Name: GENPLAT: פלטפורמת Automated Discovery עבור ביומסה אנזימים ואופטימיזציה קוקטייל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: למד אופטימיזציה של קוקטיילים אנזימטיים לפירוק ביומסה ליגנוצלולוזית לסוכרים תסיסים באמצעות פלטפורמת GENPLAT האוטומטית. השיטה משפרת את יעילות ייצור הביודלק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי משרד האנרגיה האמריקני Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE משרד המדע BER DE-FC02-07ER64494) ולהעניק DE-FG02-91ER200021 ממשרד האנרגיה של ארה&quot;ב, משרד האנרגיה של יסוד מדעי, אגף של מדעי הכימיה, Geosciences ו Biosciences. אנו מודים ג&#39;ון סקוט קרייג ומליסה Borrusch חומר שלהם תרומות מושגית.

1. אנזימים הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר חלבונים pastoris Pichia על ידי שיבוט של הגנים המתאימים לתוך וקטורים pPICZ או pPICZα ו והפיכתו פ pastoris. לגדל תאים של 300 מ"ל קבוצות ב -500 מ"ל צלוחיות מבולבל עם אינדוקציה מתנול בכל שעה 24 (Banerjee et al. 2010a). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז desalt filtrates תרבות על ידי סינון תזרים משיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות אנזימים aliquots קטן גליצרול 20% ב -80 ° C. טווח הריכוז הוא 10-10 מ"ג / מ"ל. </li></ol> 2. עיצוב של ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר קלט של אנזימים להיבדק, והעליון שלהם בפרופורציות נמוכות (למשל שיעור נמוך יותר של 5% עבור אנזימים הליבה), ואת סוג של תכנון הניסוי (למשל, ריבועית או מעוקב) לתוך Design-Expertsoftware. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הסכום מיקרוגרם של אנזים זה יתווספו לבצע העמסה הכולל של גלוקן מ"ג / g 15, ולאחר מכן לחשב את כמות האנזים כל μl להוסיףכל תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת גליונות עבודה של Excel labware ציון מקור, מקור בארות, labware היעד, בארות היעד כרכים העברה מחלק מים ואנזימים על פי תכנון ניסויי ולייבא אותו לתוך התוכנה Biomek FXP באמצעות פונקציית העברה מ-file. </li></ol> 3. אנזימתי הידרוליזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את slurry ביומסה ציטראט 50 מ"מ נתרן, pH 4.8, המכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו טטרציקלין 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​cycloheximide, במאגר ההנעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רובוט 200 pipet μl של slurry לתוך היטב כל אחד 96-באר עמוקה, גם באמצעות צלחות התגובה Span-1000-8 μl טיפים pipet עם 0.5 ס"מ האחרונה מנותקת. מערבבים את slurry פעם μl 100 / sec ואז לשאוב באותו נפח ממאגר ההנעה ולחלק לתוך הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את האנזימים לתוך צלחת אותו באמצעות התוכנית נכנסה המט"ח Beckman. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחות עם capmats לנקבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפוך והקשהצלחות מספר פעמים להתגבר על מתח הפנים. מקמי את הצלחות על 50 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות את ההכלאה חממה מסתובב בסל"ד 10. </li></ol> 4. קביעת Glc ו Xyl <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחות התגובה דקות 3 XG ב 1250 בצנטריפוגה דלי מתנדנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl של supernatant לתוך צלחות 96-היטב קבוע באמצעות תרמיל AP96 של FX Biomek. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ב 90-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על מנת להשבית את האנזימים, ולאחר מכן צנטריפוגות XG ב 1250 למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדידות Glc, להעביר 12 μl של supernatants לתוך 96-היטב צלחות קבוע. הוסף 192 μl של מגיב מונואמין / peroxidase (GOPOD) גלוקוז. דגירה צלחות ב 50 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ולקרוא את absorbances ב 510 ננומטר קורא microplate. בלנק הוא תערובת התגובה עם האנזים לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדידות Xyl, להעביר 4 ​​μl לתוך 384 גם הצלחות. מוסיפים את ריאגנטים assay ולקרוא את הצלחות ב 340 ננומטר. ריקהוא תערובת התגובה עם האנזים לא. </li></ol> 5. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המר את ערכי ספיגת ל% Glc שלהם תשואות Xyl מבוסס על Glc ידוע תוכן Xyl של ביומסה המקורי. ייבוא ​​אלה אחוזי כתגובות לתוך תוכנת עיצוב-המומחה. בדוק את paramenters סטטיסטי כדי להיות בטוח כי הקריטריונים מודל החזקה מתקיימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר את חיזוי המודל הטוב ביותר בניסוי. </li></ol> 6. תוצאות עם נציג GENPLAT: (1) יצירה של תערובות אופטימיזציה של חלבונים טהורים בודדים. תוצאות המחקר מראות אשר אנזימים חשובים, ובאיזה פרופורציות, וגם אנזימים אשר אינם חשובים. כמה חלבונים בשפע ט reesei secretome (Nagendran et al., 2009), כגון Cip1 ו Cip2, להופיע לשחק שום תפקיד Glc שחרור Stover תירס pretreated על ידי הרחבת אמוניה סיבים (AFEX) או hyd אלקליין רוגן חמצן (AHP) (Banerjee et al. 2010b). מצד שני, כמה חלבונים חשובים באופן בלתי צפוי. לדוגמה, אנדו, xylanases משפחות