 309 נ"ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subcloning של PCR amplicons: מוצרי PCR היו Topo משובטים באמצעות ערכת Topo ת"א שיבוט, בעקבות פרוטוקול של היצרן (Invitrogen, K4575-01). התוצאה היא מוצר אחד PCR הכלול וקטור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מושבות חיידקים בודדים (שכל אחת מהן מכילה יחיד PCR amplicon) היו מבודדים לגדולn ב 2 תרבויות מ"ל של LB עם 100 מ"ג / מ"ל ​​אמפיצילין. פלסמיד דנ"א הופק אז באמצעות פלסמיד GenElute Miniprep Kit (Sigma-Aldrich, PLN70). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטוהרים DNA פלסמיד היה מתעכל עם EcoRI ו electrophoresed כדי לאשר את קיומו של הכנס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות DNA פלסמיד היו רצף ואז להכניס shRNA מזוהה באמצעות shRNA LentiPlex רצף חיפוש במסד הנתונים המסופק עם הספרייה LentiPlex. </li></ol> 4. יעד זיהוי ואימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף shRNA יוזם עם 5'-GAAACACCGG-3 ". הזן לפחות הבא 10 אך פחות מ 21 נוקלאוטידים כמו רצף שאילתה בתיבת החיפוש ב חיפוש המצורפת shRNA טופס רצף מסד נתונים של Access. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מינים של shRNA נקווה. לחלופין, בחר את subpool שממנו רצף נמצא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת לחץ על כפתור "מצא כניסות פוטנציאל" כדי לבצע את החיפוש. זה אמור לזהות את הרצף המקביל TRC shRNA (ים) התואמים הדואר רצף נתונים. מידע נוסף על רצף TRC shRNA (ים) לזהות את יעדי הגן המקביל ניתן למצוא בקלות ב Sigma-Aldrich של ג'ין מועדף: <a href="http://www.sigma.com/yfg">http://www.sigma.com/yfg</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגנים שזוהו היעד צריך להיות מאומת על ידי חזרה על assay ההקרנה המקורי עם המשובט TRC המקורי בתוספת לפחות שני shRNAs נוספים היעד הגן אותו באמצעות 1 shRNA לעצב היטב 1. להיטים אמנם יציג את פנוטיפ זהה ברוב של בארות. </li></ol> 5. נציג תוצאות דוגמה עבודה ונקווה LentiPlex מסך מפורט באיור 1. תאים transduced כי התרבו בנוכחות TRAIL ו פקליטקסל הורשו להרחיב עד צלוחיות היו ומחוברות. הדנ"א הגנומי היה לקצור נתון הגברה ו PCR שיבוט כפי שמודגם באיור 1, בטרם הוגשה לזיהוי רצף shRNA כמתואר Figuמחדש 1 ג 250 היו שיבוטים רצף, של 25 היו אלה המיוצגים על ידי מספר רב של שיבוטים ואת 225 הנותרים היו מיוצגים על ידי שיבוט רק 1 ולא נרדפו בשלב זה. כפי שניתן לראות בתרשים 2, גנים מועמדים מספר כולל TBX3, PPP2CA ו AKT2 היו מיוצגים על ידי כפילים מרובים. הגורם T-box שעתוק, הופיע TBX3 בסך הכל של ארבעה שיבוטים כבר מעורב הגירה הגידול 5. Downregulation PPP2CA הודגמה לשמר את הצמיחה של תאים בתרבית בתנאים LNCaP חסר אנדרוגן על ידי להקלת אנדרוגן, מניעת המושרה תא מחזור מעצר ומניעת אפופטוזיס 6. AKT2 הוא סרין RAC-beta / תראונין חלבון קינאז ו oncogene המשוערת הפגינו לשחק מספר תפקידים בסרטן הפיתוח 7, 8. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table1.jpg" alt="טבלה 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="טבלה 1"> * ריכוז סופי של Mg 2 + בתמיסה יהיה 3 מ"מ;1.5 מ"מ הוא תרם מן רדימיקס תקי ו 1.5 mM מפתרון מגנזיום כלוריד. 1. טבלת Lentiplex תגובת PCR תנאי <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table2.jpg" alt="טבלה 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="טבלה 2"> 2. טבלה Lentiplex PCR תוכנית הגברה <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1a.jpg" alt="איור 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1a"> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1b.jpg" alt="איור 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1b"> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1c.jpg" alt="איור 1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1 ג"> באיור 1. (א) LentiPlex ונקווה המסך, (ב) עבודה deconvolution polyclonal, ו (ג) זיהוי של מטרות shRNA. LentiPlex א ונקווה המסך. ראשית, תאים Seed, ולאחר מכן להוסיף subpools shRNA, (10 בריכות בסך הכל, כל אחד ביצע בשלושה עותקים, עבור 30 מנות בסך הכל). בשלב הבא, לטפל עם רכיב טיפולי מגיב / (במקרה שלנו, שביל אבאclitaxel, בהתאמה). ואז, ולזרוע מחדש תאים לשרוד צלוחיות ולאפשר להרחיב. קציר אוכלוסייה הטרוגנית של תאים subpool כל לבודד הדנ"א הגנומי. Deconvolution ב polyclonal. בצע PCR להגביר DNA המכיל את הכנס shRNA. מוצר ה-PCR אחיד בגודל, אבל polyclonal ברצף מאז gDNA תבנית גם polyclonal. מוצר ה-PCR משובטים לתוך וקטור והפך לאחר מכן לתוך חיידקים המוסמכות. ג זיהוי מטרות shRNA. מושבות בודדים מבודדים פלסמיד דנ"א מופק. כל כפיל מכיל את וקטור שיבוט עם פיסה PCR בודדים. פלסמיד דנ"א מתעכל כדי לאשר את קיומו של הכנס ועל רצף. הכנס את shRNA מזוהה באמצעות shRNA LentiPlex רצף הנתונים חיפוש. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> באיור 2. שזוהו יכולגנים didate. 25 גנים מועמדים שזוהו שהיו להיטים רבים. 225 גנים מועמדים רק 1 פגע לא נרדפו. אנא ראה לוח 1 משלים עבור התמוטטות של שיבוטים בודדים לכל גן מועמד. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305suptable1.jpg" alt="טבלה 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="טבלה 1"> משלים טבלה 1. הפרט TRC שיבוטים ספריית שזוהו מתוך סידור polyclonal ID Gene כניסות המשובטים זוהה.

