הקמת Epstein-Barr Virus צמיחה הפך שורות תאים Lymphoblastoid

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק קווי תאי לימפובלסטים שעברו טרנספורמציה על ידי נגיף אפשטיין-באר (Epstein-Barr virus transformed Lymphoblasts) או LCL מתאי B אנושיים. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד תאים חד-גרעיניים של דם היקפי (peripheral blood mononuclear cells) מדם אנושי.

בשלב הבא, התאים מודבקים ב-Epstein-Barr virus בנוכחות של FK 506 וחומרים אימונוסופרסיביים. שלושה עד ארבעה ימים לאחר ההדבקה ב-Epstein-Barr virus, מופיעה תת-אוכלוסייה של תאים המסומנת כ-CD 23 high ו-CD 58 positive, אשר צפויה לעבור פרוליפרציה. ניתן לספור תאי CD 23 high ו-CD 58 positive באמצעות ציטומטריה זרימה כמנבא לתוצאה מוצלחת. ניתן לזהות תאים בתהליך פרוליפרציה, באופן מיקרוסקופי ומקרוסקופי, על ידי צברי תאי lymphoblasts שנוצרים בתרביות תאים שעברו טרנספורמציה בהצלחה.

השלב הסופי הוא הרחבת קווי תאי לימפובלסטים לצורך שימור בהקפאה. במעבדה שלי, אנו מייצרים קווי תאי לימפובלסטים, או LCLs, כדי להבין את האינטראקציות בין המאכסן לבין נגיף Epstein-Barr. קווי תאי לימפובלסטים מעוררים עניין רב וכללי בקהילה המדעית, במיוחד בקרב וירולוגים, אימונולוגים וביולוגים של הסרטן.

כעמית פוסט-דוקטורט במעבדת Macintosh, אדגים את הפרוצדורה להפקת שורות תאי לימפובלסטים. לאחר דגימת 10 milliliters של דם מתורם, העבירו את הדם ההפריניז לתוך מבחנה קונית של 50 milliliter ולאחר מכן דללו אותו ביחס של 1:2. הוסיפו למבחנה 20 milliliters של PBS בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הניחו מתחת לדם המדולל 15 milliliters של תמיסת הפרדת לימפוציטים מסוג FICO HIA. כעת, סובבו את הדם בcenterY של 225 ×g ללא בלימה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי ליצור גרדיאנט.

בשלב הבא, הסר את שכבת ה-buffy coat והעבר אותה למבחנה קונית חדשה של 50 מיליליטר. השלם את הנפח ל-50 מיליליטר באמצעות PBS ולאחר מכן השקע את התאים ב-600 ×g למשך 10 דקות. שפוך את הנוזל העליון, השהה מחדש את המשקע ב-50 מיליליטר של PBS, ולאחר מכן שטוף את התאים פעמיים נוספות תחת אותם תנאים.

כעת השביה מחדש את התאים ב-1 mL של RPMI מלא. אני משתמש ב-5 µL של תאים כדי לבצע דילול של 1:10 ב-trypan blue, וכדי לספור את התאים החיים באמצעות המוציטומטר, ולאחר מכן משתמש ב-RPMI מלא כדי להתאים את הנפח כך שיתקבל ריכוז תאים של 2×10⁶ תאים ל-mL, ומעביר את התאים לבקבוק תרבית רקמה של 25 cm².

כדי להכין את התאים להדבקה בנגיף Epstein-Barr, הוסף FK 506 לבקבוק תרבית הרקמה עד לריכוז סופי של 20 µM. לאחר מכן, הנח את הבקבוק באינקובטור עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. כאשר האינקובציה של התאים כמעט מסתיימת, הפשר במהירות מנה (aliquot) של נגיף Epstein-Barr, שהופק מתאי B 95 8. לאחר מכן, הוצא את הבקבוק מהאינקובטור והוסף את נגיף Epstein-Barr לתאים בדילול של 1:10. כעת נער את הבקבוק כדי לערבב את נגיף Epstein-Barr בתמיסה, ולאחר מכן הנח את הבקבוק במצב זקוף באינקובטור כאשר הפקק סגור, אך מעט רפוי אם נעשה שימוש בבקבוק ללא פילטר (non vented), למשך שבועיים עד שלושה שבועות לפני הרחבת התרבית לצורך שימור בהקפאה (cryo-preservation).

שבוע לאחר ה-eps, הדבקה בנגיף Epstein Barr, ניתן להבחין בצברי תאים במיקרוסקופיה של אור, כפי שניתן לראות בדמות מייצגת זו של צברים מיקרוסקופיים מוקדמים. ככל שהזמן עובר, הצברים המיקרוסקופיים גדלים, כך שניתן להבחין בגושים באופן מאקרוסקופי בבקבוק, כפי שניתן לראות בדמות זו שבה ניתן להבחין בצברים גדולים יותר של LCL בעת הזנת התאים, ולהכפיל את נפח המצע התומך בבקבוק התרבית ביום 12. כאשר מצע התרבית הופך לצהוב, בדרך כלל פעם בשבוע, זהו בדרך כלל הזמן להזין את התאים כדי להרחיב את אוכלוסיית התאים ולהגדיל את נפח התרבית פי שניים עד שלושה.

באמצעות RPMI מלא, הרחיבו את התרבית ל-70 עד 100 מיליליטר בבקבוק ריבוע של 75 סנטימטר במהלך השבועות הבאים כדי להפיק תאים להקפאה (cryopreservation); תוצאה מוצלחת נחזית על ידי נוכחות של תאים עם CD 23 ו-CD 58 חיובי גבוה, כפי שניתן לראות בתרשים פיזור זה; כ-2% עד 3% מהתאים החיים ביום השלישי עד הרביעי לאחר חשיפה ל-Epstein-Barr virus בעלי פרופיל זה; תתי-אוכלוסיות אחרות של תאים CD 23 חיוביים, CD 23 שליליים, CD 58 חיוביים ו-CD 58 שליליים שנצפו לאחר חשיפה ל-Epstein-Barr virus מראות שגגור מינימלי, ותאים שאינם מזוהמים או תאים שזוהמו עם זן של Epstein-Barr virus שאינו גורם לאימורטליזציה אינם מפגינים CD 23 גבוה.

תאים חיוביים ל-CD 58. ניתן להדמיא את התאים גם באמצעות מיקרוסקופיה של אור. כפי שצוין, בתוך שבוע מזיהום בנגיף Epstein-Barr, ניתן לראות בבקבוק תאים קטנים דמויי זכוכית תחת מיקרוסקופיה של אור.

ככל שהזמן חולף והתאים מתפתחים ל-LCL, הצבירים המיקרוסקופיים הופכים לגדולים יותר, כך שגושים נראים באופן מאקרוסקופי בתוך הבקבוק. מצוין. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים תאי דם לבנים מונונוקלאריים (PBMCs) מדם אנושי ומייצרים שורות תאים של לימפובלסטים שעברו טרנספורמציה על ידי נגיף Epstein-Barr מתאי B אנושיים, בעוד שיצירת שורות תאים של לימפובלסטים תוארה על ידי מעבדות אחרות.

היתרון של הפרוטוקול שלנו הוא שהוא מספק לחוקרים שיטה לניבוי תוצאה מוצלחת כבר שלושה עד ארבעה ימים לאחר הדבקת תאי B בנגיף Epstein-Barr.