Hydrolase Glycosyl 10 ו -11 הן חשובות עבור Glc שחרור, אחד xylanase לא יכולה להוות תחליף אחר (Banerjee et al, 2010b, ג.). Cel61A, חלבון קטין ט reesei secretome, חשוב מאוד Glc אך לא Xyl לשחרר. כמה אנזימים חשובים עבור שחרורו של שניהם Glc ו Xyl, בעוד שאחרים נדרשים רק עבור זה או אחר (Banerjee et al. 2010c). תערובת סינתטי המכיל 16 מרכיבים, שכל אחד מהם בריכוז של 0.94 מ"ג / מ"ל ​​(כלומר, תערובת לא אופטימלית), שוחררו 38% Glc זמינים AFEX-pretreated DDG. הידרוליזה בתנאים זהים, תערובת אופטימלית, שבה ריכוזים של 16 רכיבים נע בין 0% ל -32%, שוחררו 52% Glc (איור 2). ניסוי זה ממחיש את התועלת של בניית תערובות מוגדרות. _content "&gt; (2) יצירה של קוקטיילים אופטימיזציה עבור המקדים שונות / שילובים המצע. נוכחי ההכנות cellulase מסחריים הם" אחד בגודל-fits-all ". במציאות, קוקטייל הטובה ביותר תלויה המצע והן המקדים. מוצר יחיד כמו Accellerase 1000 נותן תשואות שונה מצעים שונים pretreated באותה הדרך, ומן המצע אותו חשוף pretreatments שונות (איור 1). השתמשנו GENPLAT כדי לייעל את תערובות של אנזימים טהור pretreatments מרובים feedstocks mutiple (Banerjee et al. 2010c). איור 2 מראה כיצד הפרופורציות האנזים אופטימלי של 16 אנזימים טהור שונה עבור AFEX-pretreated Stover תירס, AHP-pretreated Stover תירס, ו-AFEX pretreated DDG. רק 11 אנזימים מוצגות באיור 2. כיוון אופטימלי הפרופורציות של חמישה אחרים (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2 ו Cel12A) נמצאו 0% (Banerjee et al. 2010c). (3) באנזים רומן הגילוי ט ' reesei וא ניז'ר ​​גדלו על מצעים שונים. אחת לחלץ מסוים שיפרה תשואה Glc כאשר הוסיף להגדיר הליבה שלנו. חלבון זה אחראי היה מטוהרים העולם להיות hydrolase glycosyl רומן לא קיים שום הכנה אנזים מסחרי (Banerjee ו וולטון, התוצאות לא פורסם). (4) גילוי אנזימים טוב יותר. הראינו עם GENPLAT אשר אנזימים הם החשובים ביותר של השפלהביומסה מסוימת, יש לנו הבנה טובה יותר של אנזימים אשר צריך להיות המוקד לשיפור. דוגמאות טובות יותר של האנזימים קריטיים ניתן למצוא על ידי חיפוש בטבע או שבוצעו על ידי הנדסת חלבון. (האנזים יכול להיות "טוב יותר" מאשר homolog ט reesei שלה במספר דרכים, בהתאם הנכס הרצוי, פעילות למשל, ספציפיים יותר, סינרגיה גדולה יותר, ירידה ברגישות proteolytic, או יציבות תרמית משופרת). GENPLAT מספק פלטפורמה משמעותית עבור assaying אנזימים פוטנציאל טוב יותר, משום שהוא מנצל קוקטייל מורכב מציאותי (חשוב כי אין אנזים ביומסה עובד בבידוד) ואת מצע ריאליסטי (חשוב כי התוצאות עם תאית טהורה או מצעים מלאכותיים אחרים לא יכול להיות רלוונטי lignocellulosic טבעי חומרים). (5) אנזים מסחרי אופטימיזציה. כמויות גדולות מספיק של אנזימים טהור עדיין לא קיימים בעולם האמיתי. עד שהם עושים, אתנול הפרוducers להסתמך על מוצרים מסחריים כגון Accellerase 1000 ו MultifectXylanase. עם זאת, תערובות של אנזימים מסחריים בדרך כלל ביצועים טובים יותר מכל אדם אחד, ו GENPLAT ניתן להשתמש כדי לעצב קוקטיילים אופטימיזציה של אנזימים מסחרי מרובים. איור 3 מציג את השימוש GENPLAT כדי לייעל תערובת של ארבעה ההכנות אנזים מסחרי. הפרופורציות האופטימלי עבור שחרורו של Glc מ AFEX-pretreated DDG נמצאו 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pectinase, 22% Novozyme 188, ו -4% Multifect Xylanase (Banerjee et al. 2010c). איור 3 ב מציג את ההבדלים בתשואה Glc מ AFEX-DDG עם ארבעה ההכנות אנזים; את התערובת מסחרי מותאם נותן תשואה גבוהה יותר מאשר Glc Accellerase1000 לבד, SpezymeCP בלבד, או תערובת 16-מרכיב סינתטי. ניסוי זה גם מציין כי את התערובת 16-מרכיב סינתטי חסר אחד או יותר האנזימים הדרושים אופטימלי Glc שחרור, אשר נמצאים אחד או יותר של האנזימים מסחרי. GENPLAT ניתן לנועורך לזהות מרכיבים כאלה. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ללא הכנה יחיד אנזים מסחרי הוא אופטימלי עבור כל מצעים וכל pretreatments. חמש מצעים ושלושה pretreatments הושוו בתנאים דומים של שחיקה (החלקיקים בגודל 0.5 מ"מ), טוען האנזים (15 מ"ג / g גלוקן), ותנאי הידרוליזה (48 שעות, 50 ° C). A. עיכול של AFEX-pretreated מצעים שונים עם Accellerase 1000. עיכול ב 'של Stover תירס pretreated על ידי שלוש שיטות שונות עם Accellerase 1000 (ראה בנרג'י et al. 2010c). <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> באיור 2. הפרופורציות אופטימלית של 11 אנזימים עבור שחרורו של Glc מ AFEX-pretreated Stover תירס (AFEX-CS), אלקליין חמצן, מימן pretreated Stover תירס (AHP-CS), או AFEX-pretreated יבשים לזקקERS "דגנים (AFEX-DDG). הנתונים הם מתוך בנרג'י et al. (2010c). מספרים לאורך החלק העליון של הסורגים הם התשואות Glc כאחוז מסך Glc במדגם ביומסה. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3 א. השימוש GENPLAT לייצר תערובת אופטימלית של ארבעה ההכנות אנזים מסחרי עבור שחרורו של Glc מ AFEX-pretreated DDG. Multifect Xylanase עשה את התרומה הקטנה ביותר (4%) ו - הושמט ולכן מן התרשים הזה משולשת. התשואות ב Glc מ AFEX-DDG עם טיפולים אנזים שונה בתנאים זהים הידרוליזה (15 מ"ג / g אנזים גלוקן, 48 שעות, 50 ° C) . "ארבע מרכיב מסחרי" יש את הפרופורציות נקבע מהניסוי באיור. 3A.