<ol><li>Rao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+vs.+shRNA%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">siRNA vs. shRNA: similarities and differences.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61 (9), 746-746 (2009).</li>
<li>Root, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+loss-of-function+screening+with+a+lentiviral+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-scale loss-of-function screening with a lentiviral RNAi library.</a> Nat Methods. 3 (9), 715-715 (2006).</li>
<li>Fan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+antitumor+activity+of+TRAIL+combined+with+chemotherapeutic+agents+in+A549+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Synergistic antitumor activity of TRAIL combined with chemotherapeutic agents in A549 cell lines in vitro and in vivo.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 55, 189-189 (2005).</li>
<li>Ji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screen+of+shRNAs+targeting+tumor+suppressor+genes+to+identify+factors+involved+in+A549+paclitaxel+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">A screen of shRNAs targeting tumor suppressor genes to identify factors involved in A549 paclitaxel sensitivity.</a> Oncology Reports. 18, 1499-1499 (2007).</li>
<li>Fillmore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+expands+breast+cancer+stem-like+cells+through+paracrine+FGF%2FTbx3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Estrogen expands breast cancer stem-like cells through paracrine FGF/Tbx3 signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 14 (50), 21737-21737 (2010).</li>
<li>Bhardwaj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+protein+phosphatase+2A+activity+alters+androgen-independent+growth+of+prostate+cancer+cells%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer.+Ther%22%5BJournal%5D)">Modulation of protein phosphatase 2A activity alters androgen-independent growth of prostate cancer cells: therapeutic implications.</a> Mol. Cancer. Ther. 10 (5), 720-731 (2011).</li>
<li>Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT2%2C+a+putative+oncogene+encoding+a+member+of+a+subfamily+of+protein-serine%2Fthreonine+kinases%2C+is+amplified+in+human+ovarian+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">AKT2, a putative oncogene encoding a member of a subfamily of protein-serine/threonine kinases, is amplified in human ovarian carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (19), 9267-9267 (1992).</li>
<li>Fernandez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1+and+Akt2%3A+differentiating+the+aktion%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Akt1 and Akt2: differentiating the aktion.</a> Histol. Histopathol. 26 (5), 651-651 (2011).</li>
<li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+multiple+synthetic+lethal+interactions+with+the+Ras+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene.</a> Cell. 137 (5), 835-835 (2009).</li>
<li>Ketela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+platform+for+highly+multiplexed+mammalian+functional+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22B.M.C.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens.</a> B.M.C. Genomics. 12 (1), 213-213 (2011).</li>
</ol>

מתיו ג&#39;Coussens, קורטני קורמן, ל אשלי פישר, ג&#39;ק סאגו, וג&#39;ון Swarthout מועסקים על ידי חברת Sigma-Aldrich, מה שהופך את הכלים ריאגנטים שימוש במאמר זה.

במחקר זה, אנו מציגים מסך הגנום כולו כדי לזהות גנים המעורבים cytotoxicity של תאים A549 בעקבות הטיפול פקליטקסל / TRAIL. השימוש בגישה נקווה מסך הגנום כולו מפחיתה את הזמן, עלות ההשקעה בציוד הקשורים בדרך כלל עם מסכי ערוכים קונבנציונאלי. קריטי להצלחה של המסך הם ביצעו ניסויים אופטימיזציה מראש. התנאים התמרה ואת משרד הפנים צריכה להיקבע באופן אמפירי. שיטת הבחירה צריך לאפשר בחירה חזקים של תאים המציג את הפנוטיפ הרצוי (למשל, הישרדות, ביטוי חלבון פני השטח, וכו &#39;). אופטימיזציה של הפרמטרים הללו יהיה לצמצם את מספר תוצאות חיוביות שגויות שאותרו. כאן, gDNA היה שנקטפו מן האוכלוסייה עיקר התאים הנבחרים ולאחר מכן Topo משובטים לזהות מוסיף shRNA בודדים. אחת שיפור אפשרי עבור ניסוי זה היה כדי לבחור עבור תאים חיים באמצעות FACS על מנת להבטיחרק תאים חיים נאספים. מטרות זיהו יהיה תוקף על ידי התמרה עם יעד ספציפי shRNAs ב assay הקרנה. להיטים אמנם יציג את הפנוטיפ ברוב הבארות. ספריית LentiPlex משולב גמישה בבקשתו. זה תואם עם מגוון רחב של יישומים הזרם וניתן להשתמש באסטרטגיות בחירה חיובי או שלילי. בהתאם לתנאי ההקרנה, deconvolution של מוסיף shRNA מושגת באמצעות PCR / שיבוט, microarray, או הדור הבא של רצף 9, 10. בעוד הכוח והמהירות של טכניקות אלה deconvolute מסכי RNAi היא מבוססת היטב, דאגה אחת עם microarray ו הדור הבא של שיטות ריצוף הוא הזמינות של ביואינפורמטיקה המשאבים והידע הדרושים כדי לנתח ולפרש נכונה תוצאות הניסוי. העלויות הכרוכות טכניקות אלה יכולים לעתים קרובות פעמים להיות מכשול ההתחייבות של מסכי הגנום רחב. APCR / שיבוט הגישה מבוססת, בעוד לא חזק כמו microarrays ואת הדור הבא סידור מהווה חלופה העלות האפקטיבית נמוכה יותר. Agilent מציעה כעת מערך מותאם אישית המבוסס על ספריית TRC shRNA לסיוע נוסף מסכי LentiPlex. אפשרויות אלה לאפשר לחוקרים להשתמש LentiPlex ללמוד מגוון רחב של תפקודים תאיים.

<html><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוג </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">LentiPlex מערך משולב</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">SHPH01</a> </td></tr><tr><td> תאים A549 </td><td> ATCC </td><td> CCL-185 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T5694%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">TRAIL</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td><html> oductDetail.do? lang = he &amp; N4 = T5694% 7CSIGMA &amp; N5 =% SEARCH_CONCAT_PNO 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; T5694 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">פקליטקסל</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">T7402</a> </td></tr><tr><td> Topo ת&quot;א שיבוט Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K4575-01 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P2893%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">JumpStart תקי רדימיקס</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td>ONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; P2893 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">GenElute ערכת פלסמיד Miniprep</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">PLN70</a> </td></tr><tr><td> EcoR1 </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> R0101 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">hexadimethrine ברומיד</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">H9268</a> &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table>