<ol><li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+MJ+%22DOE+Simplified%3A+Practical+Tools+for+Effective+Experimentation%22">DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation</a>. , 2nd Edition, Productivity Press. New York. (2007).</li>
<li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+enzyme+mixtures+for+biomass+deconstruction%3A+production+and+optimization+of+a+core+set%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioengineer%22%5BJournal%5D)">Synthetic enzyme mixtures for biomass deconstruction: production and optimization of a core set.</a> Biotechnol. Bioengineer. 106, 707-720 (2010).</li>
<li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Bongers, M., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+multi-component+enzyme+mixtures+for+deconstruction+of+lignocellulosic+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Synthetic multi-component enzyme mixtures for deconstruction of lignocellulosic biomass.</a> Bioresour. Technol. 101, 9097-9105 (2010).</li>
<li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+optimization+of+enzyme+mixtures+for+deconstruction+of+diverse+pretreatment%2Fbiomass+feedstock+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Rapid optimization of enzyme mixtures for deconstruction of diverse pretreatment/biomass feedstock combinations.</a> Biotechnol. Biofuels. 3, 22-22 (2010).</li>
<li>Berlin, A., Maximenko, V., Gilkes, N., Saddler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+enzyme+complexes+for+lignocellulose+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimization of enzyme complexes for lignocellulose hydrolysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 97, 287-296 (2007).</li>
<li>Decker, S. R., Brunecky, R., Tucker, M. P., Himmel, M. E., Selig, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+techniques+for+biomass+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Bioenerg.+Res%22%5BJournal%5D)">High throughput screening techniques for biomass conversion.</a> Bioenerg. Res. 2, 179-192 (2009).</li>
<li>Gao, D., Chundawat, S. P., Krishnan, C., Balan, V., Dale, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixture+optimization+of+six+core+glycosyl+hydrolases+for+maximizing+saccharification+of+ammonia+fiber+expansion+%28AFEX%29+pretreated+corn+stover%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Mixture optimization of six core glycosyl hydrolases for maximizing saccharification of ammonia fiber expansion (AFEX) pretreated corn stover.</a> Bioresour. Technol. 101, 2770-2781 (2010).</li>
<li>Harris, P. V., Welner, D., McFarland, K. C., Re, E., Poulsen, J. C. N., Brown, K., Salbo, R., Ding, H., Vlasenko, E., Merino, S., Xu, F., Cherry, J., Larsen, S. Y., LoLeggio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+lignocellulosic+biomass+hydrolysis+by+proteins+of+glycoside+hydrolase+family+61%3A+Structure+and+function+of+a+large%2C+enigmatic+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stimulation of lignocellulosic biomass hydrolysis by proteins of glycoside hydrolase family 61: Structure and function of a large, enigmatic family.</a> Biochemistry. 49, 3305-3316 (2010).</li>
<li>Kim, E., Irwin, D. C., Walker, L. P., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factorial+optimization+of+a+six-cellulase+mixture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Factorial optimization of a six-cellulase mixture.</a> Biotechnol. Bioeng. 58, 494-501 (1998).</li>
<li>King, B. C., Donnelly, M. K., Bergstrom, G. C., Walker, L. P., Gibson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+microplate+assay+system+for+quantitative+evaluation+of+plant+cell+wall-degrading+enzyme+activity+of+fungal+culture+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">An optimized microplate assay system for quantitative evaluation of plant cell wall-degrading enzyme activity of fungal culture extracts.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 1033-1044 (2009).</li>
<li>Nagendran, S., Hallen-Adams, H. E., Paper, J. M., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+genomic+potential+for+secreted+plant+cell-wall-degrading+enzymes+in+the+ectomycorrhizal+fungus+Amanita+bisporigera%2C+based+on+the+secretome+of+Trichoderma+reesei%5BTitle%5D)+AND+%22Fung.+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reduced genomic potential for secreted plant cell-wall-degrading enzymes in the ectomycorrhizal fungus Amanita bisporigera, based on the secretome of Trichoderma reesei.</a> Fung. Genet. Biol. 46, 427-435 (2009).</li>
<li>Rosgaard, L., Pedersen, S., Langston, J., Akerhielm, D., Cherry, J. R., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+minimal+Trichoderma+reesei+cellulase+mixtures+on+differently+pretreated+barley+straw+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Evaluation of minimal Trichoderma reesei cellulase mixtures on differently pretreated barley straw substrates.</a> Biotechnol. Prog. 23, 1270-1276 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הוא זוכה להכרה רחבה, כי הפחתת העלות של אנזימים חשוב בהתפתחות של תעשיית האתנול חסכוני lignocellulosic. כרגע זמין קוקטיילים אנזים מסחריות הן תערובות מורכבות מוגדרת היטב של חלבונים רבים (Nagendran et al., 2009), והם מותאמים בעיקר לשימוש על חומצה pretreated Stover תירס. על מנת להאיץ את הפיתוח של קוקטיילים אנזים טוב יותר, מעבדות כמה פיתחו תפוקה גבוהה פלטפורמות גילוי האנזים ואפיון. המאמצים בתחום זה שילבו אחד או יותר מהמאפיינים הבאים נמצא גם GENPLAT: מחלק הרובוטית של אנזימים slurries ביומסה, עיצוב הסטטיסטית של הניסוי, ו / או קביעה אוטומטית של Glc ו Xyl (ברלין et al, 2007; דקר et. al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT מרחיב את המאמצים האלה מוקדם יותר, באופן משמעותי ביותר את המורכבות של תערובות האנזים כי ניתן לנתח מן היותר 6 רכיביםמחקרים קודמים יותר מ 16 בעבודה האחרונה שלנו (Banerjee et al. 2010c). תכונות עיקריות נוספות של GENPLAT הן את השימוש של חדר ערבוב חרוז (מאגר ההנעה) שיכולה לשמור slurries סטובר הושעה במהלך מחלק; ערבוב עדין במהלך העיכול על ידי סיבוב קצה מעל הקצה; ונחישות colorimetric אוטומטי של Glu ו Xyl.

ציוד ותוכנה בשימוש: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב, מומחה התוכנה, גרסה 8.0 (Stat-קלות, Inc, מיניאפוליס, מינסוטה) ( <a href="http://www.statease.com">http://www.statease.com</a> ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biomek FXP מעבדה אוטומציה תחנת עבודה (Beckman-קולטר, Fullerton, CA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biomek FXP התוכנה, גרסה 3.3 (Beckman-קולטר, Fullerton, CA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוט המאגר (דגם VP-756C 1P100, V &amp; P מדעי בע&quot;מ, סן דייגו) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות, 96-עמוק (1.5 מ&quot;ל) גם (Abgene, פישר סיינטיפיק, Epson, בריטניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Capmats לנקבה (ארה&quot;ב מדעי, אוקלה, פלורידה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב הכלאה חממה (דגם 5420, VWR) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Swinging-דלי צנטריפוגה (דגם 5810R, Eppendorf, המבורג, גרמניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות, שחקן המשנה 96-היטב (Abgene, פישר סיינטיפיק, Epson, בריטניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות, 384-היטב (BD פלקון, BD Biosciences, בסן חוזה, קליפורניה) </li></ol> ריאגנטים בשימוש: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pichia pastoris ו וקטורים: זן X33, ו pPICZ ו pPICZα (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ט &#39;ו reesei וקטורים: זן QM9414 (משרד החקלאות של ארה&quot;ב המרכז הלאומי לחקר ניצול חקלאי, Peoria, IL) ו pCB1004-EV (Banerjee et al, 2010b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Accellerase 1000 (מספר רב 1600844643) (Genencor, Inc, רוצ&#39;סטר, ניו יורק) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 סודיום ציטרט mM חיץ, pH 4.8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טטרציקלין במלאי: 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניות Cycloheximide: 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> GOPOD assay הערכה, קטלוג K-GLUC (Megazyme, בריי, אירלנד) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קסילוז assay הערכה, קטלוג K-קסילוז (Megazyme, בריי, אירלנד) </li></ol>