lentiplex המשימה משולב הקרנת shrna ספריית בתאי יונקים

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

התערבות RNA (RNAi) הוא מנגנון פנימי הסלולר לרגולציה של ביטוי גנים. רתימת העוצמה המולדות של מערכת זו מאפשרת לנו רמת גן מציאה ביטוי בהפסד של מחקרים לתפקד גן. ישנן שתי שיטות עיקריות לביצוע RNAi. הראשונה היא השימוש RNAs התערבות קטנה (siRNAs) כי הם מסונתז כימי, והשני מנצל מכבנה קצר RNAs (shRNAs) מקודד בתוך פלסמידים 1. האחרון יכול להיות transfected ישירות לתוך התאים או ארוזים לחלקיקים שכפול פסול lentiviral. היתרונות העיקריים של שימוש shRNAs lentiviral היא הקלות של הכנסת לתוך מגוון רחב של סוגי תאים, היכולת שלהם להשתלב ביציבות הגנום עבור מציאה גן ארוך טווח הבחירה, ואת יעילותם בניהול תפוקה גבוהה אובדן מסכי לתפקד. כדי להקל על יצרנו את LentiPlex ונקווה ספריה shRNA. MISLentiPlex שיאון אנוש ספריית shRNA משולב הוא בריכה הגנום כולו lentiviral מיוצר באמצעות תהליך קנייני. הספרייה כוללת למעלה מ 75,000 מבנים shRNA מאוסף TRC מיקוד 15000 + גנים אנושיים 2. כל ספריה נבדק לייצוג shRNA לפני שחרור המוצר, כדי להבטיח כיסוי ספריה חזקים. הספרייה היא סיפקה בפורמט מוכן לשימוש lentiviral בבית titers של לפחות 5 מ&quot;ל 10 x 8 / TU באמצעות assay p24 ו מראש מחולקים לעשרה subpools shRNA של כ 8000 מבנים כל אחד. Primers הגברה וסדר ניתנים גם לצורך זיהוי מטרה במורד הזרם. מחקרים קודמים הקימה פעילות antitumor סינרגיסטי של TRAIL בשילוב עם פקליטקסל ב A549 תאים, ריאה אנושית קרצינומה של תאים קו 3, 4. במחקר זה אנו מדגימים את היישום של ספרייה ונקווה LentiPlex shRNA במהירות לנהל מסך הבחירה חיוביות גנים המעורבים o cytotoxicityו A549 תאים כאשר הם נחשפים TRAIL ו פקליטקסל. אחד המחסומים נתקל לעתים קרובות עם תפוקה גבוהה מסכי העלות וקושי deconvolution, אנחנו גם פרט גישה חסכונית polyclonal ניצול סידור המסורתית.

כאן אנו להשתמש בספריית LentiPlex האנושי ונקווה המסורתית רצף שיטות לזיהוי מטרות הגן לקידום הישרדות התא. אנו מדגימים כיצד להגדיר deconvolute מסך LentiPlex ולאמת את התוצאות.

LentiPlex המשימה משולב הקרנת shRNA ספריית בתאי יונקים

השתקה גנטית באמצעות RNA (RNA interference - RNAi) היא מנגנון תאי מולד לוויסות ביטוי גנים. ניצול כוחו המולד של מערכת זו מאפשר לנו...