genplat: פלטפורמת automated discovery עבור ביומסה אנזימים ואופטימיזציה קוקטייל

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

העלות הגבוהה של אנזימים לפירוק ביומסה מהווה מכשול מרכזי להמרה כלכלית של חומרי גלם ליגנוצלולוסיים לדלקים נוזליים להסעה, כגון אתנול. פיתחנו פלטפורמה משולבת בעלת תפוקה גבוהה, הנקראת GENPLAT, לגילוי ופיתוח של אנזימים חדשים ותערובות אנזימטיות לשחרור סוכרים משילובי קדם-טיפול/ביומסה מגוונים. GENPLAT מורכבת מארבעה אלמנטים: אנזימים טהורים בודדים, תכנון סטטיסטי של ניסויים, פיפטאז Robotic של תמיסות ביומסה ואנזימים, וקביעה קולורימטרית אוטומטית של Glc ו-Xyl ששוחררו. אנזימים בודדים מופקים על ידי ביטוי ב- Pichia pastoris או Trichoderma reesei, או על ידי ניקוי כרומטוגרפי מתערובות מסחריות או מתמציות של מיקרואורגניזמים חדשים. מודלי תערובת מסוג Simplex lattice (פקטוריאלי חלקי) מתוכננים באמצעות תוכנה סטטיסטית מסחרית לתכנון ניסויים (Design of Experiment). תערובות אנזימטיות בעלות מורכבות גבוהה מובנות באמצעות פיפטאז Robotic לפורמט של 96 בארות. מדידת Glc ו-Xyl ששוחררו מבוצעת באופן אוטומטי באמצעות בדיקות קולורימטריות מקושרות לאנזימים. תערובות אנזימטיות אופטימליות המכילות עד 16 רכיבים נבחנו על מגוון שילובי חומרי גלם וקדם-טיפול.
GENPLAT ניתן להתאימה לתערובות של אנזימים טהורים, תערובות של מוצרים מסחריים (למשל, Accellerase 1000 ו-Novozyme 188), תמציות של מיקרובים חדשים, או שילובים שלהם. הכנה ובדיקה של תערובות של ˜10 אנזימים טהורים דורשות פחות מ-100 μg של כל חלבון ופחות מ-100 תגובות בסך הכל, כאשר הפעולה מתבצעת בעומס סופי כולל של 15 mg protein/g glucan. אנו משתמשים באנזימים ממקורות שונים. ניתן לטהר אנזימים ממקורות טבעיים כגון תרביות פטריות (למשל, Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, ו-Galerina marginata), או שניתן להפיק אותם על ידי ביטוי של הגנים המקודדים (שהתקבלו ממספר גדל והולך של רצפי גנומים מיקרוביאליים) במארחים כגון E. coli, Pichia pastoris, או פטרייה חוטית כגון T. reesei. ניתן לטהר חלבונים גם מתערובות אנזימים מסחריות (למשל, Multifect Xylanase, Novozyme 188). מספר גדל והולך של אנזימים טהורים, כולל glycosyl hydrolases, esterases הפעילים בדופן התא, proteases ו-lyases, זמינים ממקורות מסחריים, למשל, Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), ו-PROZOMIX (www.prozomix.com).
תוכנת Design-Expert (חברת .Stat-Ease, Inc) משמשת ליצירת מערכי סמפלקס-סריג (simplex-lattice designs) ולניתוח תגובות (במקרה זה, שחרור Glc ו-Xyl). תערובות מכילות 4-20 רכיבים, אשר פרופורציות השילוב ביניהם יכולות להשתנות בין 0 ל-100%. נקודות הבדיקה כוללות בדרך כלל את קודקודי הקיצון עם מספר מספיק של נקודות ביניים כדי להפיק מודל תקף. בטרמינולוגיה של תכנון ניסויי, מרבית המחקרים שלנו הם ניסויי "תערובת" (mixture), כלומר סכום כל הרכיבים משלים לעומס חלבון כולל קבוע (המבוטא כ-mg/g גלוקאן). מספר התערובות בסמפלקס-סריג תלוי הן במספר הרכיבים בתערובת והן בדרגת הפולינום (ריבועי או קובי). לדוגמה, ניסוי עם 6 רכיבים יכלול 63 תגובות נפרדות עם מודל קובי מורחב (augmented special cubic model), המסוגל לזהות אינטראקציות של שלושה גורמים, בעוד שרק 23 תגובות בודדות נדרשות עבור מודל ריבועי מורחב. עבור תערובות המכילות יותר משמונה רכיבים, תכנון ניסויי ריבועי הוא מעשי יותר, ובניסיוננו מודלים אלו הם בדרך כלל תקפים סטטיסטית.
כל עמוסי האנזימים מבוטאים כאחוז מהעומס הכולל הסופי (שבניסויים שלנו הוא בדרך כלל 15 mg protein/g glucan). עבור אנזימי "ליבה", הגבול העליון של האחוז הנמוך נקבע על 5%. גבול זה נגזר מהניסיון שלנו, שבו תשואי Glc ו/או Xyl היו נמוכים מאוד אם אנזים ליבה כלשהו היה נוכח ב-0%. מודלים דלים נובעים ממספר רב מדי של דגימות המראות תשואי Glc או Xyl נמוכים מאוד. קביעת גבול תחתון קובעת בתורה גבול עליון. כלומר, בניסוי עם שישה רכיבים, אם הגבול התחתון עבור כל רכיב בודד נקבע על 5%, אזי הגבול העליון של כל רכיב בודד יהיה 75%. הגבולות התחתונים של כל שאר האנזימים הנחשבים כ"עזר" נקבעו על 0%. "ליבה" ו"עזר" הם כינויים שרירותיים במידת מה וישתנו בהתאם לסובסטרט, אך במחקריהם, אנזימי הליבה לשחרור Glc מ-corn stover כוללים את האנזימים הבאים מ-T. reesei: CBH1 (המוכר גם כ-Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10), ו-BX (β-xylosidase).
<div id="myEventWatcherDiv">
	 </div>

GENPLAT (רציף GLBRC אנזימים) מהווה פלטפורמה אוטומטיות לגילוי ואופטימיזציה של קוקטיילים אנזים לפירוק ביומסה. זה יכול להיות מותאם ממקורות מרובים תערובות של אנזימים המכילים רכיבים מרובים.

GENPLAT: פלטפורמת Automated Discovery עבור ביומסה אנזימים ואופטימיזציה קוקטייל

העלות הגבוהה של אנזימים לפירוק ביומסה מהווה מכשול מרכזי להמרה כלכלית של חומרי גלם ליגנו-צלולוזיים לדלק נוזלי...