המטרה הכללית של הסרטון הבא היא להדגים את השימוש בספריית shRNA (short hairpin RNA) של הגנום השלם לצורך ביצוע מהיר של סריקת ברירה חיובית. הדבר מושג על ידי התעתוק (transduction) של תאי המטרה עם 10 תת-מאגרים של ספריית shRNA המאוצבת כ-pooled whole genome ומוספקת בשיטת Mission LentiPlex, ולאחריה הוספה של הרכיב הטיפולי. כשלב שני, חומר התבנית של ה-shRNA מופק מחדש, דבר המאפשר את פענוח (deconvolution) הסריקה המאוצבת.לאחר מכן, ה-S-H-R-N-A שהופק משבט אל תוך הווקטור ומועבר בתהליך טרנספורמציה לחיידקים כשירים. לאחר מכן, דגימות של DNA פלסמי עוברות ריצוף ומטרות S-H-R-N-A מזוהות באמצעות מאגר חיפוש הרצפים lenti PLX, HRNA. תוצאות הניסוי שבוצע בסרטון זה חושפות את הגנים המעורבים בציטוטוקסיות של קו תאי גידול אפיתליאל בעת חשיפה לסוכנים פרמקולוגיים נגד גידולים, וזאת בהתבסס על מספר פגיעות הריצוף.מאגר Lin Duplex מאוחד. ספריית HRNA מכילה את קונסורציום RNAI או את אוסף TRC ב-10 מבחנות מטריצה, וניתן להשתמש בה לביצוע מהיר של מחקרי אובדן תפקוד גנים בתפוקה גבוהה. במחקר זה, היא משמשת לביצוע מהיר של סריקת ברירה חיובית לגנים המעורבים בציטוטוקסיות של תאי 5 49 בעת חשיפה ל-trail ו-paclitaxel לפני התעתוק של תאי המטרה.זריעה (SEED) של מספר מתאים של צלחות בנפח 60 מילימטר עם מספיק תאים כדי להגיע לכ-70% קונפלואנסיות (confluency) ביום למחרת. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך הלילה. קצבי הצמיחה ישתנו בהתאם לסוג התא ויש לקבוע אותם לפני תחילת הסריקה כדי להתכונן לטרנסדוקציה של התאים עם ספריית ה-S-H-R-N-A המאובזרת ב-mission lenti plex pooled. הפשרה של החלקיקים הלנטי-ויראליים על קרח, והעברת החלקיקים המופשרים למכסה זרימה למינרית, תוך שמירה על קרח אם אינם בשימוש מיידי.חשבו את הכמות של כל תת-מאגר ויראלי בנפרד שיש להוסיף לתאים כדי להגיע לריבוי זיהומים, או MOI, של אחת בכל צלחוני תרביות התאים. MOI נמוך משמש להפחתת ההסתברות למספר אינטגרינים בכל תא; דללו את כמות הנגיף שחושבה ב-100 עד 300 µL של מצע גידול מלא כדי להבטיח התפלגות טובה יותר של הנגיף בעת הוספתו לצלחון תרבית התאים, ולאחר מכן הסירו את המצע מהתאים ששולחנו. הוסיפו לכל צלחון מצע גידול מלא המכיל תמיסת poly brain למצע.הוסיפו חלקיקי lentivirus של HRNA לצלחונים המתאימים בהתאם לתכנון הניסוי שנקבע מראש. סובבו בעדינות את הצלחונים כדי להפיץ את הנגיף באופן אחיד על פני התאים. דגרו למשך 18 עד 20 שעות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח באטמוספירה של 5% carbon dioxide.ביום למחרת, שאבו את המצע המכיל את הווירוס והוסיפו מצע מלא רענן ללא poly brain. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך הלילה. ביום הרביעי, שאבו את המצע מהתאים והוסיפו מצע רענן המכיל את הרכיב הטיפולי בריכוז אופטימלי שנקבע מראש. לאחר מכן, טפלו בתאים באמצעות הרכיב למשך משך זמן שנקבע מראש.במחקר זה, התאים מטופלים ב-100 nanograms per milliliter של trail וב-1 micromolar של paclitaxel למשך 48 שעות. לאחר הטיפול, יש להעביר את התאים השורדים לבקבוקי T 75 ולאפשר להם להתרבות עד להגעה לכמעט 100% confluent לצורך ביצוע דה-קונוולוציה פוליקלונלית (polyclonal deconvolution). אוכלוסיית התאים ההטרוגנית נאספת מכל תת-מאגר וה-DNA הגנומי מבודד.התחילו את הליך שחזור התבנית של ה-S-H-R-N-A בהכנת תגובת ה-PCR כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. פריימרים להגברה בריכוז של 20 millimolar כלולים בערכת ה-lenti plex. הכינו בקרת חיובית באמצעות וקטור בקרת חיובי אנושי mission SHRA המדולל לריכוז המתאים כתבנית.הגברה מוצלחת עם תבנית זו מעידה כי רכיבי בדיקת ה-PCR ותנאי המחזורים הולמים. שמרו את תוכנית ה-PCR המפורטת בפרוטוקול הכתוב במכשיר הטרמוסייקל ובצעו הגברה של היעד. עם סיום המחזור, ערבבו שלושה מיקרוליטרים מכל תגובת PCR עם מיקרוליטר אחד של צבע, ובצעו אלקטרופורזה לצד סולם 100 base pair low בג'ל אגרוז 1% כדי לאשר את נוכחותו של אמפליקון באורך 309 base pair.בשלב זה, מוכנסים תוצרי ה-PCR (Amplicons) לסב-שכפול (sub cloning) באמצעות ערכת topo ta cloning בהתאם לפרוטוקול היצרן. התוצאה היא שכל וקטור מכיל תוצר PCR אחד. עם השלמת הסב-שכפול, בודדים 250 מושבות חיידקים נפרדות, שכל אחת מהן מכילה תוצר PCR בודד.גדלו את המושבות הבודדות בתרביות של שני מיליליטר, מהן ניתן להפיק את ה-plasmid DNA באמצעות ערכת Gen Elute plasmid mini prep. לאחר עיכור של ה-plasmid DNA המופק בעזרת EcoRI, ניתן לאשר את נוכחות ה-insert באמצעות אלקטרופורזה. לבסוף, מתוך דגימות ה-plasma DNA שהוכנסו לריצוף, ניתן לזהות את ה-S-H-R-N-A insert באמצעות מאגר הנתונים Plex HRNA sequence search המסופק עם ספריית PLX. מצאו את תיבת החיפוש בטופס הגישה למאגר נתוני חיפוש רצפי S-H-R-N-A המצורף לתחילת רצף ה-HRNA.הזינו את 10 עד 21 הנוקלאוטידים הבאים של רצף השאילתה. לאחר מכן, בחרו את המין של ה-S-H-R-N-A המאוחד. ניתן לבחור באופן רציונלי את תת-המאגר שבו נמצא הרצף.כעת לחצו על כפתור find potential hits כדי לבצע את החיפוש. פעולה זו אמורה לזהות את רצפי ה-T-R-C-S-H-R-N-A התואמים לנתוני הריצוף. ניתן להשתמש באתר הגנים המועדף עליכם, Sigma aldrich, כדי למצוא מידע נוסף על רצפי ה-TR CS HRA שזוהו ועל הגנים המטרות התואמים להם. יש לתקף את הגנים המטרות שזוהו על ידי חזרה על בדיקת הסריקה המקורית עם הכלון המקורי של TRC ובתוספת של לפחות שני RNA נוספים המטרגטים את אותו הגן, תוך שימוש בפורמט של one HRNA לכל צלחת 60 millimeter.פגיעות אמיתיות (True hits) יציגו את אותו הפנוטיפ ברוב הצלחות. קלונים המכילים את וקטור השחזור עם פרגמנט PCR בודד בודדו באמצעות פרוצדורת שחזור התבנית של ה-SHRA, והסרט HRNA זוהה באמצעות מאגר חיפוש הרצפי של lenti plex SHRA. 250 קלונים עברו רצף.מתוכם, 25 יוצגו על ידי מספר שיבוטים, וה-225 הנותרים יוצגו על ידי שיבוט אחד בלבד ולא נבחנו הלאה. כפי שמוצג כאן, מספר גנים מועמדים, כולל TBX three, PPP two, ca, ו-AKT two, יוצגו על ידי מספר שיבוטים. גורם השעתוק T box שנקרא TBX three הופיע בסך הכל בארבעה שיבוטים והוא מעורב בנדידת גידולים.הוכח כי ביטוי חסר (downregulation) של PPP2CA שומר על צמיחתן של תאי LN Cap המגודלים בתנאים של מחסור באנדרוגן, על ידי שחרור המעצר של מחזור התא המושרה על ידי מחסור באנדרוגן ומניעת אפוप्टוזיס. יתרה מכך, AKT2 הוא Arak Beta Syrian three Anine protein kinase ואונקוגן משוער שהוכח כממלא מספר תפקידים בהתפתחות סרטן. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה של אופן השימוש במיסיה.ספריית shRNA מאובקת (pooled) של Len Plex לביצוע מהיר של מחקרי אובדן תפקוד גני בהסריקה רחבה (high throughput).