בפרוצדורה זו, תערובות אנזימים להמרת ביומסה של ליגנוצלולוז לסוכרים חופשיים מותאמות באופן אופטימלי באמצעות מערכת אוטומטית הידועה כפלטפורמת האנזימים A-G-L-B-R-C או gen plat. ראשית, תוכנן מודל תערובת שבו משולבים ארבעה עד 18 אנזימים נפרדים ביחסים שונים של עד 96, באמצעות תוכנה לתכנון ניסויים (design of experiment). לאחר מכן, הביומסה והאנזימים מועברים באמצעות פיפט ללוחיות של 96 בארות עמוקות (deep well plates) בעזרת מערכת רובוטית לטיפול בנוזלים.הפלטות נחתמות ומודגרות למשך 48 שעות ב-50 °C. לאחר ההדגרה, נדגמות הבארות באמצעות מערכת אוטומטית לטיפול בנוזלים, והגלוקוז והקסילוז החופשיים נמדדים באמצעות בדיקה אנזימטית מצומדת קולורימטרית. לאחר מכן, נעשה שימוש בתוכנה לתכנון ניסויים (DOE) כדי לקבוע אילו שילובי אנזימים מניבים את הכמות המקסימלית של גלוקוז וקסילוז חופשיים.המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבחון בו-זמנית את היעילות של תערובות אנזימים שונות להמרת חומרי ביומסה של ליגנוצלולוז לסוכרים הניתנים לתסיסה עבור אתנול, במטרה כוללת להפחית את עלויות ייצור הדלק הביולוגי. למרות שאנו משתמשים בשיטה זו בעיקר לניתוח תערובות אנזימים על גבעולי תירס שעברו קדם-טיפול בסיסי, היא ניתנת להתאמה לכל סוג של קדם-טיפול בכל חומר גלם, כגון צפצפה שעברה טיפול חומצי, דשא-מטס (switch grass) ושאריות מזקקה מיובשות. טכניקה זו יכולה לשמש לגילוי אנזימים חדשים החשובים לפירוק ביומסה ולמציאת דוגמאות טובות יותר של אנזימים ידועים.למרות שהאנזימים המשמשים עבור לוחיות gem עשויים להגיע ממקורות שונים, האנזימים המשמשים בהדגמה זו הופקו באמצעות ביטוי של PPIC או PPIC alpha בתאי Pia Pastis gro במנות של 300 milliliter ובבקבוקי ערבוב (baffled flasks) של 500 milliliter במשך שלושה ימים. לאחר מכן, במהלך ארבעת הימים הבאים, בצעו אינדוקציית מתנול כל 24 שעות לאחר היום האחרון של אינדוקציית המתנול. שפכו את הדגימות למערכת סינון זרימה טנגנציאלית עם ממברנה בעלת סף של 10 kilodalton כדי לרכז ולהסיר מלחים מהתרבית.לאחר מכן מבצעים החלפת בופר לתסננים באמצעות חמישה נפחים של sodium acetate בריכוז 25 millimolar ו-pH 5, ומרכזים את הדגימה כדי להביא את הנפח לטווח שבין 10 ל-25 milliliters. מודדים את כמות החלבון בשיטת BCA כאשר BSA משמש כסטנדרט; הריכוז הסופי של תמיסות המלאי של האנזים צריך להיות 0.5 עד 10 milligrams per milliliter. מאחסנים את האנזימים באליקוטים קטנים ב-20% glycerol בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius לצורך יצירת תכנוני simplex lattice.התחילו בפתיחת תוכנת ה-design expert במחשב. הזינו את מספר האנזימים לבדיקה ואת הפרופורציות העליונות והתחתונות. לדוגמה, פרופורציה תחתית של 5% עבור אנזימי הליבה, ולאחר מכן ציינו אם התכנון הניסיוני הוא ריבועי (quadratic) או קובי (cubic).שימוש במודל ריבועי (Quadratic) נחוץ עבור תערובות בעלות יותר משמונה רכיבים ב-Excel. חשב את הכמות במיקרוגרמים של כל אנזים שיש להוסיף כדי להטעין סך כולל של 15 מיליגרם לגרם גלוקאן לדגימה. לאחר מכן, חשב את הכמות של כל אנזים במיקרוליטרים שיש להוסיף לכל תגובה, בהתבסס על ריכוזי החלבון של תמיסות המקור.צרו גיליונות Excel נוספים, תוך פירוט בארות המקור ב-LabWare, יעד LabWare, בארות היעד ונפחי ההעברה לחלוקה של מים ואנזימים בהתאם לתכנון הניסוי. לבסוף, ייבאו את גיליון העבודה לתוכנת Biome FX באמצעות פונקציית ההעברה מקובץ (transfer from file) כדי להפיק תמיסת בוץ של ביומסה מתבליט תירס שעברה טיפול מקדים. שפכו את הביומסה המיובשת לתוך טחנת Wiley וטחנו אותה עד למעבר דרך נפה של 0.5 millimeter.אסוף את הביומסה הטחונה לכוס כימית. תכולת הגלוקאן נמדדת בשיטות סטנדרטיות כפי שמתואר ב-JoVE particle comprehensive compositional analysis of plant cell walls, part one lignin. לאחר שנקבעה תכולת הגלוקאן, ערבב את הביומסה עם באפר נתרן ציטראט כך שריכוז הגלוקאן הסופי יהיה 0.5%. הפעל את מיכל הטורף ושפוך לתוכו את תרחיף הביומסה.בעוד שהאנזימים נמצאים על קרח, הכמות הדרושה מכל אנזים תלויה בהיקף הניסוי לצורך חלוקת הביומסה. הכנת תרחיפים תתבצע באמצעות קצות טיפים רחבים, שיוצרו על ידי חיתוך של 0.5 סנטימטר מהקצה באמצעות להב תער. שמונה טיפים של פיפט של 100 microliter.ניתן להשתמש שוב בקצות הפיפטה הקצוצות של ה-SPAN eight. לאחר הקציצה, הנח את הקצות בתיבת פיפטות כך שניתן יהיה לאסוף אותם באופן אוטומטי על ידי ה-SPAN eight. מכשיר זה מצויד ביחידת SPAN eight בעלת פונקציית קצה חד-פעמית שניתן להשתמש בה להעברת תמיסות בודדות לבארות בודדות, וביחידת AP 96 קבועה שניתן להעביר באמצעותה 96 תמיסות זהות בבת אחת לפלטת 96 בארות; לאחר מכן סדר את משטח העבודה של מערכת הטיפול בנוזלים.מערך זה כולל פלטת תגובה אחת עם 96 בארות עמוקות, מכסה של קופסת טיפים המכיל מים, מעמד אנזימים המכיל את האנזימים בשפרויות eend orph בנפח 1.5 milliliter, ומספר קופסאות טיפים מלאות במיקומי העמדה כפי שהוגדרו בהגדרות המכשיר. לאחר שהעמדה מוכנה, יש לבדוק את התוכנית לאיתור שגיאות. הפעל את ה-Beckman fx.זרוע ה-SPAN eight תשאב תחילה 200 µL של תרחיף הביומסה לכל באער של לוחיות תגובה עמוקות בעלות 96 באערים. לאחר מכן, יחידת ה-SPAN eight תחלק אנזימים לכל אחד מהבאערים, בהתאם לגיליון הנתונים שיובע לתוכנת ה-Biome FX. עם השלמת השאיבה, יש להוציא את לוחית ה-96 באערים העמוקים מהמשטח.אטמו את הפלטה באמצעות מדבקת איטום או מכסה. לאחר מכן, הפכו את הפלטה והקישו עליה פעם או פעמיים כדי לשבור את מתח הפנים. הניחו את הפלטה בתנור ההיברידיזציה למשך 48 שעות לאחר הצנטריפוגה של הדגירה.את פלטת 96 הבארים העמוקה למשך שלוש דקות ב-1,500 ×g בצנטריפוגה בעלת סלים נדנדים בזמן שהפלטה מסתובבת. תכנת את ה-Beckman FX להשתמש ב-AP 96 pod כדי להעביר בפיפט 100 µL מכל באר לפלטת 96 בארים רגילה. לאחר הסבוב, הנח את הפלטה במכשיר והפעל את הפעולה של ההעברה בפיפט.עם סיום הפעולה של הפפיטציה, דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 100 °C למשך 10 דקות על מחמם פלטות כדי לנטרל את האנזימים, ולאחר מכן סבבו את הפלטה בצנטריפוגה במהירות של 1,500 ×g למשך 30 שניות. עבור מדידות GLC, הוסיפו תחילה 192 µL של ריאגנט glucose oxidase peroxidase, באמצעות תוכנית שנכתבה עבור ה-AP 96 pod של ה-Beckman fx.לאחר מכן, השתמש ב-AP 96 pod כדי להעביר 12 µL מהדגימה לתוך פלטת 96 בארות רגילה. דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 50 °C למשך 20 דקות ומדדו את הבליעה באורך גל של 510 nm באמצעות קורא מיקרופלטות. עבור מדידות xlo, הוסיפו את ריאגנטים הבדיקה בהתאם להוראות הערכה.לאחר מכן, השתמשו ב-AP 96 pod כדי להעביר 4 µL מכל באר לצלחות של 384 בארות ומדדו את הבליעה ב-340 nm. בצעו ניתוח נתונים כפי שמתואר במסמך המלווה באמצעות תוכנת design expert. חמישה סובסטרטים ושלושה טיפולים מקדימים הושוו תחת תנאים דומים של טחינה לגודל חלקיקים של 0.5 mm, טעינת אנזימים של 15 mg לגרם גלוקאן ותנאי הידרוליזה.48 שעות ב-50 degrees Celsius כפי שניתן לראות כאן. קיימים הבדלים בולטים בין חומרי הגלם ובין טיפולי הקדם. ברור כי תערובת האנזימים accelerate 1000 לבדה אינה יכולה להתמודד עם כל השונות שנצפתה בטיפולי הקדם ובחומרי הגלם.ניסוי זה משווה בין תירס לתנורים שעבר טיפול מקדים ב-FEX, המכונה A-F-E-X-C-S, תירס לתנורים שעבר טיפול מקדים בפרוקסיד בסיסי, A-H-P-C-S, ודגנים מזוקקים מיובשים שעברו טיפול מקדים ב-FEX, A-F-E-X-D-D-G. המספרים בחלק העליון של העמודות מייצגים את תשואת הגלוקוז כאחוז מהגלוקוז הכולל בדגימת הביומסה. שימו לב כי הרכב תערובות האנזימים שונה באופן משמעותי בהתאם לטיפול המקדים ולסובסטרט הביומסה.למרות שהשימוש העיקרי ב-gem plat הוא ליצירת תערובות סינתטיות של אנזימים טהורים, ניתן להשתמש בו גם להפקת תערובות אופטימליות של תכשירי אנזימים מסחריים. פאנל A מציג תרשים זרימה של ארבעה אנזימים שעברו אופטימיזציה לשחרור גלוקוז מ-A-F-E-X-D-D-G; פאנל B מציג את התנובתיים שהתקבלו בשימוש בתערובת אופטימלית זו בהשוואה לשלושה תכשירי אנזימים אחרים. הדגמנו כעת את השימוש ב-gen plat לסיוע בפירוק ביומסה באמצעות אנזימים טהורים בודדים.לכל אנזים יש פעילות קטליטית ספציפית התורמת לפירוק מלא של דפנות תאי צמחים לסוכרים בודדים. עם זאת, אין צורך לדעת את הפעילות הקטליטית המדויקת של אנזים כדי להעריך את חשיבותו בפירוק הביומסה. באמצעות Gen pla, ידיעה אילו אנזימים הם חשובים ובאילו פרופורציות היא קריטית להנחיית תהליכי הביו-פרוספקטינג.עבור אנזימים חדשים להנדסת חלבונים ולפיתוח אורגניזמים לעיבוד ביולוגי מאוחד, לעיתים התוצאות הן מפתיעות. לדוגמה, מצאנו כי לשחרור גלוקוז מ-Conover, שילוב של שתי Xin ais שאינן קשורות עדיף על פני כל Xin לבדה. מצאנו גם ש-manase טוב יותר הוא חשוב לשחרור גלוקוז מ-dry distiller grain.אף על פי שחומר זה בעל תכולת בטרמן נמוכה, שיטה זו תסלול את הדרך עבור חוקרים לפתח תערובות אנזימים טובות עוד יותר עבור מגוון תנאים. אין צורך לדעת מהי הפעילות האנזימטית של חלבון מסוים כדי לבחון את תרומתו לפירוק ליגנוצלולוז.