mission-lentiplex-pooled-shrna-library-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו להשתמש בספריית esiRNA האדם המסך תפוקה גבוהה עבור גנים המעורבים חלוקת התא. אנו מדגימים כיצד להקים ולנהל מסכי esiRNA, וכן כיצד לנתח ולאמת את התוצאות.

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

ספריית מזהה היעד הוא פלסמיד מבוסס, הגנום כולו אוסף של cDNA משובטים לשמש לזיהוי מטרות מירנה. כאן אנו מדגימים את השימוש והיישום.

הגנום כולו מסך עבור מטרות מירנה שימוש יעד המשימה ספריית מזהה

אנחנו ניצור קשר עם סיכת ראש קטנה RNA (shRNA) ופרוטוקול הבא הדור המבוססת על רצף לזיהוי הרגולטורים האינקטיבציה שמושרש בקו תא מאתר עם גחלילית לוציפראז ומאוחדים. גנים עמידות hygromycin עם איזה CpG מחייב חלבון 2 ( MeCP2) גנים על כרומוזום ה-X לא פעיל.

במאגר shRNA מסך עבור הפעלה מחדש של MeCP2 על כרומוזום X לא פעיל

ספרייה CRISPR/sgRNA הוחל כדי לחקור חלבונים. עם זאת, הכדאיות של ספרייה sgRNA לחשוף את הפונקציה של גבול CTCF ב הכונה נשאר נחקרו. כאן, אנו מתארים ספרייה ספציפית sgRNA לוקוסים HOX התירי את הפונקציה של גבולות CTCF HOX לוקוסים.

HOX לוקוסים Focused CRISPR/sgRNA ספריית הקרנת זיהוי קריטי CTCF גבולות

CRISPR-Cas9 הטכנולוגיה מספקת שיטה יעילה בדיוק לערוך את הגנום היונקים בסוג תא כלשהו ומייצג את האמצעים הרומן לבצע מסכי גנטי רחב הגנום. פרוטוקול מפורט לדון בצעדים הנדרשים עבור ביצועים מוצלחים של מסכי CRISPR-Cas9 הגנום הרחב מסופק כאן.

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

כדי לזהות והרגולטורים הרומן של גורמי שעתוק, פיתחנו גישה למסך מסודר או לספריות RNAi ויראלי באמצעות שימוש כפול-לוציפראז מבוסס מבוססת הכתב. גישה זו מציעה דרך מהירה וזולה יחסית להקרין מאות מועמדים בניסוי אחד.

זיהוי של שעתוק מקדם ווסת באמצעות הקרנת תפוקה בינונית של ספריות מסודר וכתבת המבוססת על כפול-לוציפראז

בדיקת הפרעות RNA בתפוקה גבוהה (RNAi) באמצעות מאגר של shRNA לנטי-ויראליים יכולה להיות כלי לאיתור מטרות קטלניות סינתטיות רלוונטיות מבחינה טיפולית בממאירות. אנו מספקים גישת סינון shRNA משולבת כדי לחקור את האפקטים האפיגנטיים בלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML).

הקרנה משולבת של ספריית shRNA לזיהוי גורמים המווסתים פנוטיפ עמידות לתרופות

באמצעות שימוש בפולימר קטיוני פולימרי זול פוליאתילן (PEI), ייצרנו חלקיקים לנטי-ויראליים לביטוי יציב של shRNA בתאי גזע עובריים אנושיים H9 (hESCs) ותאי אב עצביים שמקורם ב-H9 (NPCs) שעברו התמרה חולפת ביעילות גבוהה.

Lentiviral מתווך אספקה של shRNA ל- hESCs ו- NPCs באמצעות פולימר קטיוני בעלות נמוכה Polyethylenimine (PEI)

פיתחנו גישה אונקוגנומית השוואתית חוצת מינים המשתמשת בניתוחים גנומיים ובמסכים גנומיים פונקציונליים כדי לזהות ולהשוות מטרות טיפוליות בגידולים הנובעים ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית וסוג הגידול האנושי המתאים.

פרופיילינג גנטי וסינון נשירה בקנה מידה גנומי לזיהוי מטרות טיפוליות במודלים עכבריים של גידול ממאיר במעטפת עצב היקפית

פרוטוקול זה מתאר גישת סקר CRISPR תוך-צינורית ניתנת להרחבה, המאפשרת מחקרים מקבילים של הכיבוי וההפעלה של הגנים בחיים בבלוטת השד של העכבר.

סקר מקביל ב-vivo של השמדת גנים והפעלה בבלוטת השד של העכברים

למד כיצד לבצע מסכי בחירה חיוביים באמצעות ספריית shRNA של LentiPlex בתאי יונקים. השיטה מאפשרת זיהוי מהיר של גנים המקדמים הישרדות תאית מול סוכנים תרופתיים נוגדי סרטן.

LentiPlex המשימה משולב הקרנת shRNA ספריית בתאי יונקים

גלה סרטונים נוספים