genplat-an-automated-platform-for-biomass-enzyme-discovery-cocktail

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פרוטוקול זה מתאר מסך התפוקה גבוהה לפעילות cellulolytic מספריית metagenomic לידי ביטוי Escherichia coli. המסך הוא פתרון מבוסס מאוד אוטומטיות, ומשתמש אחד סיר כימיה 384 microplates היטב עם readout הסופי כמו מדידת ספיגת.

מסך התפוקה גבוהה עבור Biomining פעילות cellulase מספריות Metagenomic

שיטה פשוטה, מהירה לקביעת פוטנציאל saccharification של מספר גדול של דגימות ביומסה הצמח מתואר. הפלטפורמה אוטומטיים לניתוח זה כרוך בהכנה של ביומסה הצמח לניתוח ב 96 צלחות היטב את הביצועים הבאים של הידרוליזה המקדים, וכימות של סוכרים שוחרר.

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת תפוקה גבוהה לבדיקת אנזימים פעילים בפחמימות באמצעות מצעי הידרוג'ל פולימריים כרומוגניים בלתי מסיסים. האנזים מפרק מצעים אלה למוצר צבעוני מסיס שניתן לכמת על ידי מדידת עוצמת הצבע של המוצר.

בדיקת סינון אנזימים על בסיס הידרוג'ל פולימרי כרומוגני: שיטה בעלת תפוקה גבוהה לסינון האנזימים הפעילים בפחמימות באמצעות מצעים סינתטיים

סרטון זה מדגים בדיקה לסינון אנזימים יעילים בפירוק רב-סוכרים מורכבים בביומסה צמחית באמצעות ביומסה כרומוגנית בלתי מסיסה או ICB. האנזימים מבצעים הידרוליזה של ICB כדי לשחרר אוליגוסכרידים מסיסים הקשורים לצבע, ופעילות האנזים מוערכת על ידי ניתוח קולורימטרי של תוצר התגובה.

בדיקת אנזימים כרומוגנית בלתי מסיסה מבוססת ביומסה: בדיקה להערכת פעילות הפירוק של אנזימים מפרקים ביומסה צמחית

קומפלקסי חלבונים לזרז תפקודים תאיים מרכזיים. אפיון פונקציונלי והמבני מפורט של מתחמים רבים חיוניים דורש ייצור רקומביננטי. MultiBac הוא מערכת תא baculovirus / חרק מותאם במיוחד לביטוי חלבונים אוקריוטים והמתחמים שלהם. MultiBac יושם כפלטפורמת גישה פתוחה, ונהלי עבודה סטנדרטיים שפותחו על מנת למקסם את התועלת שלו.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

עבודה זו מציגה שיטה לסריקת תפוקה גבוהה באמצעות מערכת סינון אנזימים גנטית אוניברסלית שניתן ליישם באופן תיאורטי על למעלה מ-200 אנזימים. כאן, מערכת הסינון היחידה מזהה שלושה אנזימים שונים (ליפאז, צלולאז ופוספטאז אלקליין) פשוט על ידי שינוי הסובסטרט המשמש (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ופניל פוספט).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

מתואר מבחן תפוקה גבוהה לבדיקת אנזימים. ערכת בדיקה מוכנה לשימוש מרובה זו מורכבת ממצעי Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) שנבחרו מראש ומצעי Chromogenic B iomass (ICB) מורכביםI בלתי מסיסים. אנזימי המטרה הם אנדו-אנזימים ופרוטאזות מפרקים רב-סוכרים.

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

כתב יד זה מתאר גישה כללית לעיצוב בהתאמה אישית של טיפוח מיקרוביאלי מדיה. זה מופעל על-ידי זרימת עבודה איטרטיבי שילוב Kriging ניסיוני microbioreactor ועיצוב טכנולוגיה מבוססת על תפוקת טיפוח מספיקות, אשר נתמך על ידי מעבדת רובוטיקה כדי לשפר את האמינות ואת מהירות בנוזל טיפול מדיה הכנה.

פרוטוקול גנרי עבור אופטימיזציה של ייצור החלבון Heterologous באמצעות טכנולוגיית Microbioreactor אוטומטיות

כאן אנו מציגים קל להשתמש בפרוטוקולים להפקת וטיהור diterpenoid מטבוליטים דרך הביטוי קומבינטורית של אנזימים ביולוגיים ב Es chia coli או טבק benthamiana, ואחריו מוצר כרומאטוגרפי טיהור. מטבוליטים המתקבלים מתאימים למחקרים שונים כולל אפיון מבנה מולקולרי, מחקרים פונקציונלים וביואקטיביים.

גישה ניתנת להתאמה אישית לייצור אנזימטי וטיהור המוצרים הטבעיים של Diterpenoid

פרוטוקול זה מספק שיטה לאופטימיזציה גלובלית שיטתית של חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית באמצעות יצירה והערכה של ספריות גנטיות בסיוע אוטומציה. זה משולב עם מתודולוגיות תכנון ניסוי כדי לייעל את הניסויים ולאפשר בחירת רכיבים גנטיים כדי לכוונן את החיישנים הביולוגיים לתוצאות תכנון ספציפיות.

דגימה יעילה של מרחב תכנון חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית מתאפשרת עם תכנון ניסויים וזרימת עבודה של אוטומציה

פרוטוקול זה מציג תהליך סינון סטנדרטי עם תפוקה גבוהה עבור מיקרואורגניזמים תעשייתיים. הוא כולל בניית ספריית מוטנטים באמצעות מוטגנזה של ARTP, ביצוע סקר חיובי לטיפות באמצעות מיקרופלואידיקה אוטומטית, ולאחר מכן אימות התוצאות. אמינות זרימת העבודה אושרה על ידי סינון זני B. coagulans בעלי תפוקה גבוהה.

סקר מהיר של מוטנטים של חיידקים קואגולנס המופרזים בחומצה L-לקטית באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית של טיפות

למד אופטימיזציה של קוקטיילים אנזימטיים לפירוק ביומסה ליגנוצלולוזית לסוכרים תסיסים באמצעות פלטפורמת GENPLAT האוטומטית. השיטה משפרת את יעילות ייצור הביודלק.

GENPLAT: פלטפורמת Automated Discovery עבור ביומסה אנזימים ואופטימיזציה קוקטייל

גלה סרטונים נוספים